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Jornal de Pediatria

Print version ISSN 0021-7557

J. Pediatr. (Rio J.) vol.82 no.5 Porto Alegre Sept./Oct. 2006

http://dx.doi.org/10.1590/S0021-75572006000600012 

ARTIGO ORIGINAL

 

Colonização microbiana precoce de pacientes identificados por triagem neonatal para fibrose cística, com ênfase em Staphylococcus aureus

 

 

Helena A. P. H. M. SouzaI; Keite S. NogueiraI; Adriana P. MatosI; Ricardo P. VieiraII; Carlos A. RiediI; Nelson A. RosárioIII; Flávio Q. TellesIII; Libera M. Dalla Costa III

IMestre, Universidade Federal do Paraná (UFPR), Curitiba, PR
IIProfessor substituto,UFPR, Curitiba, PR
IIIDoutor, UFPR, Curitiba, PR

Correspondência

 

 


RESUMO

OBJETIVOS: Avaliar prospectivamente a colonização bacteriana de pacientes com fibrose cística identificados por triagem neonatal. Avaliar a suscetibilidade a antimicrobianos e caracterizar molecularmente as cepas de Staphylococcus aureus isoladas da orofaringe dos pacientes no período do estudo.
MÉTODOS: Foram estudados 25 pacientes com fibrose cística, identificados por tripsina imunorreativa e com diagnóstico confirmado por duas ou mais provas de suor, atendidos regularmente no ambulatório de fibrose cística do Hospital de Clínicas da Universidade Federal do Paraná. Foram coletadas amostras de orofaringe com swab e cultivadas por métodos rotineiros; as colônias bacterianas foram identificadas fenotipicamente e testadas quanto à suscetibilidade a antimicrobianos. Os isolados de S. aureus foram submetidos a tipagem molecular por eletroforese em campo pulsado.
RESULTADOS: De um total de 234 amostras de orofaringe, S. aureus foi isolado em maior número (76% dos pacientes, 42% das amostras), seguido de Pseudomonas aeruginosa (36% dos pacientes, 16% das amostras) e Haemophilus spp. (76% dos pacientes; 19% das amostras). Dos 19 pacientes colonizados com S. aureus, foram obtidos 73 isolados, 18 oxacilina-resistentes (24,6%), isolados de dois pacientes, com perfis eletroforéticos idênticos ao do clone brasileiro. Os demais isolados oxacilina-sensíveis distribuíram-se entre 18 perfis eletroforéticos distintos.
CONCLUSÃO: Observou-se uma maior prevalência de S. aureus, com isolamento mais precoce em relação aos outros patógenos pesquisados. Os isolados multissensíveis distribuíram-se em clones distintos, caracterizando a não transmissibilidade entre as cepas comunitárias. Os S. aureus resistentes a oxacilina isolados apresentaram perfis eletroforéticos idênticos, provavelmente adquiridos no ambiente hospitalar. P. aeruginosa foi pouco freqüente na população estudada.

Palavras-chave: Fribose cística, microbiologia, epidemiologia.


 

 

Introdução

Fibrose cística (FC) é a mais freqüente doença genética fatal, acometendo principalmente indivíduos caucasóides1. É causada por mutações no gene CFTR, provocando alterações na viscosidade do muco das vias aéreas e induzindo à infecção endobrônquica crônica, que será responsável pela evolução fatal de praticamente todos os pacientes2. A principal causa de óbito nessa doença é a infecção e inflamação provocadas por Pseudomonas aeruginosa, o agente infeccioso mais comum1. Alguns autores têm levantado a hipótese de que a infecção por Staphylococcus aureus proporciona um milieu favorável à aderência e instalação de P. aeruginosa nas vias aéreas dos pacientes com FC3. Entretanto, não há estudos longitudinais publicados no Brasil sobre a colonização e dinâmica da infecção por S. aureus nessa população.

A inclusão da pesquisa da doença no programa de triagem neonatal (teste do pezinho) no estado do Paraná em setembro de 2001 identificou diversos casos que provavelmente seriam diagnosticados tardiamente, após o insucesso do tratamento de infecções pulmonares recorrentes. A partir do diagnóstico precoce da FC, pode-se instituir tratamento adequado e, com isso, melhorar o prognóstico dos pacientes4. Este estudo foi idealizado com o objetivo de avaliar a evolução da colonização microbiana precoce em pacientes com FC diagnosticados pela triagem neonatal, em especial para verificar o potencial de transmissibilidade de S. aureus entre os pacientes.

 

Métodos

O trabalho teve a aprovação do comitê de ética em pesquisa do Hospital de Clínicas da Universidade Federal do Paraná (HC-UFPR). O HC e todos os responsáveis pelas crianças concordaram em participar. Foram coletados swabs de faringe posterior das crianças com FC, identificadas pela triagem neonatal (tripsina imunorreativa) e com confirmação diagnóstica por duas ou mais provas de suor5. Foram incluídos no estudo 25 pacientes atendidos regularmente no ambulatório de fibrose cística do HC-UFPR, entre agosto de 2003 e dezembro de 2004. As coletas ocorreram com a freqüência de atendimento estabelecida de acordo com a evolução clínica de cada paciente. Os pacientes analisados tinham média da idade de 14,3 meses para os meninos e 15,5 meses para as meninas. Para avaliação estatística dos dados, foi realizada análise descritiva (cálculo de média, mediana e intervalo de confiança).

O material biológico (swab) foi transportado em tubos com 1 mL de tampão PBS contendo 0,1% de gelatina bacteriológica, em caixa isotérmica6. Na chegada do material ao laboratório, as amostras foram homogeneizadas em agitador tipo vórtex por 30 s e inoculadas com alça calibrada de 10 µL (0,01 mL) em três placas com diferentes meios de cultura, ágar-sangue (AS), ágar chocolate suplementado (ACH) e ágar MacConkey (MC), de maneira a propiciar avaliação semiquantitativa do crescimento bacteriano7. As placas foram incubadas à temperatura e atmosfera usuais.

As colônias suspeitas das bactérias classicamente isoladas nesta amostra de pacientes, como S. aureus, P. aeruginosa e H. influenzae, foram identificadas utilizando os métodos de rotina adotados pela Seção de Bacteriologia do Serviço de Análises Clínicas do HC-UFPR8,9. Os mesmos isolados foram submetidos a teste de suscetibilidade pelo método clássico de disco-difusão (Kirby Bauer)10. As amostras bacterianas de interesse foram suspensas em solução para criopreservação (caldo infuso de cérebro e coração com 15% de glicerol) e armazenadas a -80 ºC para testes complementares que seriam posteriormente realizados em conjunto11. Os testes confirmatórios para identificação definitiva de S. aureus após reativação dos isolados armazenados incluíram: hemólise em ágar-sangue de carneiro, prova da coagulase ligada, crescimento em ágar contendo 7,5% de cloreto de sódio, fermentação do manitol, pigmentação das colônias e atividade da desoxirribonuclease, seguindo técnicas padronizadas12.

O teste de suscetibilidade para verificação da concentração inibitória mínima (CIM) de todos os isolados de S. aureus armazenados foi realizado pelo método de diluição em ágar, frente a diferentes concentrações de ciprofloxacino, eritromicina, gentamicina, oxacilina, sulfametoxazol-trimetoprim e vancomicina13. Sessenta e cinco isolados obtidos com mais de 15 dias de intervalo para um mesmo paciente foram encaminhados ao Laboratório Especial de Microbiologia Clínica (LEMC), em São Paulo, para tipagem molecular por eletroforese em campo pulsado (PFGE). Para a corrida eletroforética, foi utilizado gel de agarose ultrapura a 1%, voltagem de 6,0 volts/cm, pulso inicial de 5,0 s e final de 60 s e tempo de corrida de 23 horas. A técnica consiste na análise do polimorfismo de fragmentos de DNA total após digestão por endonucleases que reconhecem sítios infreqüentes no genoma bacteriano14.

 

Resultados

Foram coletadas 234 amostras de orofaringe de um total de 25 crianças (48% do sexo masculino e 52% do sexo feminino), com média de 9,3 amostras por paciente. A freqüência das consultas variou de 15 dias a 3 meses, com média de 53 dias. O isolamento de patógenos respiratórios (S. aureus, P. aeruginosa, H. influenzae e complexo B. cepacia) ocorreu em 100 amostras (42,73%) obtidas dos 25 pacientes, conforme apresentado na Tabela 1.

 

 

O primeiro patógeno isolado foi S. aureus em 18 pacientes (72%) e H. influenzae em 10 pacientes (40%); em quatro pacientes (16%), esses dois patógenos foram isolados concomitantemente na primeira cultura. P. aeruginosa foi o primeiro patógeno a ser isolado em somente dois pacientes (8%) e, em um deles, foi isolado concomitantemente S. aureus. O tempo médio decorrido até o primeiro isolamento de S. aureus foi de 214 dias, com intervalo de confiança de 120 a 309 dias. Para o primeiro isolamento de P. aeruginosa, decorreu o tempo médio de 358 dias, com intervalo de confiança de 164 a 553 dias.

Dos 19 pacientes colonizados com S. aureus, obteve-se 73 isolados, dos quais 18 (24,6%) eram oxacilina-resistentes (MRSA), obtidos de três pacientes; em dois deles, a maioria dos isolados (13/14 e 4/6) tinha essa característica e, no outro paciente, em apenas um de três isolados. A maior taxa de amostras positivas por paciente foi verificada com essa bactéria (37,23%, com variação 10 a 82,35%).

Foram obtidos 15 isolados de nove pacientes colonizados por P. aeruginosa, todos multissensíveis e não-mucóides. Do total de pacientes, seis foram anteriormente colonizados com S. aureus, e dois com outros patógenos (um com H. influenzae e outro com Streptococcus pneumoniae). Nenhum paciente apresentou colonização persistente por P. aeruginosa. Nas amostras positivas para essa bactéria, havia concomitantemente Haemophilus spp., S. aureus MRSA e oxacilina-sensíveis (MSSA), e em oito amostras não havia outro patógeno. A média de amostras positivas por paciente foi de 15,6%, com intervalo de confiança de 0 a 43,5%.

Haemophilus spp. estava presente em 19 pacientes, totalizando 33 isolados, sendo que em nenhum deles de maneira persistente. A média de amostras positivas por paciente foi de 18,7%, com intervalo de confiança de 0 a 37,5%.

Dos 16 (64%) pacientes colonizados por S. pneumoniae, foram obtidos 20 isolados, sendo que 18 foram testados para sensibilidade à penicilina. Treze foram resistentes (72%) e cinco sensíveis na prova do disco de oxacilina e confirmação com E-test para penicilina. Nenhum paciente apresentou colonização persistente por S. pneumoniae.

Obtiveram-se dois isolados do complexo B. cepacia de um mesmo paciente em amostras consecutivas. Uma vez que o objetivo do estudo não era caracterizar molecularmente todos os microrganismos isolados, não foi determinada a subespécie genômica (genomovar). O paciente era colonizado persistentemente com MRSA e não apresentou a bactéria nas culturas subseqüentes.

S. maltophilia e A. xylosoxidans não foram isolados nas amostras estudadas.

Em 69 isolados de S. aureus, analisou-se o perfil bioquímico (biotipo) e o perfil de suscetibilidade a antimicrobianos (antibiotipo). De 18 pacientes colonizados, quatro tinham apenas um isolado cada e, portanto, foram excluídos desta análise preliminar. Dos demais, 10 apresentaram mais da metade dos seus isolados com biotipos e antibiotipos sugerindo pertencerem ao mesmo clone, e outros quatro tinham isolados com perfis diferentes, seja quanto ao biotipo ou ao antibiotipo.

A determinação das CIM dos antibióticos testados frente aos isolados de S. aureus demonstrou que todos apresentaram elevada potência, com CIM50 abaixo dos pontos de corte para sensibilidade. Vancomicina foi o mais ativo, com CIM90 abaixo desse valor, enquanto os outros antimicrobianos testados apresentaram valores acima do ponto de corte para resistência (Tabela 2). Analisando-se os resultados, vancomicina mostrou-se ativo contra todas as cepas testadas (100%), enquanto os outros agentes apresentaram suscetibilidades variando de 64,2 a 76,1%.

 

 

Os 65 isolados de S. aureus submetidos a tipagem molecular por PFGE foram analisados segundo os critérios recomendados por Tenover et al.15, apresentando 21 perfis eletroforéticos distintos. Os isolados de MRSA foram comparados com o clone brasileiro de MRSA na mesma análise (Figura 1). Os MRSA obtidos de dois pacientes (10 de um paciente e três do outro) apresentaram perfil eletroforético idêntico ao do clone brasileiro. Um outro isolado de MRSA, distinto dos pacientes já citados, foi obtido em somente uma amostra de um terceiro paciente, sendo desconsiderado. Os demais isolados, todos MSSA, distribuíram-se entre 18 perfis eletroforéticos (Figura 2).

 

 

 

 

Discussão

Os pulmões das crianças fibrocísticas são freqüentemente colonizados ou infectados na primeira infância por bactérias como S. aureus e H. influenzae, as quais podem danificar o epitélio, levando ao aumento da aderência e substituição definitiva por P. aeruginosa1. Esses dados corroboram a evolução da colonização bacteriana observada na amostra de pacientes analisada.

Um estudo envolvendo 639 pacientes de FC, menores de 18 anos de idade e registrados na Europa demonstrou que a profilaxia antiestafilocócica contínua aumentou o risco de colonização por P. aeruginosa, quando comparados com indivíduos que receberam terapia antibiótica contínua, intermitente ou nenhuma antibioticoterapia contra S. aureus16. Um estudo multicêntrico, duplo-cego, randomizado e controlado por placebo concluiu que, apesar de o uso de profilaxia prolongada com cefalexina ter adiado a aquisição de S. aureus, por outro lado aumentou a colonização com P. aeruginosa e não apresentou benefício clinicamente significativo em crianças pequenas com FC17. Entretanto, a colonização crônica das vias aéreas na FC por P. aeruginosa é reduzida em regiões onde a terapia antiestafilocócica é administrada estritamente com base na necessidade, ao invés de profilaticamente18. Ainda não foram publicados estudos que demonstrem o efeito positivo do tratamento anti-S. aureus quando isolado em culturas de orofaringe.

A amostra de pacientes acompanhada neste estudo compreende crianças na primeira infância, variando de 1 mês a 3 anos de idade. O isolamento de S. aureus em 19 dos 25 pacientes (76% do total) e Haemophilus spp. na mesma proporção de indivíduos, embora em um número menor de amostras por paciente (18,7 contra 41,8% dos pacientes com S. aureus), está de acordo com os dados internacionais. Os pacientes que apresentavam S. aureus nas culturas foram tratados com dois antibióticos, por um período de 3 semanas, observando-se os resultados do antibiograma.

Antes do advento da antibioticoterapia, a maioria dos pacientes evoluía a óbito por infecção por S. aureus19. Atualmente, P. aeruginosa é o principal agente responsável pela infecção crônica, acometendo praticamente todos os pacientes20. A persistência de S. aureus há muito vem sendo relatada em infecções crônicas de pacientes jovens com FC21. Embora tendo avaliado uma população diferente quanto à idade e ao tipo de amostras coletadas, este estudo pode ser comparado ao de Kahl et al., que identificaram clones únicos e persistentes de S. aureus na maioria dos pacientes estudados22. A análise molecular realizada demonstrou que os pacientes colonizados por MSSA conservaram o mesmo clone durante todo o período, e que os clones eram exclusivos de cada paciente, caracterizando a não transmissibilidade das cepas.

O significado clínico da infecção por MRSA na FC ainda não foi estabelecido. Um estudo analisou crianças com a doença durante um período de 7 anos, cujas culturas de secreções respiratórias revelaram a presença de MRSA. Os autores concluíram que a infecção por esse tipo de bactéria em crianças com FC não afeta significativamente a função respiratória, mas tem um efeito adverso no crescimento. Os pacientes requerem antibióticos intravenosos em quantidade significativamente maior e têm maiores alterações radiológicas que os controles23. Neste estudo, apenas duas crianças apresentaram infecção persistente com MRSA. Os pacientes apresentaram curvas ponderais constantemente abaixo do percentil 2,5, dados semelhantes aos de Miall et al.23, embora nossa amostra tenha sido menor (dois pacientes versus 14 pacientes no estudo citado). Os dois pacientes com MRSA foram internados várias vezes desde o nascimento. Um apresentava cianose e saturação transcutânea de hemoglobina diminuída durante todo o período de seguimento, enquanto o outro teve íleo meconial, necessitando de tratamento cirúrgico logo nos primeiros meses de vida.

Os isolados de P. aeruginosa obtidos foram distintos das cepas geralmente observadas em pacientes fibrocísticos: sensíveis à maioria dos antimicrobianos testados e não-mucóides. Burns et al. obtiveram resultados semelhantes em um estudo longitudinal abordando as alterações fenotípicas em amostras de P. aeruginosa isoladas em uma coorte de 40 pacientes durante os 3 primeiros anos de vida24.

Apesar do papel secundário de S. pneumoniae na infecção de pacientes com FC, a elevada proporção detectada de isolados resistentes à penicilina é indicativa do processo de seleção de mutantes pelo uso extensivo de antibióticos. Nenhum paciente foi persistentemente colonizado por S. pneumoniae, porém a alta prevalência do patógeno nas amostras cultivadas reforça a indicação da vacina para esse grupo de crianças.

Bactérias emergentes, como S. maltophilia e A. xylosoxidans, não foram isoladas na população avaliada. Organismos pertencentes ao complexo B. cepacia foram pouco freqüentes.

Os resultados observados permitiram demonstrar que S. aureus foi o primeiro patógeno isolado, a bactéria de maior ocorrência e com maior número de amostras positivas por paciente. Os isolados de MSSA testados mostraram-se sensíveis a ciprofloxacino, eritromicina, gentamicina, oxacilina, sulfametoxazol-trimetoprim e vancomicina, porém o agente mais ativo foi vancomicina, com 100% de sensibilidade. A freqüência de MRSA é preocupante, em razão da possibilidade de disseminação a outros pacientes com FC. As cepas de MRSA foram provavelmente adquiridas por infecção cruzada no ambiente hospitalar, visto que apresentaram perfil eletroforético idêntico ao do clone descrito por Sader, em 1994, e que vem sendo detectado na maioria dos hospitais brasileiros25. As cepas de S. aureus sensíveis eram policlonais e exclusivas de cada paciente, indicando que provavelmente foram adquiridas dentro do círculo social próprio. Os isolados de P. aeruginosa, não-persistentes e com fenótipos não-mucóides e multissensíveis, pressupõem que a infecção é intermitente e não crônica. Uma menor sensibilidade das culturas de orofaringe no isolamento da bactéria pode ter sido responsável pelo baixo índice de isolamento observado, enfatizando a necessidade de se desenvolver técnicas mais sensíveis de detecção, como a pesquisa de anticorpos específicos26 ou a reação em cadeia da polimerase27.

 

Agradecimentos

Ao Dr. Grégor P. Chermikoski Santos, do Departamento de Pediatria da UFPR, pelos conhecimentos compartilhados durante o estudo.

Ao Dr. Ehrenfried O. Wittig e à Dra. Mouseline T. Domingos, do Laboratório de Pesquisas da Fundação Ecumênica de Proteção ao Excepcional (FEPE/PR), pelas análises realizadas.

Ao LEMC, pela presteza nas análises moleculares realizadas.

 

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Correspondência:
Helena A. P. Homem de Mello de Souza
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Fontes financiadoras: Núcleo de Estudos da Bacteriologia Clínica de Curitiba (NEBaC), United Medial e Newprov Produtos para Laboratório LTDA.

Artigo submetido em 27.10.05, aceito em 12.07.06.