O uso de células-tronco na asfixia perinatal: do laboratório à prática clínica

Resumos

OBJECTIVES: To present recent scientific evidence on the effects of stem cell transplantation in animal models of neonatal hypoxic-ischemic brain injury and address the translational relevance of cell therapy for clinical application in this context. SOURCES: The PubMed and Scopus databases were used to select articles. The selection criterion was the specificity of articles regarding the subject studied, preferably articles published from 2000 onward. We also reviewed classic articles from previous years that were applicable to this review. SUMMARY OF THE FINDINGS: Stem cells from different exogenous sources may exhibit neuroprotective properties in experimental models of neonatal hypoxia-ischemia. In most animal experiments, the morphological and functional benefits observed were independent of neural differentiation, suggesting associated mechanisms of action, such as the release of trophic factors and inflammatory modulation. CONCLUSIONS: Based on the experimental studies analyzed, cell therapy may become a promising therapeutic approach in the treatment of children with hypoxic-ischemic encephalopathy. However, further studies are warranted to elucidate potential mechanisms of action of these cells and to define safe and effective clinical strategies.

Hypoxic-ischemic encephalopathy; stem cells; asphyxia; cell therapy

ARTIGO DE REVISÃO

O uso de células-tronco na asfixia perinatal: do laboratório à prática clínica

Simone de Paula^I; Samuel Greggio^I; Jaderson Costa DaCosta^II

^IMestre. Programa de Pós-Graduação em Saúde da Criança, Pontifícia Universidade Católica do Rio Grande do Sul (PUCRS), Porto Alegre, RS

^IIDoutor. Professor titular, Neurologia, Faculdade de Medicina, PUCRS, Porto Alegre, RS. Diretor, Instituto do Cérebro do Rio Grande do Sul (InsCer), PUCRS, Porto Alegre, RS

^{Correspondência}

RESUMO

OBJETIVOS: Apresentar evidências científicas recentes sobre os efeitos do transplante com células-tronco em modelos animais de lesão cerebral hipóxico-isquêmica neonatal e abordar os aspectos translacionais relevantes à aplicação clínica da terapia celular nesse contexto.

FONTES DOS DADOS: Para a seleção dos artigos, utilizou-se a base de dados PubMed e Scopus. O critério de seleção de artigos foi a especificidade em relação ao tema estudado, preferencialmente a partir do ano de 2000. Também foram revisados artigos clássicos de anos anteriores que se aplicavam ao propósito desta revisão.

SÍNTESE DOS DADOS: Células-tronco de diferentes fontes exógenas podem exibir propriedades neuroprotetoras em modelos experimentais de hipóxia-isquemia neonatal. Na maioria dos experimentos animais, os benefícios morfológicos e funcionais observados foram independentes da diferenciação neural, sugerindo mecanismos de ação associados, tais como a liberação de fatores tróficos e a modulação inflamatória.

CONCLUSÕES: Baseado nos estudos experimentais analisados, a terapia celular pode tornar-se uma promissora abordagem terapêutica no tratamento de crianças com encefalopatia hipóxico-isquêmica. No entanto, estudos adicionais necessitam ser realizados a fim de elucidar os possíveis mecanismos de ação dessas células e definir estratégias clínicas seguras e efetivas.

Palavras-chave: Encefalopatia hipóxico-isquêmica, células-tronco, asfixia, terapia celular.

Introdução

A lesão cerebral hipóxico-isquêmica (HI) do recém-nascido é uma das maiores causas de mortalidade e morbidade neurológica em crianças. Estatísticas sugerem uma incidência de asfixia em 2-4 por 1.000 nascimentos a termo. No Brasil, estima-se que a prevalência de asfixia neonatal seja de, aproximadamente, 2% dos nascidos vivos¹. Além disso, a taxa de mortalidade dos recém-nascidos asfixiados no período neonatal é de 20-50%, sendo que mais de 25% dos sobreviventes podem exibir incapacidades neuropsicológicas permanentes, tais como retardo mental, paralisia cerebral, epilepsia e dificuldades de aprendizagem².

A causa mais frequente da encefalopatia HI é a asfixia intraútero severa, e o principal mecanismo patogênico atribuído à sua neuropatologia é a redução do fluxo sanguíneo cerebral³. Eventos neurotóxicos associados, tais como falência energética, despolarização da membrana, liberação de aminoácidos excitatórios, acúmulo de radicais livres e apoptose ocorrem simultaneamente e contribuem para a disfunção celular e para a morte neuronal após insultos hipóxico-isquêmicos⁴.

Apesar dos avanços tecnológicos e científicos nos cuidados perinatais dos recém-nascidos de risco, o manejo clínico de crianças asfixiadas tem sido limitado à manutenção da oxigenação, ao controle da pressão sanguínea e da homeostase, ao tratamento das convulsões e ao controle da hipertensão intracraniana⁵.

Novas estratégias neuroprotetoras vêm sendo investigadas em estudos experimentais e em ensaios clínicos em decorrência da significância clínica e do impacto socioeconômico originados pelo dano cerebral neonatal. Bloqueadores de cálcio, inibidores de aminoácidos excitatórios e de radicais livres, o uso de óxido nítrico, de fatores de crescimento, neuropeptídeos e a hipotermia são algumas das abordagens terapêuticas atuais que objetivam interromper a cascata de eventos neuroquímicos iniciada pela HI⁴. Com exceção da hipotermia, que demonstra desfechos satisfatórios apenas em crianças com lesões HI moderadas, essas terapias apresentam resultados limitados⁶.

Nesse contexto, a terapia celular vem sendo explorada por ser uma atual e promissora abordagem de tratamento para doenças neurológicas graves. As células-tronco representam uma unidade natural do desenvolvimento embrionário e da reparação tecidual, sendo um subconjunto de células imaturas, indiferenciadas e não especializadas que apresentam a capacidade de autorrenovação e diferenciação em linhagens celulares específicas⁷. Tais células têm sido encontradas em todos os órgãos e tecidos pós-natais, inclusive no sistema nervoso central (SNC), previamente conhecido pela carência de progenitores celulares e de potencial regenerativo⁸. Recentes descobertas revolucionaram a biologia das células-tronco e têm demonstrado o potencial clínico dessas células em uma variedade de doenças humanas. Inicialmente usado no tratamento de doenças hematológicas malignas e distúrbios autoimunes, o transplante de células imaturas e indiferenciadas tem sido proposto atualmente como fonte potencial de novas células e de fatores tróficos para minimizar o dano celular e regenerar tecidos necróticos decorrentes de lesões no SNC⁹. Estudos experimentais demonstram que o transplante de células-tronco tem melhorado a funcionalidade em modelos experimentais de isquemia cerebral, doença de Parkinson, doença de Huntington, epilepsia e traumatismo raquimedular^10-14.

Basicamente, duas categorias de células-tronco têm sido utilizadas em estudos experimentais de HI neonatal: as células-tronco neurais, provenientes de tecido neuronal embrionário ou adulto; e as células-tronco somáticas de origem não neuronal, nas quais se destacam as provenientes do sangue da medula óssea e do cordão umbilical.

O objetivo desta revisão é apresentar o estado da arte dos estudos experimentais de terapia celular em modelo animal de HI neonatal (Tabela 1), abordando os possíveis mecanismos de ação desse recurso terapêutico e os aspectos translacionais relevantes à aplicação clínica do transplante de células-tronco na encefalopatia hipóxico-isquêmica.

Transplante de tecido neocortical fetal

Em 1996, Elsayed et al.¹⁵ realizaram o primeiro estudo sobre o uso de recursos celulares no tratamento da HI experimental. Nessa investigação, os autores avaliaram os efeitos do transplante intracerebral de um bloco de tecido neocortical fetal realizado 7 dias após a indução da HI em filhotes de ratos. Embora tenham demonstrado que os transplantes obtiveram uma implantação satisfatória em 63% dos casos, o estudo não demonstrou efeitos terapêuticos significativos sobre a atrofia cerebral. Adicionalmente, o respectivo trabalho não realizou uma avaliação funcional dos animais transplantados. Outro grupo de pesquisa também realizou transplante intracerebral de tecido neocortical fetal 3 dias após a indução da HI¹⁶. Em vez de usar um bloco tecidual, os autores utilizaram uma suspensão celular a fim de facilitar o procedimento de transplante. Os resultados demonstraram uma melhora da coordenação e assimetria motora nos animais tratados. No entanto, mesmo com a identificação de 72% dos transplantes após 10-12 semanas pós-implantação, os autores observaram ausência de restabelecimento da citoarquitetura cortical.

Transplante de células-tronco neurais

As células-tronco neurais (CTN) são células com capacidade de autorrenovação e potencialidade restrita para gerar células de linhagens neuronais e gliais. Tais células podem ser isoladas de diferentes regiões do sistema nervoso embrionário ou extraídas de duas regiões específicas do cérebro adulto: a zona subventricular dos ventrículos laterais e a zona subgranular do giro denteado hipocampal^7,9. Estudos mostram que as CTN podem migrar e sobreviver em áreas cerebrais lesadas, assim como podem ser induzidas a se diferenciar in vivo e in vitro em neurônios, oligodendrócitos e astrócitos, indicando uma possível alternativa de reposição dos tipos celulares afetados na HI^9,17.

Depois de isoladas, as CTN podem proliferar in vitro, em resposta à presença de fatores de crescimento específicos, formando agrupamentos celulares denominados de neuroesferas. Basicamente, essas estruturas são formadas por CTN multipotentes e progenitores neurais com desenvolvimento mais comprometido^9,18,19. Alguns estudos têm demonstrado que astrócitos da zona subventricular que expressam uma proteína glial também podem ser considerados como CTN²⁰.

Nesse contexto, Zheng et al.²¹ demonstraram que células-tronco astrocíticas multipotentes provenientes da zona subventricular de camundongos migram para a região cortical e periventricular isquêmica e expressam sinais de diferenciação neuronal e astrocítica nos animais HI submetidos ao transplante intracerebral. Em contrapartida, quando o transplante foi efetuado em animais sadios, as células permaneceram no local em que foram injetadas e mantiveram o seu perfil celular astrocítico. Esses dados indicam que o tecido cerebral HI apresenta processos fisiológicos capazes de atrair células-tronco astrocíticas para o local de lesão, assim como de induzir a neurodiferenciação.

Em um elegante trabalho, Park et al.²² apresentaram interessantes observações do comportamento de CTN quando transplantadas no cérebro de camundongos neonatos submetidos à HI. Quando transplantadas no hemisfério contralateral à lesão HI, as CTN migraram através do corpo caloso e de outras comissuras inter-hemisféricas para a área infartada. Já quando o transplante foi feito no hemisfério ipsilateral, as células permaneceram no local da lesão. Em ambos os casos, as CTN diferenciaram-se no sítio isquêmico, apresentando marcação para neurônio, oligodendrócitos, astrócitos e células progenitoras neurais. Além disso, esse mesmo grupo de pesquisa elucidou os mecanismos inflamatórios envolvidos na migração da CTN frente à lesão HI²³.

Células-tronco embrionárias da camada interna do blastocisto de embriões também apresentam a capacidade de diferenciar-se em neurônios através de protocolos de cultura específicos, podendo ser consideradas fontes celulares alternativas para o tratamento de lesões cerebrais. Dois estudos utilizaram células-tronco embrionárias neurodiferenciadas em modelo de HI. No primeiro deles, demonstrou-se que o transplante de células-tronco embrionárias neurodiferenciadas in vitro resultou na melhora da memória espacial em ratos HI²⁴. No entanto, embora tenha ocorrido aumento de células neuronais no hipocampo isquêmico, não há evidências claras de que o sucesso nos desfechos encontrados esteja relacionado à repopulação neuronal, à diferenciação ou à liberação de fatores tróficos pelas células administradas. Em outro trabalho recentemente publicado, verificou-se o restabelecimento da coordenação e simetria motora de ratos HI após transplante de células-tronco embrionárias humanas neurodiferenciadas. No entanto, os autores constataram ausência de efeito reparador sobre o dano estrutural do cérebro²⁵.

O ambiente isquêmico remanescente pode influenciar na restauração tecidual em decorrência da agressividade do processo HI. As lesões HI podem se associar à volumosa necrose tecidual, resultando em um cisto porencefálico. Tal situação oferece um microambiente prejudicado para o abrigo de células transplantadas devido à carência de aporte sanguíneo e matriz extracelular adequada. Através de estudos na área da engenharia tecidual, uma nova abordagem de tratamento tem sido proposta com o uso de matrizes (scaffolds) biodegradáveis dentro da cavidade infartada, a fim de intensificar a formação de conexões entre o enxerto e o tecido hospedeiro^9,26. Utilizando essa abordagem terapêutica, Park et al.²⁷ demonstraram uma implantação satisfatória dos scaffolds associada à redução da cavidade cerebral infartada e ao déficit motor em ratos submetidos à HI. Surpreendentemente, constatou-se a formação de interconexões entre o implante e o tecido receptor, além do restabelecimento de projeções neuronais de longa distância anteriormente prejudicadas pelo processo HI.

Outros compostos também podem ser associados à terapia celular com o objetivo de prover suporte ao desenvolvimento de CTN em modelo de HI. Um exemplo disso é a utilização de condroitinase ABC (ChABC) associada ao transplante intracerebroventricular de CTN em ratos neonatos submetidos à HI que resultou na redução acentuada do dano cerebral²⁸. Devido à capacidade de promover plasticidade cerebral, os autores sugerem que a ChABC teria facilitado a adesão e migração de CTN para áreas isquêmicas.

Considerando CTN como possíveis vetores de fatores tróficos, alguns trabalhos utilizam células-tronco geneticamente modificadas para expressar níveis aumentados dessas substâncias. Utilizando CTN que superexpressam neurotrofina-3 (CTN/NT-3) no cérebro de ratos HI, os pesquisadores observaram aumento da porcentagem de diferenciação neuronal de 5 para 10-20% na área infartada e > 80% na penumbra, quando comparado à linhagem de CTN não geneticamente modificada. Os autores sugerem que a produção da NT3 pelas CTN possa ter atuado de maneira autócrina e parácrina, ligando-se às células adjacentes do tecido hospedeiro e estimulando a neurogênese endógena^22,29. Outros estudos também têm demonstrado que CTN que superexpressam fatores tróficos específicos migram para a região lesada e formam nichos de células imaturas e proliferativas disponíveis para o reparo celular após HI³⁰. Adicionalmente, identificou-se que o ambiente perivascular é fundamental para a manutenção dessas células em um estado ativo de imaturidade e proliferação³¹. Estudos também mostram que a utilização de um vetor celular para liberar determinados fatores tróficos reduz a incidência e extensão do dano cerebral e cognitivo em estudos experimentais de HI^32,33.

Transplante de células-tronco de cordão umbilical

Células-tronco de cordão umbilical humano (CTCUH) têm sido usadas em alguns estudos experimentais de lesão HI em decorrência de sua capacidade de diferenciação em neurônios e células gliais in vitro e in vivo. No entanto, há poucos estudos usando células de sangue de cordão umbilical não humano em modelos animais de doenças neurológicas, havendo divergências do uso concomitante de imunossupressores^34,35.

O primeiro estudo a testar o efeito do transplante de CTCUH em ratos HI foi realizado por Meier et al.³⁶. Os autores demonstraram que a injeção intraperitoneal de CTCUH 24 h após a lesão HI em roedores neonatos resultou em melhora do padrão de marcha dos animais. Pode-se também constatar que as células-tronco migraram para a região da lesão cerebral, porém não se observou redução da atrofia cerebral e transdiferenciação das células transplantadas. Utilizando a mesma via de administração dessas células, um grupo de pesquisadores demonstrou que a injeção intraperitoneal de CTCUH, 3 h após a lesão HI, tem a capacidade de melhorar os reflexos primitivos desses animais³⁷. Além disso, os autores demonstraram redução da morte celular no estriado e um efeito anti-inflamatório no córtex. No entanto, foi possível verificar a presença de poucas células transplantadas no estriado e córtex isquêmicos dos animais tratados.

No mesmo ano, nosso grupo de pesquisa publicou um estudo sobre os efeitos da administração intravenosa de CTCUH em HI experimental³⁸. No entanto, nossos resultados demonstraram apenas uma tendência para a redução dos déficits comportamentais e morfológicos nos ratos tratados 30 dias após o transplante. Além disso, poucas células transplantadas foram identificadas no cérebro dos animais tratados. Aspectos como dose, tempo de seguimento para a avaliação e via de administração podem ter influenciado nos desfechos do estudo.

Paralelamente, também desenvolvemos um modelo experimental de hipóxia-isquemia em suínos neonatos para o estudo da terapia celular em animais de médio porte³⁹. Os suínos recém-nascidos que receberam CTCUH através da artéria carótida comum apresentaram melhores escores neurológicos quando comparados aos animais apenas submetidos ao modelo de HI ou ao grupo transplantado via artéria umbilical. Adicionalmente, foi possível identificar a presença das células transplantadas apenas em alguns animais do grupo transplantado por via artéria carótida.

Um interessante estudo demonstrou que a injeção intravenosa de CTCUH, 7 dias após a lesão HI, melhorou a coordenação e assimetria motora dos ratos tratados⁴⁰. Além disso, foram detectados níveis aumentados de fatores de crescimento no hemisférico cerebral ipsilateral à lesão 3 dias pós-transplante. Nesse estudo, os autores também incluíram um grupo de animais HI que receberam a mesma dose de CTCUH associado ao uso de manitol, substância que aumenta a permeabilidade da barreira hematoencefálica. Os resultados desse grupo experimental demonstraram que o manitol potencializou ainda mais os efeitos funcionais e a expressão dos fatores tróficos, em comparação ao grupo apenas transplantado com CTCUH.

A viabilidade terapêutica de células-tronco mesenquimais, provenientes de cordão umbilical humano em modelo experimental de HI, também foi recentemente analisada⁴¹. O transplante foi efetuado 3 dias após HI através da via intracerebral. Os animais tratados apresentaram uma melhora progressiva da função neurológica, associada à atenuação do dano cerebral. Além disso, verificou-se a presença das células transplantadas no córtex, com dispersão em direção ao hipocampo, 7 dias pós-transplante, apresentando diferenciação astrocítica, mas não neuronal.

Em contexto clínico, pesquisadores da Universidade Duke iniciaram estudo fase I com transplante autólogo de células-tronco de cordão umbilical em recém-nascido a termo com encefalopatia HI de grau moderado a severo (NCT00593242). As crianças serão acompanhadas para avaliação de neurodesenvolvimento e submetidas a exames de ressonância magnética. Até o presente momento, o ensaio clínico encontra-se na fase de recrutamento de pacientes compatíveis com os critérios de seleção do estudo.

Transplante de células-tronco de medula óssea

Estudos utilizando células-tronco da medula óssea também têm sido amplamente utilizados em modelos animais de lesão isquêmica cerebral, como em ratos adultos^42.45 e, mais recentemente, em ensaios clínicos, demonstrando resultados promissores^46,47.

O sangue da medula óssea contém, pelo menos, duas populações celulares com um grande potencial para o uso clínico: as células-tronco hematopoiéticas e as células-tronco mesenquimais (CTM)³⁴. A descoberta de que células-tronco hematopoiéticas também possuíam a capacidade de se transdiferenciar em linhagem neuronal ampliou o espectro de utilização dessa fonte de células imaturas^48,49. Especificamente, as CTM são derivadas do estroma medular e são definidas conforme a presença de marcadores de superfície específicos, comportamento in vitro e potencial de diferenciação⁵⁰. Esse tipo celular apresenta uma elevada capacidade de expressar fenótipos neuronais in vitro^51,52 e in vivo^53,54.

Recentemente, dois grupos de pesquisa apresentaram seus resultados utilizando CTM de medula óssea em modelo de HI experimental. Lee et al.⁵⁵ utilizaram a via intracardíaca para o transplante 72 h após a lesão. Os autores observaram a presença dos implantes celulares igualmente distribuídos em ambos os hemisférios cerebrais 6 semanas após o transplante. Tais células expressaram mais frequentemente marcadores de astrócito e microglia, além de marcadores de neurônio e oligodendrócitos, em menor número. Adicionalmente, observou-se melhora da assimetria motora nos ratos HI 40 dias após o transplante, embora não tenha sido constatada a reparação do dano isquêmico tecidual.

Já em outro estudo, demonstrou-se que a injeção intracerebral de CTM, 72 h após lesão, aumentou a proliferação e a diferenciação neuronal no hemisfério isquêmico⁵⁶. Os desfechos histológicos e motores também foram favoráveis 10 e 21 dias após o tratamento. No entanto, menos de 1% dos novos neurônios eram derivados das células transplantadas. O estudo sugere que as CTM tenham favorecido a formação endógena de novas células neuronais a partir da redução da atividade inflamatória microglial.

Utilizando uma fração purificada das CTM, denominada de células progenitoras adultas multipotentes (CPAM), Yasuhara et al.⁵⁷ demonstraram que a administração intracerebral ou intravenosa de CPAM de medula óssea de camundongo, 7 dias após HI, resultou em melhora motora dos animais transplantados. Curiosamente, houve equivalência na recuperação do déficit motor entre os animais que receberam transplante alogênico (entre animais geneticamente diferentes, porém da mesma espécie) e aqueles que receberam transplante singênico (entre animais geneticamente idênticos). Associada à perda neuronal diminuída, detectou-se também a presença de CPAM nas regiões hipocampais isquêmicas e a marcação neuronal 14 dias pós-transplante^57,58.

Mecanismos de ação envolvidos na terapia celular em hipóxia-isquemia experimental

Compreender os mecanismos de ação envolvidos no processo de neuroregeneração pelas células-tronco é fundamental para otimizar os benefícios clínicos da terapia celular. Diversos fatores (resumidos na Tabela 2) podem ser responsáveis pelos resultados positivos apresentados em estudos recentes de HI experimental. No entanto, apesar dos benefícios significativos demonstrados nesses trabalhos, as variáveis responsáveis pelo sucesso do transplante de células-tronco em HI ainda não foram estabelecidas.

Transdiferenciação celular

A primeira hipótese estudada para justificar os efeitos benéficos da terapia celular em doenças neurológicas foi a da transformação direta de células-tronco em neurônios maduros, processo denominado de transdiferenciação. No entanto, os estudos com HI têm mostrado que a recuperação funcional dos animais tratados tem ocorrido independente da presença de células-tronco com expressão de marcadores neuronais nas áreas isquêmicas. A transdiferenciação de células-tronco adultas de origem mesodérmica em células derivadas da camada ectodérmica ainda permanece em debate. Em estudos in vitro, a transdiferenciação é detectada através da positividade de marcadores específicos de neurônios e células gliais. No entanto, a caracterização de propriedades eletrofisiológicas dessas células transdiferenciadas ainda está pouco documentada^59-61. Em decorrência desses achados, outros mecanismos têm sido propostos⁶².

Liberação de fatores tróficos

Os fatores tróficos constituem uma família de polipeptídeos essenciais para a sobrevivência e a diferenciação de neurônios normais em desenvolvimento, além de terem um papel importante na neuroproteção de neurônios maduros sob condições patológicas⁶³. As células-tronco podem servir como veículos de moléculas específicas, funcionando como vetores para a produção e/ou liberação de fatores neurotróficos^29,64. Interagindo com seus receptores, é possível que as células-tronco possam liberar fatores de crescimento e citocinas, inibindo processo de apoptose, aumentando a angiogênese e/ou estimulando a diferenciação de células precursoras endógenas^12,40. Dados obtidos no estudo de Borlongan et al.⁶⁵ reportaram um aumento de 15% na produção de fatores tróficos no sangue circulante de ratos adultos submetidos à isquemia cerebral após transplante de CTCUH. Recentemente, o mesmo grupo demonstrou resultados similares após o transplante de células-tronco em um modelo de HI neonatal em ratos⁴⁰. Embora exista a liberação endógena de fatores tróficos pelo tecido neuronal frente a lesões isquêmicas, esse mecanismo compensatório é insuficiente para promover a regeneração tecidual e/ou recuperação funcional. Portanto, os autores desses estudos sugerem que o aumento de fatores tróficos específicos seja, provavelmente, em decorrência do transplante de células-tronco.

Estimulação da neurogênese endógena

Diversos estudos demonstraram aumento da neurogênese endógena frente às lesões HI neonatais^66,67. No entanto, é possível que as células-tronco transplantadas possam potencializar esses mecanismos intrínsecos de reparação. No estudo de van Velthoven et al.⁵⁶, verificou-se que o transplante de células-tronco em animais HI reduziu a proliferação microglial e aumentou a neurogênese. Os autores sugerem que as células transplantadas tiveram a capacidade de modular a resposta inflamatória pós-HI, favorecendo o processo de neurogênese endógena.

Modulação do processo inflamatório

Apesar de benéfico para o recrutamento e migração de células-tronco até o local da lesão, o processo inflamatório determinado por lesões cerebrais parece ser restritivo para a diferenciação celular²³. Nesse contexto, estudos atuais têm demonstrado que diferentes fontes de células-tronco podem inibir a ativação de diversas células imunes. Pluchino et al.⁶⁸ mostraram que células-tronco neurais promoveram a neuroproteção através de citocinas anti-inflamatórias e de moléculas imunomodulatórias. Em outro estudo, a injeção intravenosa de CTCUH aumentou a sobrevivência do tecido neuronal e reduziu a infiltração de leucócitos e a expressão de proteínas pró-inflamatórias no cérebro isquêmico⁶⁹.

No SNC, as células microgliais constituem a primeira linha de defesa imunológica e compreendem um dos principais processos inflamatórios que contribuem ao dano cerebral. Essa população celular libera uma variedade de citocinas e fatores de crescimento e reagem rapidamente no tecido cerebral lesado para promover a fagocitose e apresentar antígenos para as células T. No entanto, a ativação microglial está comumente associada à diminuição da produção de fatores tróficos e com redução da neurogênese^9,63,70. Pode-se observar que, em dois estudos de terapia celular em HI experimental, o transplante de células-tronco reduziu a expressão de microglia no córtex e hipocampo isquêmico e, consequentemente, melhorou os desfechos funcionais nos animais tratados^37,56. Em contrapartida, Daadi et al.²⁵ verificaram aumento de proliferação de células microgliais no estriato de animais HI transplantados com CTN. Esses dados sustentam a ideia de que as células microgliais desempenham um papel pró- e anti-inflamatório, dependendo do seu estado de ativação e fenótipo funcional⁷¹.

Estimulação da angiogênese

Alguns estudos com lesões isquêmicas em ratos adultos têm mostrado que há um aumento da vascularização nas áreas de penumbra poucos dias após o transplante de células-tronco^72,73. Além disso, tem-se observado a transdiferenciação das células-tronco transplantadas em novos vasos (angiogênese)^34,74. É provável que também ocorra um evento indireto das células na formação dos vasos sanguíneos. Chen et al.⁷⁵ mostraram que células-tronco do estroma da medula óssea promoveram angiogênese na região isquêmica através de um aumento dos níveis endógenos de fator de crescimento endotelial vascular. Até o presente momento, existe apenas um estudo indicando neovascularização no tecido cerebral de animais HI transplantados com CTN²⁷. Os autores sugerem que tenha ocorrido a elaboração de sinais angiogênicos pós-transplante, propiciando a formação de um parênquima novo e vascularizado no local do cisto porencefálico.

Indução da neuroplasticidade

Eventos neuroplásticos incluem um aumento nas conexões aferentes e eferentes entre o local da lesão e as regiões cerebrais, restaurando as atividades sinápticas locais através da sinaptogênese³⁴. Recentemente, tem-se observado a expressão de proteínas sinápticas em ratos adultos com lesão cerebral isquêmica que receberam transplante de células-tronco, indicando a formação de contatos sinápticos^76,77. Confirmando tal possibilidade, um estudo recente demonstrou que células-tronco neurais, transplantadas via intracerebral de ratos HI, aumentou o número de terminais axonais no córtex sensório-motor, corpo caloso, estriato e tálamo ipsilaterais, assim como brotamento axonal acentuado em direção ao hemisfério lesado²⁵.

Aspectos translacionais da terapia celular em asfixia perinatal

A pesquisa translacional pode ser definida como um processo que parte da medicina baseada em evidências em direção a soluções sustentáveis para problemas de saúde da comunidade⁷⁸. Os estudos pré-clínicos constituem o primeiro passo no desenvolvimento de novas terapias. No entanto, a transferência dos conhecimentos adquiridos através de estudos in vitro e em modelos animais de HI para o uso clínico da terapia celular requer atenção para as diferenças entre as espécies e a análise crítica dos resultados experimentais. Além disso, aspectos ainda pouco elucidados (Tabela 3), tais como, a via de administração, o número de células transplantadas, o tipo de célula utilizada e o momento de intervenção pós-lesão são variáveis importantes que poderão influenciar significativamente a resposta clínica. Portanto, após o esclarecimento de questões fundamentais para a segurança do tratamento, é possível que estudos clínicos de fase I possam ser iniciados para avaliar essa abordagem terapêutica inovadora.

A escolha da via de administração pode ser um fator crucial para o sucesso da terapia celular quando se considera que o benefício do tratamento dependa da migração e localização das células transplantadas na região cerebral comprometida. Atualmente, a melhor rota de transplante de células-tronco para o tratamento de neuropatologias ainda não está definida. No entanto, concorda-se que a rota ideal seria aquela que apresentasse alta eficiência e especificidade, com o mínimo de efeitos adversos. Estudos em modelos animais de HI têm utilizado uma variedade de métodos de administração, incluindo a via intraperitoneal, intravenosa e intracerebral.

Através do transplante intracerebral, é possível atingir diretamente uma área cerebral específica. Apesar da precisão da técnica, o procedimento é invasivo e diversas aplicações seriam necessárias para abranger uma lesão isquêmica, resultando em um comprometimento cerebral ainda maior⁷⁹. Injeções intracerebroventriculares também constituem uma abordagem intracraniana de administração das células-tronco. No entanto, apesar de permitir uma distribuição celular difusa, essa via não é capaz de atingir lesões afastadas dos ventrículos e esbarra nas mesmas questões que o transplante intracerebral. Além disso, as células transplantadas podem permanecer aderidas nas paredes dos ventrículos e causar hidrocefalia obstrutiva^79,80. Embora a maioria dos estudos experimentais de terapia celular em HI neonatal utilize o transplante intracerebral, é mais provável que outras vias de administração menos invasivas sejam estabelecidas para a prática clínica. Em contexto experimental demonstrou-se equivalência na recuperação motora e morfológica do transplante intravenoso e intracerebral de células-tronco em modelo animal de HI neonatal⁵⁷.

Uma recente metanálise demonstrou que transplante celular pela via intravenosa é capaz de melhorar os desfechos de modelos animais de neuropatologias, sendo que a inibição do processo apoptótico é a principal modificação molecular cerebral pós-transplante⁸¹. O procedimento de administração intravenosa é menos invasivo, simples e seguro, possibilitando ampla distribuição das células transplantadas para áreas cerebrais HI^38,40,57. Além disso, permite que estas entrem em contato com sinais quimiotáticos provenientes da lesão cerebral e sejam seletivamente acumuladas no tecido alvo^79,82. No entanto, apenas um número reduzido de células-tronco atinge o local de lesão cerebral por permanecerem retidas nos pulmões, rins, fígado e baço. Em decorrência disso, toxicidade e crescimento ectópico em outros órgãos necessitam ser avaliados antes do uso clínico⁸⁰.

Uma maneira de evitar a circulação corporal sistêmica seria optar pelo transplante das células-tronco por um acesso intra-arterial. Dados recentes mostram migração igualmente distribuída e desfechos neurológicos favoráveis através do uso dessa abordagem terapêutica em modelo de HI em ratos⁵⁵. Essa rota desvia a captação pelos órgãos sistêmicos, permitindo que uma concentração maior de células-tronco atinja o sítio isquêmico, uma vez que os vasos tenham reperfusão. Caso os vasos estejam permanentemente ocluídos, as células transplantadas permanecerão distribuídas apenas na região da penumbra⁷⁹. Entretanto, estudos recentes reportam alta taxa de mortalidade de animais transplantados pela via intra-arterial, sugerindo a formação de oclusões microvasculares e isquemias^79,80,83. Na prática médica, o método de acesso intra-arterial é comumente utilizado em técnicas intervencionistas de cateterismo vascular. Em um ensaio clínico brasileiro de terapia celular em pacientes com isquemia crônica (NCT00473057), foram observados resultados promissores pós-transplante autólogo de células-tronco da medula óssea utilizando a via intra-arterial⁴⁶.

A via intraperitoneal também foi utilizada para transplante celular em HI neonatal, demonstrando migração celular da cavidade peritoneal até as regiões de dano cerebral^36,37. Os resultados do estudo sugerem a presença de sinais quimiotáticos precisos e a necessidade de quebra da barreira hematoenceláfica para que ocorra migração celular em distâncias tão longas. Apesar da praticidade do procedimento, necessita-se um número maior de estudos que dêem suporte para esta via de transplante alternativa.

A escolha do intervalo de tempo entre o estabelecimento da lesão HI e a intervenção também é importante, pois ao longo do tempo, o ambiente cerebral adapta-se drasticamente frente a uma lesão HI. Em decorrência disso, a maioria dos estudos utilizando a administração sistêmica de células-tronco em HI utiliza estágios agudos de lesão. Células-tronco injetadas precocemente podem auxiliar na preservação e na sobrevivência do tecido neuronal. Adicionalmente, van Velthoven et al.⁵⁶ sugerem que o transplante celular seja realizado entre 2 e 3 dias pós-HI, momento em que o cérebro apresenta maior capacidade de proliferação celular e ativação de mecanismos de reparo endógeno. No trabalho de Park et al.²², a janela terapêutica para transplante celular eficaz abrangeu 3-7 dias pós-HI, devido à elevada atividade metabólica, bioquímica e molecular deste período que poderia facilitar a migração das células transplantadas²². Já no caso de transplantes tardios, é possível que as células-tronco possam estimular a liberação de fatores tróficos para restaurar as funções perdidas⁸⁰. No entanto, apesar da melhora funcional observada em ratos adultos que receberam células-tronco um mês após isquemia cerebral⁸⁴, não há estudos que demonstram benefícios terapêuticos em modelos animais de HI crônica, limitando a aplicabilidade clínica em lesões hipóxico-isquêmicas estabelecidas em decorrência da ausência de sinais quimiotáticos e permeabilidade vascular apropriados.

A permeabilização da barreira hematoencefálica também pode facilitar a entrada de células-tronco ou de fatores neurotróficos no SNC, especialmente quando forem utilizadas vias periféricas de transplante. Entretanto, recentemente, demonstrou-se que o número de células-tronco no hipocampo isquêmico dos animais HI transplantados pela via intravenosa, não diferiu significativamente quando comparados os animais que receberam apenas células-tronco com aqueles em que foi associado o manitol⁴⁰. Em contrapartida, os animais transplantados e administrados com manitol apresentaram maior concentração cerebral de alguns fatores tróficos. Também se verificou melhora acentuada dos desfechos comportamentais e histológicos com o uso de células-tronco e manitol, possivelmente através do efeito parácrino dessas células. Essas evidências indicam a importância da permeabilização da barreira hematoencefálica em terapia celular, mas também questionam se a neuroproteção é realmente dependente da migração e diferenciação celular.

O tipo e fonte celular mais adequados para o tratamento das lesões HI neonatais ainda necessitam ser definidos³⁴. O uso de CTN é considerado padrão-ouro para o tratamento de doenças neurológicas. No entanto, os resultados de muitos estudos demonstram que morte celular, migração restrita e rápida diferenciação em células gliais limitam a aplicabilidade das CTN no reparo neuronal. Além disso, um dos maiores obstáculos para o uso clínico desse tipo celular em lesões cerebrais neonatais é a sua dificuldade de obtenção. É provável que tecidos de biópsia ou de material extraído de tecido post-mortem sejam insuficientes para a produção de quantidades significativas dessas células⁸⁵. As questões ético-religiosas envolvidas na extração de material embrionário e fetal e as preocupações com os riscos de resposta imunológica ou de formação de tumores malignos também inibem a aplicabilidade clínica dessas células. A neurodiferenciação in vitro para futura utilização dessas células em recém-nascidos com HI adiciona preocupação com os potenciais riscos de contaminação, reação imunológica aos fatores adicionados ao meio de cultivo celular e dificuldade de uso em transplantes agudos. Desvantagens similares relacionadas a segurança e dificuldade de uso imediato também são apresentadas pelas células-tronco mesenquimais da medula óssea e cordão umbilical, amplamente usadas em HI experimental.

Em contrapartida, o processamento de células-tronco mononucleares provenientes do sangue de cordão umbilical e da medula óssea é relativamente simples e rápido. No contexto da área neonatal, as células-tronco mononucleares derivadas de sangue de cordão umbilical apresentam algumas vantagens em relação à aspiração da medula óssea. A obtenção de células-tronco de sangue de cordão umbilical não oferece nenhum risco e desconforto para o recém-nascido, podendo ser transplantadas após coleta autóloga. Além disso, o sangue do cordão umbilical pode ser usado terapeuticamente no período perinatal ou criopreservado para o uso tardio^62,86. No entanto, estudos adicionais necessitam ser realizados para caracterizar as populações celulares e avaliar efetividade e segurança^80,87.

Avaliação da dose-resposta das células-tronco em modelos animais também necessita ser realizada para embasar o seu uso clínico. Segundo Janowski et al.⁸¹, há uma associação dose-resposta entre o número de células injetadas e os efeitos do tratamento de neuropatologias em estudos experimentais. No entanto, a dose ideal de células-tronco é, em parte, dependente da via de administração, assim como do tipo celular usado, do momento de intervenção e a quantidade de células transplantadas que atingem a lesão cerebral. Do ponto de vista clínico, desfechos relacionados à segurança do transplante celular, tais como a formação tecidual ectópica e anormalidades comportamentais, devem ser incorporados na metodologia das investigações e no seguimento dos pacientes. Também é importante considerar metodologias seguras e efetivas para o monitoramento não invasivo da migração das células transplantadas e, consequentemente, estabelecer uma compreensão adequada das respostas do paciente ao tratamento proposto.

Conclusões

A pesquisa básica vem apresentando resultados promissores na área da lesão cerebral neonatal. Apesar da variabilidade dos métodos empregados, a maioria dos estudos citados nessa revisão indica que as células-tronco podem apresentar propriedades neuroprotetoras, resultando em melhores desfechos funcionais nos animais tratados. Certamente, o sucesso da terapia celular em roedores pode ser considerado o primeiro passo no desenvolvimento de uma abordagem terapêutica para um futuro uso clínico. No entanto, cabe ressaltar que as doenças cerebrais humanas apresentam mecanismos mais complexos de dano e regeneração do que em animais de experimentação. Portanto, questões relacionadas à dose e ao tipo celular, à via de administração e ao momento adequado de intervenção necessitam ser definidas. Embora não determinante para a aplicação clínica, investigações adicionais sobre os mecanismos de ação das células-tronco em HI também constituem uma ferramenta importante na determinação da segurança e efetividade do transplante.

Agradecimentos

Os autores agradecem à PUCRS e à CAPES pelas contribuições para o desenvolvimento desta linha de pesquisa.

Artigo submetido em 02.06.10, aceito em 09.08.10.

Não foram declarados conflitos de interesse associados à publicação deste artigo.

Como citar este artigo: de Paula S, Greggio S, DaCosta JC. Use of stem cells in perinatal asphyxia: from bench to bedside. J Pediatr (Rio J). 2010;86(6):451-464.

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Correspondência:

Jaderson Costa DaCosta

Laboratório de Neurociências, InsCer, PUCRS

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  17 Jan 2011
• Data do Fascículo
  Dez 2010

Histórico

• Aceito
  09 Ago 2010
• Recebido
  02 Jun 2010