Responsividade à tetrahidrobiopterina em pacientes com deficiência de fenilalanina hidroxilase

Resumos

OBJECTIVE: To identify patients responsive to tetrahydrobiopterin (BH4) in a sample of Brazilians with hyperphenylalaninemia due to phenylalanine hydroxylase deficiency (HPA-PAH). METHODS: Interventional study, convenience sampling. The inclusion criteria were: diagnosis of HPA-PAH; age > 7 years; phenylalanine-restricted diet and phenylalanine (Phe) levels > 6 mg/dL in all blood tests 1 year before inclusion. Blood samples were obtained the day before (day 1) and at 0, 4, 8 (day 2) and 24 h (day 3) after BH4 intake. Phe levels were measured using tandem mass spectrometry. The criteria used to define responsiveness to BH4 were: criterion 1- Phe reduction > 30% 8 h after BH4 administration; criterion 2 - Phe reduction > 30% 24 h after BH4 administration. RESULTS: Eighteen patients were enrolled (median age, 14 years; 12 boys). Five patients were responsive to BH4, 3 according to both criteria (one classical PKU, two mild PKU); and two according to criterion 2 (one classical PKU; one indefinite PKU type). There were no differences between Phe serum levels on day 1 and at the other time points (p = 0.523). However, Phe levels on days 1 and 2 were significantly different (p = 0.006). The analysis of the phenotype-genotype association confirmed its multifactorial character. CONCLUSION: A relevant number of Brazilian patients with HPA-PAH are responsive to BH4, in agreement with other studies in the literature.

Phenylketonuria; phenylalanine hydroxylase; biopterin

ARTIGO ORIGINAL

Responsividade à tetrahidrobiopterina em pacientes com deficiência de fenilalanina hidroxilase

Luciana Giugliani^I; Angela Sitta^II; Carmen R. Vargas^III; Luiz C. Santana-da-Silva^IV; Tatiéle Nalin^V; Maria Luiza Saraiva-Pereira^VI; Roberto Giugliani^VII; Ida Vanessa D. Schwartz^VIII

^IMestre. Programa de Pós-Graduação em Saúde da Criança e do Adolescente, Universidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Porto Alegre, RS

^IIMestre, Ciências Biológicas (Bioquímica). UFRGS, Porto Alegre, RS

^IIIDoutora, Ciências Biológicas (Bioquímica). Professora adjunta III, UFRGS, Porto Alegre, RS

^IVDoutor, Ciências Biológicas (Bioquímica). UFRGS, Porto Alegre, RS. Professor, Instituto de Ciências Biológicas, Universidade Federal do Pará, Belém, PA

^VMestranda, Programa de Pós-Graduação em Medicina: Ciências Médicas, UFRGS, Porto Alegre, RS

^VIDoutora, Genética Molecular, University of London (UL), Londres, Reino Unido. Professora associada, Departamento de Bioquímica, UFRGS, Porto Alegre, RS

^VIIDoutor, Genética. Universidade de São Paulo (USP), São Paulo, SP. Professor titular, Departamento de Genética, UFRGS, Porto Alegre, RS

^VIIIDoutora, Ciências: Genética. Professora adjunta, Departamento de Genética, UFRGS, Porto Alegre, RS. Serviço de Genética Médica, Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA), UFRGS, Porto Alegre, RS

^{Correspondência}

RESUMO

OBJETIVO: Identificar indivíduos responsivos à tetrahibrobiopterina (BH₄) em uma amostra de pacientes brasileiros com hiperfenilalaninemia por deficiência de fenilalanina-hidroxilase (HPA-PAH).

MÉTODOS: Estudo intervencional, amostragem por conveniência. Para serem incluídos no estudo, os pacientes deveriam: possuir diagnóstico bioquímico de HPA-PAH; ter idade > 7 anos; estar em tratamento dietético; e apresentar níveis de fenilalanina (Phe) > 6 mg/dL em todas as medidas realizadas no ano anterior à inclusão no estudo. Os níveis de Phe foram determinados por meio de espectrometria de massas in tandem no dia anterior (dia 1) e nos pontos de hora 0, 4 e 8 h (dia 2) e 24 h (dia 3) após ingestão de BH₄. Os critérios utilizados para definir responsividade ao BH₄ foram: critério 1-redução > 30% de Phe após 8 h da administração de BH₄; e critério 2-redução > 30% de Phe após 24 h da administração.

RESULTADOS: Dezoito pacientes foram incluídos no estudo (mediana de idade = 14 anos, sexo masculino = 12). Cinco pacientes foram responsivos ao BH₄, sendo três (forma clássica: um; forma leve: dois) de acordo com ambos os critérios, e dois (forma clássica: um; forma não definida: um) de acordo com o critério 2. Os níveis de Phe plasmáticos do dia 1 não demonstraram variação nos pontos de hora (p = 0,523). Entretanto, quando comparamos os níveis de Phe nos pontos de hora dos dias 1 e 2, encontramos uma variação significativa (p = 0,006). A análise da associação genótipo-fenótipo confirmou o caráter multifatorial da responsividade ao BH₄.

CONCLUSÃO: Os nossos achados estão de acordo com a literatura e indicam que um número relevante de pacientes brasileiros com HPA-PAH é responsivo à BH₄.

Palavras-chave: Fenilcetonúrias, fenilalanina hidroxilase, biopterina.

Introdução

A hiperfenilalaninemia por deficiência de fenilalanina hidroxilase (HPA-PAH), comumente chamada de fenilcetonúria (PKU), é um dos erros inatos do metabolismo mais frequentes e o primeiro a ser tratado por dietoterapia¹. O tratamento clássico para essa doença baseia-se em uma dieta com baixo teor de fenilalanina (Phe). A restrição dietética de Phe protege o sistema nervoso central dos efeitos tóxicos da doença, prevenindo as manifestações clínicas associadas. Contudo, a dietoterapia é complexa e de longa duração. A baixa adesão ao tratamento é um problema enfrentado principalmente no atendimento a adolescentes e adultos, uma vez que as opções dietéticas são muito restritas².

Desde a publicação de Kure et al.³, que relatou os primeiros pacientes com HPA-PAH, cujos níveis plasmáticos de Phe diminuíram com a utilização oral de tetrahidrobiopterina (BH₄), vários outros estudos, usando protocolos diferentes e doses variadas de BH₄, demonstraram que pacientes com HPA-PAH podem ter os seus níveis de Phe melhor controlados mediante a administração oral de BH₄^4-7. A partir desses estudos, ficou evidente que a maioria dos indivíduos responsivos ao BH₄ pertence ao grupo com "Fenilcetonúria leve" (PKU leve) e que cerca de 20 a 50% dos pacientes com HPA-PAH alcançam redução > 30% dos níveis de Phe associada ao uso de BH₄⁸. Os dados disponíveis sugerem que a presença ou ausência de responsividade ao BH₄ é multifatorial, sendo o genótipo um dos seus fatores determinantes^9-11.

Nesse contexto, este trabalho propõe um estudo inédito no Brasil, com o objetivo de identificar indivíduos responsivos à administração de BH₄ por via oral.

Metodologia

Esse é um estudo intervencional, aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (HCPA). A participação da indústria farmacêutica limitou-se à doação da BH₄ (sapropterina dihidrocloride, Kuvan^®) necessária para a realização do estudo. Foram avaliados pacientes com HPA-PAH atendidos no Ambulatório de Tratamento de Distúrbios Metabólicos do Serviço de Genética Médica do Hospital de Clínicas de Porto Alegre (ATDM-SGM/HCPA). Todos os pacientes e/ou seus responsáveis assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido.

Foram incluídos no estudo pacientes com idade > 7 anos e que possuíam níveis séricos de Phe > 6 mg/dL nos 12 meses de vida anteriores à data de inclusão no estudo. Os critérios de exclusão foram: gestação; doença hepática sintomática; uso de levodopa; e seguimento ambulatorial irregular.

O tipo de HPA-PAH foi classificado de acordo com o nível de Phe plasmática ao diagnóstico (sem tratamento), critério adotado pelo ATDM-SGM/HCPA¹²: PKU clássica (Phe > 20 mg/dL); PKU leve (Phe entre 6 e 20 mg/dL); e HPA não PKU (Phe entre 2 e 6 mg/dL). Aqueles pacientes com dados ausentes e/ou duvidosos foram considerados "PKU indefinido"¹².

Teste de sobrecarga com BH₄

Os pacientes foram instruídos a permanecer dois dias no SGM/HCPA, recebendo dieta habitual, para a realização das avaliações. No primeiro dia (dia pré-BH₄ ou dia 1), os pacientes foram submetidos a coletas de sangue às 8/12/16 h ou 9/13/17 h (ponto 0/ ponto 1/ ponto 2, respectivamente), para avaliar a variação dos níveis de Phe. No segundo dia (dia 2), foi aplicado um protocolo modificado do teste de sobrecarga com BH₄¹³, com administração oral de uma única dose de 20 mg/kg de BH₄ em todos os pacientes.

As coletas de sangue no dia 2 foram realizadas nos pontos de hora 0, 4 e 8 h (ponto 0 ou basal, ponto 1 e ponto 2, respectivamente), após a ingestão do medicamento. A coleta de sangue no dia 3 foi realizada 24 h após a ingestão do medicamento (ponto 3). Os níveis de Phe no sangue foram determinados através da espectrometria de massa in tandem (MS/MS) no Laboratório de Erros Inatos do Metabolismo do SGM/HCPA. Todas as dosagens foram realizadas em duplicata, sendo a média entre as duas dosagens considerada como resultado final.

Os pacientes foram instruídos a permanecer em jejum por aproximadamente uma hora antes de todas as coletas de sangue. Caso algum dos pacientes não apresentasse níveis de Phe > 6 mg/dL no ponto 0 do dia 2 (dia da sobrecarga com BH₄), o mesmo seria instruído a repetir esse protocolo em momento posterior, e o teste inicial não era considerado.

Responsividade ao BH₄

Foram utilizados dois critérios de responsividade ao BH₄, uma vez que não existe consenso sobre o melhor critério a ser utilizado:

critério 1: redução > 30% de Phe após 8 h da administração do medicamento⁸;

critério 2: redução > 30% de Phe após 24 h da administração do medicamento¹³.

Consumo dietético de Phe

Todos os pacientes foram instruídos a continuar a mesma prescrição dietética de Phe em que estavam antes do início do estudo (ou seja, dieta usual restrita em Phe). O consumo de Phe ao longo do estudo foi verificado por meio de inquérito alimentar de 3 dias, que foi aplicado do dia anterior à vinda dos pacientes ao SGM/HCPA até o dia da sobrecarga com o BH₄ inclusive. O consumo de Phe foi obtido através do cálculo do inquérito alimentar de cada dia, utilizando-se o programa de apoio à nutrição DietWin Profissional^® 2008 (DietWin, Porto Alegre, RS). A quantidade de Phe prescrita foi verificada no prontuário do paciente e registrada em formulário específico.

Genótipo

Os dados relativos ao genótipo dos pacientes foram obtidos por meio de revisão de prontuário.

Análise estatística

As informações foram digitadas em planilha eletrônica, utilizando-se o programa Microsoft^® Excel. A análise estatística foi realizada através do Programa Statistical Package for Social Sciences, versão 14.0 (SPSS^® Inc, Chicago, IL). A análise descritiva foi realizada com o fornecimento das frequências absolutas e relativas. As variáveis contínuas foram apresentadas como médias ± desvio padrão e mediana com intervalo interquartil. O teste ANOVA para medidas repetidas foi utilizado para comparar os níveis de Phe ao longo do tempo, assim como para comparar o consumo de Phe ao longo dos três dias de inquérito alimentar. O teste t de Student para amostras pareadas foi utilizado para comparar os níveis de Phe pré e pós BH₄, em cada ponto de hora. O nível de significância utilizado foi de 5%.

Resultados

Dezoito pacientes, oriundos de 13 famílias não relacionadas, foram incluídos no estudo (Figura 1), sendo 12 (66,7%) do sexo masculino. A mediana (intervalo interquartil) de idade dos pacientes foi de 14 (11-21) anos. Consanguinidade parental não foi relatada.

Os valores de Phe plasmática e a porcentagem de redução nos ponto de hora após administração do BH₄ estão descritos na Tabela 1. Cinco pacientes foram considerados responsivos ao BH₄: três pacientes (forma clássica: um; forma leve: dois) de acordo com ambos os critérios e dois pacientes (forma clássica: um, forma não definida: um) de acordo com o critério 2. Considerando apenas o caso-índice de cada família (n = 13/18), quatro pacientes foram considerados responsivos: três pacientes (forma clássica: um; forma leve: dois) de acordo com ambos os critérios e um paciente (forma clássica: um) de acordo com o critério 2.

Em relação aos dados dietéticos, não houve diferença entre o consumo de Phe avaliado nos 3 dias do inquérito alimentar (p = 0,059). Os níveis plasmáticos de Phe do dia anterior ao do teste de sobrecarga com BH₄ não demonstraram variação nos pontos de hora de coleta (p = 0,523). Quando comparamos os níveis de Phe dos pontos de hora basais do dia pré e pós BH₄ (9,44±3,12 mg/dL e 9,56±3,09 mg/dL, respectivamente), não encontramos diferença significativa (p = 0,795). Em relação ao ponto 1, as médias dos valores de Phe foram 8,88±2,77 mg/dL e 7,73±2,79 mg/dL nos dias pré e pós BH₄ respectivamente (p = 0,025). No ponto 2, a média dos valores de Phe foram 9,09±3,24 mg/dL e 8,07±2,84 mg/dL nos dias pré e pós BH₄, respectivamente (p = 0,006).

Em relação ao genótipo, os dois alelos mutantes do gene PAH eram conhecidos para 12 pacientes (Tabelas 1 e 2). A comparação dos resultados obtidos com aqueles descritos na literatura (Tabela 2) reforça o caráter multifatorial da responsividade ao BH₄. Além disso, considerando as três duplas de irmãos (pacientes 1 e 20, pacientes 7 e 8 e pacientes 14 e 17) e o trio de irmãos (pacientes 4,16 e 21) incluídos no estudo, somente uma das duplas (pacientes 14 e 17) e o trio de irmãos apresentaram concordância em relação à presença/ausência de responsividade.

Discussão

Esse estudo foi o primeiro trabalho realizado em indivíduos brasileiros com HPA-PAH, visando identificar pacientes responsivos à administração de BH₄ por via oral. Os critérios de inclusão utilizados visaram selecionar os pacientes mais colaborativos (por isso, a adoção do ponto de corte 7 anos para idade) e menos aderentes ao tratamento (por isso, o ponto de corte 6 mg/dL para os níveis prévios de Phe). Portanto, a maioria dos pacientes selecionados pertencia ao grupo da PKU clássica. Além disso, sabe-se que em pacientes com níveis adequados de Phe (< 6 mg/dL) a pesquisa da responsividade ao BH₄ deve ser realizada mediante administração conjunta de BH4 e de sobrecarga com Phe¹⁵, o que não era previsto pelo nosso protocolo.

Os níveis plasmáticos de Phe do dia anterior ao do teste de sobrecarga com BH₄ não demonstraram variação nos pontos de hora. Entretanto, quando comparamos os níveis de Phe nos pontos de hora do dia pré e pós BH₄, encontramos uma variação significativa entre eles, reforçando a hipótese de que a variação dos níveis de Phe pós-BH₄ seja um efeito do BH₄¹⁶. Os mecanismos moleculares responsáveis pela responsividade do BH₄ em pacientes HPA-PAH não estão claramente elucidados. Inúmeras hipóteses têm sido aventadas, tais como: a) efeito chaperona do BH₄; b) indução da expressão da PAH pelo BH₄; e c) estabilização do RNAm da PAH^9,17.

Embora o número de irmandades incluídas tenha sido pequeno (n = 4/18), os dados de genótipo e de variabilidade intrafamilial estão de acordo com o caráter multifatorial da responsividade ao BH₄. Esse achado reforça que, apesar da genotipagem ser útil na predição da responsividade ao BH₄, mais investigações são necessárias para que a mesma possa ser utilizada como teste definitivo para tanto⁸.

A taxa de responsividade ao BH₄ dos pacientes variou conforme o critério usado para definição de responsividade, sendo maior quando utilizado o critério 2 (redução > 30% após 24 h da administração do medicamento). Quando comparamos os protocolos adaptados de 8 h com os de 24 h percebemos também que, quanto maior o tempo do teste, maior a possibilidade de detectar os "responsivos mais lentos"^8,13. Além disso, segundo a literatura, o ponto de corte a ser adotado para definição de responsividade ao BH₄ poderia variar conforme o fenótipo clínico do paciente, sendo menor para pacientes com PKU clássica (redução > 20% nos níveis de Phe) e maior para aqueles pacientes com PKU leve (redução > 30% nos níveis de Phe)¹⁸. Se esse critério tivesse sido adotado neste estudo, a taxa de responsividade dos nossos pacientes PKU clássicos aumentaria de 2/18 (11,12%) para 5/18 indivíduos (27,78%).

Quando comparamos o tipo de PKU dos pacientes responsivos ao BH₄ com os dois critérios de responsividade utilizados, percebe-se que aqueles que possuíam PKU clássica aumentaram a porcentagem de responsividade ao longo do tempo (de um para dois pacientes, respectivamente). Entretanto, a taxa de responsividade ao BH₄ daqueles pacientes que possuíam PKU leve permaneceu igual (2 pacientes em ambos os critérios).

Os nossos achados estão de acordo com a literatura. A redução significativa nos níveis de Phe em resposta à administração oral de BH₄ é normalmente observada em cerca de 50% em pacientes com PKU leve^8,19, e a redução dos níveis de Phe é maior em pacientes com fenótipos mais leves de PKU em comparação a pacientes com fenótipos mais graves, uma vez que a atividade residual da PAH é maior nas formas mais amenas da doença^20,21. Nossos resultados demonstraram que pacientes com PKU clássica também podem ser responsivos ao teste de BH₄. Como relatado na literatura, menos de 10% dos pacientes responsivos ao BH₄ pertence ao grupo de PKU clássica⁸. Isso se deve ao fato de que esses pacientes possuem atividade residual da PAH baixa ou até mesmo nula. Entretanto, não se pode descartar a possibilidade de que os pacientes considerados não responsivos de acordo com o protocolo por nós utilizado ainda possam ser responsivos se testados por um período de tempo maior. Segundo estudos clínicos, verificou-se que protocolos de longa duração, como por exemplo, protocolos de 48 h, são essenciais para detectar responsivos mais lentos^4,22,23. Fiege & Blau¹⁸ observaram em seu estudo que um número elevado de pacientes com PKU clássica foram responsivos ao teste de sobrecarga com BH₄, particularmente quando o ponto de corte foi reduzido de 30 para 20% (6,8 para 26%).

Ainda não existe consenso em relação a um protocolo padrão-ouro para o diagnóstico da responsividade ao BH₄²⁴. Vários protocolos foram seguidos por diferentes estudos, usando tanto a formulação não registrada do BH₄ (produzida pelo Laboratório Shirks, Suíça) quanto a nova formulação do BH₄ [(6R)-5,6,7,8-tetrahidro-L-biopterina dihidrochlorido, Sapropterin dihidrochlorido; forma sintética do BH₄ utilizada no presente estudo]. Essa última foi aprovada pela FDA (para pacientes com idade igual ou superior a 4 anos) e EMEA (para pacientes com idade igual ou superior a 5 anos) para tratamento de HPA-PAH nos EUA e Europa, respectivamente^17,25,26. Esses estudos incluíram, também, a utilização de dieta normal ou dieta restrita em Phe, diferentes doses de BH₄ e diferentes pontos de hora para avaliar os níveis de Phe, por exemplo^13,27.

Resultados de diferentes estudos são difíceis de comparar, mas a redução de no mínimo 30% dos níveis de Phe é frequentemente considerada resposta clinicamente significativa ao tratamento. No entanto, é importante observar que esse limiar é arbitrário¹⁰. Para obter uma melhor compreensão sobre as práticas de diagnósticos e tratamento sobre HPA-PAH, um recente estudo foi realizado na Europa. Blau et al.²⁸ formularam um questionário constituído de 33 perguntas que foi enviado para 243 profissionais oriundos de 165 centros de PKU de 23 países da Europa. Cento e um questionários foram devolvidos de 93/165 centros de PKU (56%) de 19/23 países europeus (83%). Segundo dados do estudo, o teste de sobrecarga com BH₄ foi realizado como prática rotineira em 54% dos centros de PKU, dos quais 61% aplicaram o teste com uma dose única de BH₄ (20 mg/Kg). Quando questionados sobre como se define a responsividade ao BH₄, 34% responderam que a mesma define-se pela redução > 30% nos níveis de Phe após 24 h, seguidas de 17 e 12% na redução > 30% nos níveis de Phe após qualquer ponto de hora e 8 h após a ingestão do medicamento, respectivamente. Em relação à classificação do tipo de HPA-PAH, mais de 70% dos entrevistados classificaram PKU clássica como níveis de Phe > 20 µmol/L ao diagnóstico (sem tratamento). Entretanto, as definições para PKU leve e HPA não PKU variaram consideravelmente, não apenas entre países, mas também entre centros dentro de um mesmo país. Esses achados podem indicar a dificuldade em definir a gravidade da deficiência da PAH, demonstrando a necessidade de padronizar a classificação do tipo de HPA-PAH.

Acreditamos na necessidade de padronizar um teste único, simples e universal que facilite a identificação de responsivos ao BH₄. Esse teste deve ser prático em sua aplicação, definindo quantidade adequada a ser administrada de BH₄, consumo de Phe e pontos de hora padrões para dosagens de Phe, restringindo assim o número de mensurações dos níveis de Phe que precisam ser feitas e definindo um padrão-ouro para interpretação da responsividade ao medicamento.

Os potenciais benefícios do tratamento com BH₄ para pacientes PKU responsivos ao BH₄ incluem a redução dos níveis de Phe no sangue e restrições dietéticas menos rigorosas (como resultado do aumento da tolerância as proteínas naturais), que poderiam, consequentemente, levar a um aumento da adesão ao tratamento do paciente¹⁷. Entretanto, como esse medicamento é novo, atualmente não estão disponíveis evidências de melhor grau sobre a sua eficácia/efetividade a longo prazo para tratamento das PKU mais amenas (como tratamento único) ou da PKU clássica (como tratamento auxiliar, associado à dieta com baixo teor de Phe).

Embora limitado pelo tamanho amostral, nossos dados sugerem que, em um futuro próximo, o tratamento com o BH₄ poderá beneficiar uma parte considerável de pacientes brasileiros com HPA-PAH que sofrem com as restrições dietéticas. Isso provavelmente significará uma melhora da qualidade de vida desses pacientes, assim como uma contribuição importante para a assistência dos mesmos, podendo gerar uma melhor adesão ao tratamento. Estudos adicionais são necessários para confirmar essa hipótese.

Agradecimentos

Os autores agradecem à Merck Serono pela doação do medicamento Kuvan

^®,utilizada no estudo. Também agradecem a Juarez Huve, Cristina Netto, Carolina Fischinger M. de Souza, Lilia Farret Refosco, à Casa de Apoio do HCPA e a toda equipe do Serviço de Genética Médica do HCPA pelo apoio e colaboração nesse estudo. Esse trabalho foi apoiado pelo FIPE/HCPA (projeto n° 07-553) e pelo Conselho Nacional de Pesquisa de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq).

Artigo submetido em 25.10.10, aceito em 16.02.11.

Apoio financeiro: FIPE, CNPq e CAPES.

Não foram declarados conflitos de interesse associados à publicação deste artigo.

Como citar este artigo: Giugliani L, Sitta A, Vargas CR, Santana-da-Silva LC, Nalin T, Saraiva-Pereira ML, et al. Tetrahydrobiopterin responsiveness of patients with phenylalanine hydroxylase deficiency. J Pediatr (Rio J). 2011;87(3):245-251.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  27 Set 2011
• Data do Fascículo
  Jun 2011

Histórico

• Recebido
  25 Out 2010
• Aceito
  16 Fev 2011