Caracterização molecular de cepas de rotavírus e norovírus: um estudo de 6 anos (2004-2009)

ARTIGO ORIGINAL

Caracterização molecular de cepas de rotavírus e norovírus: um estudo de 6 anos (2004-2009)

Audrey Cilli^I; Adriana Luchs^I; Simone G. Morillo^I; Fernanda F. Costa^II; Rita de Cássia C. Carmona^III; Maria do Carmo S. T. Timenetsky^III

^IMSc. Enteric Disease Laboratory, Virology Center, Instituto Adolfo Lutz, São Paulo, SP.

^IIPublic health specialist, Enteric Disease Laboratory, Virology Center, Instituto Adolfo Lutz, São Paulo, SP.

^IIIPhD. Enteric Disease Laboratory, Virology Center, Instituto Adolfo Lutz, São Paulo, SP.

^{Correspondência}

RESUMO

OBJETIVO: Monitorar infecções causadas por rotavírus (RV) e norovírus (NoV) em crianças hospitalizadas < 5 anos com gastroenterite aguda provenientes do estado de São Paulo durante um período de 6 anos (2004-2009).

MÉTODOS: Este estudo retrospectivo foi realizado em 61 centros médicos, utilizando amostras fecais coletadas por conveniência, analisadas por ensaio imunoenzimático, eletroforese em gel de poliacrilamida, transcrição reversa seguida de reação em cadeia pela polimerase e sequenciamento para caracterização dos genótipos.

RESULTADOS: Infecções por RV e NoV foram detectadas em 29,6% (144/487) e 29,2% (26/89) das amostras, respectivamente. Os genótipos de RV detectados com maior frequência foram: G9P[8] em 2004; G1P[8] em 2005; G9P[8] em 2006; e G2P[4] durante os anos de 2007, 2008 e 2009. A taxa de detecção diminuiu de 36,3% (33/91) em 2004 para 4,2% (4/95) em 2009. NoV pertencente ao genogrupo GII foi encontrado em 61,6% (16/26) das amostras, e GI em 11,5% (3/26). Infecções mistas por NoV e RV foram observadas em 2,2% (2/89) das amostras, envolvendo as cepas GI+G9P[8] e GI+G2P[4].

CONCLUSÕES: A distribuição dos genótipos de RV variou com os anos, acompanhada pela redução no número de casos detectados. Ė necessário intensificar a vigilância pós-implantação da vacina contra RV, visando monitorar as cepas circulantes e sua eficácia contra possíveis genótipos emergentes. Os NoVs têm sido cada vez mais identificados como agentes etiológicos relevantes entre crianças hospitalizadas e exercem um papel importante na etiologia viral da gastroenterite pediátrica aguda no estado de São Paulo.

Palavras-chave: Norovírus, rotavírus, crianças, gastroenterite, Brasil.

ABSTRACT

OBJECTIVE: To monitor rotavirus (RV) and norovirus (NoV) infections in hospitalized children < 5 years with acute gastroenteritis in the state of São Paulo, Brazil, during a 6-year period (2004- 2009).

METHODS: This retrospective study was conducted with 61 medical centers with convenient surveillance fecal specimens, investigated by enzyme-linked immunosorbent assay, sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, reverse polymerase chain reaction and sequencing to genotype characterization.

RESULTS: RV and NoV infections were detected in 29.6% (144∕487) and 29.2% (26/89) of the samples, respectively. The most frequent RV genotypes detected were G9P[8] in 2004; G1P[8] in 2005; G9P[8] in 2006; and G2P[4] during 2007, 2008, and 2009. Detection rate declined from 36.3% (33∕91) in 2004 to 4.2% (4/95) in 2009. NoV genogroup GII was found in 61.6% (16/26) of the samples, and GI in 11.5% (3/26). Mixed NoV-RV infections were observed in 2.2% (2/89) of the samples, involving GI+G9P[8] and GI+G2P[4] strains.

CONCLUSIONS: Genotype distribution varied according to collection year, accompanied by a reduction in detection rate. Use of RV vaccine requires implementation of post-marketing surveillance to monitor RV strain diversity and its efficacy against possible new emerging genotypes. NoVs have been increasingly identified as relevant etiological agents among hospitalized children and play an important role in the viral etiology of pediatric acute gastroenteritis in the state of São Paulo.

Keywords: Norovirus, rotavirus, children, gastroenteritis, Brazil.

Introdução

Patógenos virais estão entre as causas mais comuns de gastroenterite em comunidades e outras localidades, incluindo instituições semifechadas e hospitais¹. Na infância, o rotavírus (RV) do grupo A é considerado o agente etiológico mais importante de gastroenterite não bacteriana aguda, incluindo surtos e casos esporádicos, independentemente das melhorias no saneamento básico e procedimentos higiênicos².

Os RV são o principal agente etiológico causador de diarreia aguda em crianças, responsáveis por mais de 600.000 óbitos por ano³, além do significativo impacto econômico causado pela doença diarreica por RV⁴. No Brasil, as infecções por RV causavam ~ 3,5 milhões de episódios de diarreia, 655.853 consultas ambulatoriais, 92.453 hospitalizações e 850 óbitos de crianças < 5 anos por ano antes da introdução da vacina contra o RV⁵.

Em 2006, uma vacina atenuada G1P[8] foi incluída no Programa Nacional de Imunização, prevenindo a gastroenterite grave por RV e induzindo uma redução significativa na frequência de detecção do RV em crianças com gastroenterite⁶. A eficácia da vacina RIX4414 foi avaliada por Araujo et al., demonstrando 53,9-81,5% de proteção contra casos graves, e 81,2-93% de proteção contra hospitalização devido à gastroenterite causada por RV em crianças⁷.

Recentemente, relatou-se uma alta prevalência de G2P[4] associada a essa vacinação no Brasil⁸, sugerindo que essa vacina monovalente possivelmente criou condições em que o genótipo G2P[4] poderia ter adquirido vantagem seletiva sobre genótipos P[8]. Morillo et al. demonstraram que o genótipo G2P[4] foi a única cepa observada em 2007 durante uma vigilância de genótipos de RV em crianças < 5 anos com gastroenterite aguda provenientes de creches no estado de São Paulo por um período de 5 anos⁹. Entretanto, investigações mais detalhadas sobre a proteção heterológica conferida pela vacina monovalente contra o RV são pontos centrais para entender seu comportamento imunológico^7,10.

Os norovírus (NoVs) são a principal causa de gastroenterite não bacteriana aguda em humanos em todo o mundo, responsáveis por 80-90% dos relatos de surtos¹¹. Embora o NoV tenha sido o primeiro vírus claramente associado à gastroenterite aguda, a impossibilidade de cultivá-lo subestimou a importância da infecção por NoV em gastroenterite aguda, e dificultou a realização de estudos epidemiológicos. Dessa forma, a importância do NoV como agente etiológico da gastroenterite aguda tanto em casos esporádicos como em surtos só pôde ser estabelecida após o desenvolvimento de métodos moleculares para a sua detecção^12,13.

Em todo o mundo, os surtos de NoV são causados principalmente por cepas pertencentes aos genogrupos I (GI) e II (GII), com predominância da cepa GII^14,15, inclusive no Brasil^12,16. Os NoVs têm sido cada vez mais identificados como agentes etiológicos importantes entre crianças hospitalizadas na Europa, na Ásia e na América. A importância relativa do NoV em gastroenterite aguda deve aumentar como decorrência da vacinação contra o RV¹⁷.

O objetivo deste estudo foi monitorar as infecções por RV e NoV entre crianças hospitalizadas < 5 anos no estado de São Paulo durante um período de 6 anos (2004-2009). A caracterização molecular dos genogrupos do NoV e dos genótipos do RV também foi realizada.

Métodos

Este estudo retrospectivo foi conduzido em 61 centros médicos entre o período de 2004 a 2009, com espécimes coletados por conveniência provenientes de crianças hospitalizadas < 5 anos que apresentavam sintomas de gastroenterite aguda. As amostras de fezes dos pacientes com gastroenterite aguda foram enviadas ao Núcleo de Doenças Entéricas do Instituto Adolfo Lutz, um centro de referência macrorregional para vigilância do RV e membro do Programa de Monitoramento das Doenças Diarreicas Agudas (PMDDA). Este programa tem por objetivo a detecção precoce de surtos de diarreia em todo o país e foi previamente aprovado pelo Comitê de Ética.

As amostras analisadas eram parte do PMDDA, obtidas a partir de uma amostragem de conveniência, sem critérios de inclusão ou exclusão e sem caracterização dos hospitais participantes. Portanto, o estudo pode não ser representativo do cenário epidemiológico real. Foi realizada a caracterização molecular dos genótipos do RV e dos genogrupos do NoV. Não foi incluída avaliação clínica dos pacientes; dessa forma, o estudo não permite avaliar a segurança, imunogenicidade ou proteção oferecida pela vacinação.

Um total de 487 amostras fecais foi testado para RV e NoV usando ensaios imunoenzimáticos comerciais (PremierTM Rotaclone^®, Meridian Bioscience Inc., EUA, e Norwalk-like virus^®, R-Biopharm AG, Alemanha, respectivamente), realizados de acordo com as instruções do fabricante. Os perfis dos RNA dupla fita (double-stranded RNA, dsRNA) dos RVs encontrados nas amostras fecais foram analisados por eletroforese em gel de poliacrilamida (polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE) corado com prata¹⁸.

O RNA fita simples do NoV e o dsRNA do RV foram extraídos com o reagente Trizol^® (Invitrogen, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. Foi realizada a transcrição reversa seguida de reação em cadeia pela polimerase (reverse transcriptase polymerase chain reaction, RT-PCR) para RV e NoV, de acordo com o protocolo previamente descrito^12,19-21.

Cinco amostras de RV foram selecionadas para sequenciamento, com a finalidade de obter dados adicionais sobre as sequências de RV e de compreender com mais clareza a variabilidade das cepas brasileiras. Os produtos da RT-PCR do gene VP7 foram purificados com o kit de purificação PureLinkTM (Invitrogen, EUA). O sequenciamento foi realizado usando o kit Big DyeTM versão 3.1 (Applied Biosystems, EUA) com primers Anti-A1 e RVG9^19,21. Os produtos foram analisados em um sequenciador automático [ABI Prism 377 (Applied Biosystems Inc., EUA)] e com o programa DNAstar. As sequências de nucleotídeos foram editadas e alinhadas com o editor de alinhamento de sequências BioEdit.

As sequências foram comparadas com outras sequências disponíveis no banco de dados GenBank. A árvore de distância foi construída utilizando o método Clustal. As sequências determinadas neste estudo foram depositadas no banco de dados GenBank com os seguintes números de acesso: R1114 (HM855236), R1112 (HM855237), R1103 (HM855238), R1102 (HM855239) e R1143 (HM855240).

Resultados

A infecção por RV foi detectada em 144 (29,6%) das 487 espécimes. Com base no padrão de migração no PAGE, uma amostra negativa pelo ensaio imunoenzimático demonstrou perfil típico de RV do grupo C, confirmado por RT-PCR para o gene VP6. A distribuição genotípica do RV mostrou um perfil diferente para cada ano. Os genótipos predominantes foram: G9P[8] (67,8%; 21/31) em 2004, G1P[8] (50%; 14/28) em 2005, G9P[8] (39,5%; 9/23) em 2006, G2P[4] (100%; 16/16) em 2007, G2P[4] (100%; 31/31) em 2008 e G2P[4] (75%; 3/4) em 2009. Foram observadas infecções mistas (G1+G9P[8]) em 2005 e 2006. A taxa de detecção foi reduzida de 36,3% (33/91) em 2004 para 4,2% (4/95) em 2009 (Tabela 1).

A Figura 1 apresenta a relação entre as sequências VP7 deste estudo [uma cepa G1 (R1143), uma cepa G2 (R1114) e três cepas G9 (R1102, R1103, R1112)] com cepas representativas dos genótipos G1 (Wa, M21843), G2 (KO2, AF401754) e G9 (Mc345, D38055). A comparação das sequências G9 mostrou similaridade de 94,6% quando comparadas com Mc345 e similaridade de 99,7% a 100% entre elas. A comparação da sequência G1 mostrou similaridade de 91,2% quando comparada à Wa, e a sequência G2 mostrou similaridade de 98% quando comparada à KO2.

Infecção por NoV foi detectada em 26 (29,2%) das 89 amostras, usando ensaios imunoenzimáticos e/ou de RT-PCR. Dezesseis (16/26; 61,6%) amostras foram identificadas como NoV pertencentes ao genogrupo GII, sete (7/26; 26,9%) como GI, e três (3/26, 11.5%) como GI+GII. Foram detectadas infecções mistas por NoV e RV em 2,2% (2/89), envolvendo as cepas GI+G9P[8] e GI+G2P[4].

Discussão

O RV é um dos principais agentes causadores de gastroenterite pediátrica em todo o mundo; no entanto, com a melhoria nas técnicas de diagnóstico molecular, a importância do NoV está se tornando mais evidente, e a detecção desses vírus associado à gastroenterite continua a aumentar⁸. Neste estudo, RVs e NoVs apresentaram uma associação similar em crianças com gastroenterite que exigem hospitalização; contudo, relatos semelhantes geralmente demonstram que o NoV é a segunda causa de hospitalização, após RV^14,15.

Os RVs com genótipo G9 e G1 foram os mais frequentes em circulação entre 2004 e 2006, correspondendo aos resultados de diversos relatos anteriores que estudaram a distribuição dos genótipos G de RV em diversos países, incluindo o Brasil^9,22-25. Os genes VP7 das cepas G9 demonstraram identidade, indicando que os genes VP7 possuem uma linhagem ancestral comum.

A detecção de G2 começou a aumentar em 2006, e esse genótipo tomou o lugar de G1 e G9 como o mais prevalente nos anos de 2007, 2008 e 2009. Recentemente, foi relatada uma alta prevalência de G2P[4] no Brasil associada ao programa de vacinação universal contra RV que utiliza uma vacina oral com o vírus RV G1P[8] atenuado^8,26, sugerindo que essa vacina monovalente possivelmente criou condições em que o G2P[4] poderia ter adquirido uma vantagem seletiva sobre genótipos P[8]. No entanto, uma periodicidade temporal, dentro de um padrão cíclico do G2P[4] de ~ 10 anos, foi observada no Brasil²², e deve ser considerada como uma explicação alternativa para o aumento na taxa de detecção desse genótipo desde 2006. O genótipo G2P[4] também foi a cepa mais prevalente de RV detectado em 2007 no noroeste de Portugal, uma população que não havia recebido vacina contra RV²⁷, assim como em outros estudos conduzidos em populações não vacinadas^28,29.

Quanto aos períodos pré e pós-vacinação, as mudanças na distribuição de genótipos encontradas são acompanhadas por uma redução na taxa de detecção de RV. Essa redução foi observada no número de surtos por RV notificados no estado de São Paulo, que diminuiu progressivamente de 35 (10.481 casos) em 2004; 24 (3.144 casos) em 2005; 35 (2.084 casos) em 2006; oito (164 casos) em 2007; um (três casos) em 2008; para nenhum em 2009³⁰.

A frequência da infecção por NoV em crianças detectada neste trabalho (29,2%) foi mais baixa do que a observada em um estudo realizado na Alemanha (35%), mas é semelhante à frequência encontrada na Finlândia durante os anos de 2001 e 2002 (29%)¹⁴. Estudos prévios conduzidos em diferentes estados do Brasil demonstraram que a prevalência do NoV entre crianças hospitalizadas varia de 9 a 36%^11,31-33.

Os dados sobre pacientes pediátricos hospitalizados na Itália³⁴, na Alemanha¹⁴ e no Brasil^2,33 demonstraram a prevalência do NoV do genogrupo GII. Este estudo revelou uma preponderância do GII, confirmando que esse genogrupo específico é o mais frequentemente associado a doenças causadas por NoV em todo o mundo, em comparação com o GI^12,14. As consequências epidemiológicas desse achado ainda não estão claras; estudos sobre as possíveis diferenças nas propriedades biológicas, tais como virulência, vias de transmissão, estabilidade do vírus no ambiente devem fornecer explicações sobre o tema¹⁴.

Neste estudo, ocorreram coinfecções entre NoV GI e RV G9/G2. Infecções duplas envolvendo vírus entéricos são relativamente comuns em casos de gastroenterite aguda, o que indica um alto índice de exposição a uma variedade de patógenos entéricos¹⁴. No entanto, existem poucos relatos disponíveis sobre coinfecção por NoV e RV: 1% no Japão¹⁵, 2,1% na Alemanha¹⁴, e 1,9% na Itália³⁴. No Brasil, Victoria et al. relataram um índice de 4% de infecção dupla devido a RV e NoV em crianças hospitalizadas no estado do Rio de Janeiro³³. Considerando-se a diversidade de vírus e genótipos circulantes nas comunidades, esperava-se encontrar números mais elevados de infecções mistas; contudo, essas taxas parecem ser menores na população brasileira.

A introdução da vacina contra RV foi provavelmente o fato que mais influenciou a tendência de redução nas hospitalizações por gastroenterite desde 2006³⁵. A frequência da infecção por NoV indica que o NoV é um fator importante na etiologia viral da gastroenterite pediátrica aguda no estado de São Paulo. Um melhor entendimento da epidemiologia das infecções por NoV será necessário para avaliar o papel dessas infecções entre as crianças brasileiras e monitorar o impacto do programa de vacinação contra RV.

Artigo submetido em 07.04.11, aceito em 15.06.11.

Não foram declarados conflitos de interesse associados à publicação deste artigo.

Como citar este artigo: Cilli A, Luchs A, Morillo SG, Costa FF, Carmona RC, Timenetsky MCST. Characterization of rotavirus and norovirus strains: a 6-year study (2004-2009). J Pediatr (Rio J). 2011;87(5):445-9.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  01 Nov 2011
• Data do Fascículo
  Out 2011

Histórico

• Recebido
  07 Abr 2011
• Aceito
  15 Jun 2011