Análise do potencial citotóxico agudo da bupivacaína e bupivacaína em excesso enantiomerico de 50% (S75-R25) incorporadas a microesferas sobre o nervo ciático de ratos

Resumos

JUSTIFICATIVA Y OBJETIVOS: La duración del efecto de los anestésicos locales (AL), puede ser ampliada por su incorporación a los sistemas de liberación prolongada como microesferas. Sin embargo, la posibilidad de que los sistemas de liberación prolongada de AL sean neurotóxicos, no ha recibido la debida atención en la literatura. Este estudio tuvo el objetivo de investigar los efectos de microesferas de ácido poliláctico-co-glicólico puras, rellenados con bupivacaína en exceso enantiomérico de 50% o con bupivacaína (BP), como también los efectos de la bupivacaína en exceso enantiomérico de 50% en nervio ciático de ratones Wistar. MÉTODO: Los ratones se dividieron en cuatro grupos de acuerdo con el tiempo de evaluación (dos, cuatro, seis y ocho días), y fueron denominados conforme a la solución inyectada sobre el nervio ciático: microesferas con bupivacaína en exceso enantiomérico de 50% (MBE), microesferas con bupivacaína (MB); microesferas puras (MP) y bupivacaína en exceso enantiomérico de 50% (BE). RESULTADOS: En los cortes semifinos se observó la distribución regular homogénea en las fibras de colágeno en el endoneuro y no se comprobó ninguna alteración degenerativa de los axones o de las vainas de mielina. En los cortes ultrafinos fueron observados axones mielinizados y fibras de Remak de aspecto normal con axoplasma presentando una distribución homogénea de neurofilamentos y microtúbulos. El análisis histomorfométrico de los axones no reveló diferencias significativas entre los diámetros de los axones de los grupos estudiados.

ANESTÉSICOS; ANESTÉSICOS; ANESTÉSICOS; toxicidad; ANIMALES

BACKGROUND AND OBJECTIVES: The duration of Local Anesthetic (LA) effects can be expanded by its incorporation into systems of sustained release microspheres. However, the possibility that LA sustained release systems are neurotoxic has not received due attention in literature. The objective of this study was to investigate the effects of pure microspheres of poly(lactic-co-glycolic acid), filled with 50% enantiomeric excess bupivacaine or bupivacaine (BP), as well as the effects of 50% enantiomeric excess bupivacaine in the sciatic nerve of Wistar rats. METHODS: The rats were allocated into four groups according to the evaluation time (two, four, six, and eight days) and nominated according to the injected solution on the sciatic nerve: Microspheres with 50% Enantiomeric excess Bupivacaine (MEB), Microspheres with Bupivacaine (MB), Pure Microspheres (PM), and 50% Enantiomeric excess Bupivacaine (EB). RESULTS: In semi-fine histologic sections, no regular homogeneous distribution of collagen fibers in the endoneurium or degenerative changes of axons and myelin sheaths were observed. In ultrathin sections, we found myelinated axons and normal Remak fibers with axoplasm showing homogeneous distribution of neurofilaments and microtubules. Histomorphometric analysis of axons revealed no significant difference between the axon diameters of the studied groups.

Anesthetics; Bupivacaine; Microscopy; Microscopy; Microspheres; Rats; Stereoisomerism

ARTIGOS CIENTÍFICOS

Análise do potencial citotóxico agudo da bupivacaína e bupivacaína em excesso enantiomerico de 50% (S75-R25) incorporadas a microesferas sobre o nervo ciático de ratos

Pedro Paulo Tanaka^I; Maria Fernanda Torres^II; Sergio Bernardo Tenorio^III

^IDoutor; Professor associado, Universidade Federal do Paraná (UFPR)

^IIProfessora Adjunta, UFPR

^IIIProfessor Adjunto, Disciplina Anestesiologia, UFPR; Chefe do Serviço de Anestesiologia da UFPR

^{Correspondência para}

RESUMO

JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS: A duração do efeito dos anestésicos locais (AL) pode ser ampliada pela sua incorporação aos sistemas de liberação prolongada como microesferas. No entanto, a possibilidade de que os sistemas de liberação prolongada de AL sejam neurotóxicos não tem recebido a devida atenção na literatura. Este estudo teve o objetivo de investigar os efeitos de microesferas de ácido poliláctico-co-glicólico puras, preenchidas com bupivacaína em excesso enantiomérico de 50% ou com bupivacaína (BP), assim como os efeitos da bupivacaína em excesso enantiomérico de 50% em nervo ciático de ratos Wistar.

MÉTODO: Os ratos foram alocados em quatro grupos de acordo com o tempo de avaliação (dois, quatro, seis e oito dias) e denominados conforme a solução injetada sobre o nervo ciático: microsferas com bupivacaína em excesso enantiomérico de 50% (MBE), microesferas com bupivacaína (MB); microesferas puras (MP) e bupivacaína em excesso enantiomérico de 50% (BE).

RESULTADOS: Nos cortes histológicos semifinos observou-se distribuição regular homogênea nas fibras de colágeno no endoneuro e nenhuma alteração degenerativa dos axônios ou das bainhas de mielina foi constatada. Nos cortes ultrafinos foram observados axônios mielinizados e fibras de Remak de aspecto normal com axoplasma apresentando distribuição homogênea de neurofilamentos e microtúbulos. A análise histomorfométrica dos axônios não revelou diferença significativa entre os diâmetros dos axônios dos grupos estudados.

Unitermos: ANESTÉSICOS, Local, bupivacaína, bupivacaína (S75-R25), toxicidade; ANIMAL, Rato.

INTRODUÇÃO

A administração de anestésico local (AL) diretamente sobre nervos ou troncos nervosos para bloquear a percepção da dor pelo paciente é uma técnica eficaz. Os mecanismos fisiológicos da neurotoxicidade causada pelos AL foram relacionados à inibição do transporte axonal, desestabilização do citoesqueleto axonal, degeneração axonal e isquemia neural ¹. No entanto, poucos estudos descreveram o mecanismo responsável pela injúria e se a injúria é causada direta ou indiretamente pelo AL.

Alguns autores ² comprovaram que concentrações maiores de lidocaína e bupivacaína (BP) promovem bloqueio mais duradouro em nervos ciáticos de ratos, no entanto, são claramente neurotóxicas sob análise histopatológica. Esses resultados sugerem a existência de uma relação entre tempo prolongado de anestesia e lesão neurotóxica.

Estudos investigaram a farmacodinâmica e farmacocinética da intoxicação aguda provocada por ALs e, apesar de existirem relatos na literatura sobre neurotoxicidade ¹, não existem estudos experimentais in vivo sobre o uso de microesferas de bupivacaína em excesso enantiomérico de 50% (S75-R25), bem como da avaliação morfológica dos efeitos neurotóxicos desse anestésico por microscopia óptica (MO) ou eletrônica (ME).

Este estudo teve o objetivo de investigar os efeitos citotóxicos das microesferas de ácido poliláctico-co-glicólico puras em nervo ciático de ratos Wistar, preenchidas com bupivacaína em excesso enantiomérico de 50% (S75-R25) e com BP, assim como da bupivacaína em excesso enantiomérico de 50% (S75-R25).

MÉTODOS

A população da pesquisa foi constituída por 16 ratos Wistar machos com, aproximadamente, três meses de idade e 300 g de peso médio, provenientes do Biotério da Universidade Positivo. Durante todo o período de experimentação, os animais foram mantidos em sala climatizada (temperatura média de 22ºC) com fotoperíodo de 12 horas, livre acesso à água e à ração. O projeto deste estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética no Uso de Animais da Universidade Positivo.

Os experimentos foram realizados em ambiente tranquilo e conduzidos por um mesmo pesquisador que desconhecia a droga injetada. Os ratos foram separados em quatro grupos de quatro animais denominados de acordo com a solução injetada sobre o nervo ciático em: microsferas com bupivacaína em excesso enantiomérico de 50% (MBE), microesferas com bupivacaína (MB); microesferas puras (MP), e bupivacaína em excesso enantiomérico de 50% (BE).

Após a anestesia dos ratos pela vaporização de halotano entre 2% a 4% em oxigênio por máscara facial, foi possível a manipulação para injeção da solução diretamente sobre o nervo ciático.

Após o 2º, 4º, 6º e 8º dias da aplicação das soluções, os animais foram eutanasiados por injeção intraperitoneal de Tiopental 2,5% e, em seguida, a extremidade proximal do nervo ciático foi dissecada e fixada em solução de glutaraldeído 3% em tampão cacodilato 0,4 M e encaminhada para processamento no Centro de Microscopia Eletrônica da Universidade Federal do Paraná (UFPR).

A avaliação do potencial neurotóxico da droga foi feita em MO e ME de transmissão (MET) investigando-se: desmielinização, degeneração axonal e sinais de inflamação evidenciados por infiltração de células inflamatórias.

Os cortes semifinos (0,5 µm) foram corados pelo azul de toluidina e os campos que apresentaram boa qualidade de imagem foram fotografados e submetidos à histomorfometria pela aplicação do programa Image Pro Plus versão 4,5. Realizou-se a medição do diâmetro de 10 axônios por campo fotografado totalizando o registro do diâmetro de 100 axônios por nervo.

Os cortes ultrafinos (70 nm) foram corados com Uranila a 2% e solução de Reynolds para posterior análise no microscópio JEOL JEM - 1.200 EX II do Centro de Microscopia Eletrônica da UFPR.

Os resultados obtidos pela histomorfometria dos nervos ciáticos foram comparados dois a dois por meio do teste não paramétrico de Mann-Whitney. O nível de significância considerado foi de 0,05, sendo corrigido por Bonferroni. Em função de serem efetuadas seis comparações dos grupos dois a dois, serão consideradas diferenças significativas aquelas para os quais o valor de p for menor que 0,008.

RESULTADOS

Este estudo apresenta uma análise sistemática dos efeitos toxicológicos sobre o sistema nervoso periférico entre os grupos estudados entre as soluções aplicadas sobre nervo ciático de ratos Wistar. Utilizou-se a MET para a análise ultraestrutural de nervo ciático de ratos Wistar em busca de evidências sobre o efeito neurotóxico desses AL e das próprias microesferas. Aliada à análise ultraestrutural foi realizada histomorfometria sob microscopia de luz em busca de diferenças entre os diâmetros dos axônios que pudessem ser interpretadas como alteração neurotoxicológica.

Nos cortes semifinos de todos os grupos e em todos os tempos estudados (2, 4, 6 e 8 dias), ilustrados na Figura 1, são observadas fibras de aspecto normal dentro dos fascículos. Pode-se ver axônios com diâmetro pequeno, com uma bainha de mielina fina, e axônios maiores com bainha de mielina espessa. Há uma distribuição regular homogênea nas fibras de colágeno no endoneuro. Não são observadas alterações degenerativas dos axônios ou das bainhas de mielina. Em vários cortes semifinos foram observados mastócitos. Não foram observadas células inflamatórias no endoneuro ou no perineuro. O aspecto desarranjado de algumas bainhas de mielina é interpretado como artefato de processamento.

Nos cortes ultrafinos em todos os grupos de todos os tempos (2, 4, 6 e 8 dias), ilustrados na Figura 2, são observados axônios mielinizados de aspecto normal e axônios não mielinizados envolvidos por células de Schwann em estruturas designadas como fibras de Remak. O axoplasma contém uma distribuição homogênea de neurofilamentos e microtúbulos com ocasionais mitocôndrias. Em alguns cortes, são visualizados núcleos das células de Schwann associadas com o internodo de mielina e com as fibras de Remak. É constatada a presença de fibroblastos e mastócitos no endoneuro. Em todos os cortes examinados, são conspícuas as fibras de colágeno em contato com a membrana basal das células de Schwann.

Os cortes semifinos dos nervos ciáticos de cada rato foram fotografados e submetidos à análise histomorfométrica com auxílio do programa Image Pro Plus versão 4,5. Em cada nervo ciático foram registrados os diâmetros de 100 axônios, considerando-se como critério de seleção do axônio a coloração e o posicionamento central dos axônios no campo fotografado. Para a análise estatística, foi considerada a média das 100 medidas obtidas em cada rato.

Testou-se a hipótese nula de resultados iguais nos dois grupos sob comparação, versus a hipótese alternativa de resultados diferentes. A Tabela I apresenta os diâmetros mínimo, máximo e médio dos axônios, considerando as 100 medições para cada um dos ratos. Nota-se que um dos ratos do grupo M apresentou a menor média do grupo. Observa-se também que o grupo M apresentou uma maior dispersão dos resultados.

Na Tabela II são apresentados os valores de p das comparações dos grupos dois a dois. Testou-se a hipótese nula de resultados iguais nos dois grupos sob comparação, versus a hipótese alternativa de resultados diferentes.

DISCUSSÃO

A toxicidade da BP para os sistemas nervoso central e cardiovascular levou à pesquisa de novos ALs com perfil semelhante de bloqueio e menos tóxicos, surgindo novas preparações como a bupivacaína em excesso enantiomérico de 50%. Em estudo sobre a avaliação da eficácia do bloqueio de nervo ciático de camundongos ³, a mistura enantiomérica de BP (S75-R25) foi considerada como uma alternativa para o desenvolvimento de formulações de liberação controlada mais seguras e eficazes do que a BP (S50-R50).

Pesquisas com formulações de AL de liberação controlada têm mostrado resultados promissores. Apesar dos grandes avanços no desenvolvimento dessas formulações, ainda são necessários estudos para a avaliação da neurotoxicidade local de forma a garantir sua utilização segura na rotina clínica ⁴.

O uso de um número pequeno de animais (n = 16) deve-se a vários fatores: por um lado as limitações decorrentes das novas diretrizes de bem-estar animal e, por outro, as limitações financeiras que um estudo com a metodologia desenvolvida exige.

O nervo ciático é o ponto de partida para o estudo in vivo de AL compondo com as investigações in vitro os requisitos da fase pré-clínica de novos compostos, antes das fases de investigação no ser humano ⁵. O nervo ciático de rato é um modelo experimental mamífero bem-estabelecido para pesquisas sobre toxicologia de nervo periférico ⁶.

A metodologia da injeção foi adequada porque, após a recuperação da capacidade proprioceptiva do membro anestesiado, os animais não mostraram sequelas motoras ou sensoriais. Objetivos estes que fizeram parte de estudo realizado em paralelo no mesmo grupo de animais ⁷.

É imperativo que uma droga seja testada para neurotoxicidade periférica empregando-se técnicas neuropatológicas estabelecidas com maiores sensibilidade e resolução que as preparações de parafina coradas com hematoxilina e eosina.

Embora seja útil para a avaliação de alterações histológicas mais evidentes, a MO pode ocultar alterações recentes entre os axônios, células de Schwann e mielina que indiquem mecanismos neurotoxicológicos ⁸.

A comprovação de alterações estruturais induzidas por drogas depende da análise ultraestrutural. A escolha do estudo por análise de cortes semifinos e ultrafinos pode ser considerada a mais apropriada, pois muitas vezes, as alterações clínicas não correspondem com as alterações histológicas, ou são muito tênues, portanto, somente o estudo ultraestrutural permite observar lesões discretas ^9-10.

Tendo em vista a necessidade de uma análise criteriosa em busca de lesão axonal e desmielinização, o presente estudo apresenta a avaliação da ultraestrutura de nervos ciáticos.

A microscopia eletrônica foi indicada como um teste mais sensível capaz de diferenciar lesões neurotóxicas ultraestruturais ². Ao avaliar os efeitos neurotóxicos de seis formulações lipídicas de depósito diferentes constituídas por uma mistura de BP e lidocaína sobre nervo ciático de ratos, observou-se, através de MO, tumefação axonal, degeneração neuronal e desmielinização em nervos anestesiados com 64% de BP e lidocaína na proporção de 4:1. Apesar desses achados, concluiu-se que a BP pode ser usada como composto ativo de formulações de depósito e sugeriu-se que o seu potencial neurotóxico deve ser avaliado por testes mais sensíveis, tal como a MET.

Em nenhuma das amostras deste estudo apresentou sinal de neurotoxicidade quando analisadas tanto por MO quanto por ME.

O processo patológico indicativo de neurotoxicidade mais mencionado na literatura é a degeneração walleriana que foi descrita pela primeira vez por Augustus Waller em 1850. É um processo complexo desencadeado por uma injúria ao axônio e resulta na degeneração do axônio e das suas células de suporte, conjunto conhecido como fibra nervosa. Inicialmente, ocorre agrupamento de organelas e outras estruturas do axoplasma, evoluindo o edema do axônio e desintegração. A mielina se desintegra e, depois, é fagocitada pelas células de Schwann e por macrófagos que são recrutados em grande número, em resposta ao aumento do fator de necrose tumoral e de proteínas pró-inflamatórias ⁸.

Um aumento da permeabilidade da barreira hematoneural provocados pelos ALs pode aumentar a osmolaridade do fluido intersticial, levando à redução do tamanho dos axônios ou à alteração dos gradientes de concentração dos íons inorgânicos e, consequentemente, à diminuição da condução nervosa ¹.

Neste estudo, foi considerada a hipótese de que a presença das microesferas e a liberação lenta do AL causariam alteração da permeabilidade dos vasos sanguíneos locais, tornando-os mais permeáveis e permitindo o extravasamento de proteínas osmoticamente ativas que normalmente não são encontradas próximas ao endoneuro e que poderiam atrair água e limitar, dessa forma, o espaço dos axônios e células endoneurais. Nas imagens de ME, contudo, não foi vista distensão do espaço interaxonal e intercelular no endoneuro, que caracterizaria o extravasamento de plasma.

Alguns autores ¹¹ implantaram matriz com microesferas no tecido subcutâneo de ratos Wistar e observaram que as microesferas começaram a se degradar 15 dias após a aplicação do implante. No entanto, no presente estudo, nenhuma microesfera foi observada sobre os nervos ciáticos estudados, indicando que as microesferas depositadas já estavam degradadas dois dias após a sua aplicação. Uma razão para essa discordância reside na matriz utilizada na produção das microesferas.

Ao contrário da instabilidade da bainha de mielina demonstrada através de ME e raio-X por Mateu e col. ¹² após a aplicação de tetracaína sobre nervo óptico e ciático isolado de ratos, neste estudo não foram evidenciadas alterações nas células de Schwann, que incluem: vacuolização e desintegração citoplasmáticas e acúmulo de gotículas de gordura no citoplasma indicativas de interrupção do metabolismo lipídico.

A possibilidade de reação inflamatória causada por procedimento cirúrgico foi afastada deste estudo considerando que a aplicação das microesferas e da bupivacaína em excesso enantiomérico de 50% foi por injeção transcutânea.

Nenhuma alteração estrutural foi observada no presente estudo após a aplicação extraneural de microesferas contendo BP e BP em excesso enantiomérico de 50%. Em outro estudo ¹³ também não foram encontradas anormalidades na investigação dos efeitos neurotoxicológicos da amitriptilina e da BP em nervo ciático de rato. As amostras que foram retiradas após 1, 3, 5 e 7 dias da da aplicação das drogas foram analisadas sob MO e apresentavam epineuro e endoneuro intactos, fibras nervosas organizadas, poucas células inflamatórias e insignificante degeneração walleriana.

Os ALs empregados no presente estudo, livres ou incorporados às microesferas, bem como as próprias microesferas, não induziram alterações histológicas ou ultraestruturais nos nervos ciáticos avaliados. Nas imagens obtidas, as estruturas nervosas (fibras, células e espaço extracelular) não mostraram alterações: os axônios apresentaram distribuição homogênea de componentes do citoesqueleto (microtúbulos e microfilamentos), indicando que a difusão das moléculas ocorria normalmente. As células de Schwann não mostraram sinais de intoxicação que poderiam ser visualizados sob a forma de edema do citoplasma e rejeição das bainhas. Contudo, convém apontar que, as células de Schwann são elementos muito resistentes que se recuperam rapidamente de uma agressão, independentemente do agente agressor ¹⁴. Os ratos eutanasiados nos tempos estudados (2, 4, 6 e 8 dias pós-injeção) não apresentaram alteração dessas células.

As bainhas de mielina apresentaram aspecto normal com eventuais deformidades explicadas como decorrentes de artefato de processamento. O sistema nervoso periférico, embora com características diferentes do sistema nervoso central (notadamente pela presença de matriz extracelular colagênica no primeiro), é um tecido delicado. Isto significa que a manipulação pode induzir artefatos nas bainhas e nos fascículos, o que dificulta a interpretação das imagens ¹⁵.

Em vários cortes semifinos e ultrafinos foram visualizados fibroblastos e feixes de fibras colágenas, o que caracteriza a morfologia normal do nervo. Também foram observados ocasionais mastócitos repletos de grânulos. Em qualquer tipo de agressão aos nervos periféricos, os mastócitos proliferam, sem que se conheça ainda a real causa dessa proliferação e a função que ela desempenharia ¹⁴. Nos cortes analisados, não foi detectada proliferação dessas células.

Em nenhum dos cortes foi observada a presença de células inflamatórias que seriam abundantes no caso de lesão aos axônios ou à mielina ¹⁶. A ausência de alterações observáveis na ultraestrutura até o 8º dia pós-injeção sugere que não haverá alterações quando da aplicação a longo prazo dos mesmos anestésicos.

No entanto, os resultados obtidos com uma droga devem ser cuidadosamente extrapolados para outra mesmo que sejam estruturalmente semelhantes ¹⁷. Além disso, múltiplos fatores interferem na liberação do AL pela microesfera polimérica como a natureza e o peso molecular do polímero.

Considerando que um dos sinais da injeção intraneural acidental é a resistência à introdução da agulha ou aumento da pressão necessária para a injeção do AL, é possível afastar a hipótese de ter ocorrido esse tipo de falha técnica no presente experimento uma vez que o anestesiologista não relatou tais ocorrências. Além disso, nenhuma amostra desse estudo apresentou evidências de degeneração walleriana das fibras dentro dos fascículos ou do perineuro. Apenas injeções com alta pressão causariam déficit neurológico detectável e alterações histológicas da lesão aos fascículos.

O objetivo da histomorfometria foi mensurar possíveis alterações do diâmetro dos axônios considerando que o início do processo de degeneração walleriana provoca edema inicial e posterior desintegração axonal.

A análise histomorfométrica dos axônios revelou uma tendência à diferença significativa entre os grupos BE e MP em função da dificuldade encontrada para obter cortes transversais homogêneos dos axônios (visível nas imagens selecionadas). Pode-se observar que, em alguns cortes semifinos, a orientação axonal foi oblíqua, o que levou a uma distorção no resultado das medições. Uma maneira de minimizar as consequências de uma análise tendenciosa devido às diferentes apresentações dos axônios seria o estudo individual da relação diâmetro do axônio/espessura da bainha de mielina.

Nas condições deste estudo, a aplicação aguda de microesferas com bupivacaína e bupivacaína em excesso enantiomérico de 50% sobre nervo ciático de ratos Wistar não apresentou efeitos deletérios aos nervos. Da mesma forma, as microesferas puras e a bupivacaína em excesso enantiomérico de 50% não provocaram alterações ultraestruturais dos nervos estudados.

CONCLUSÃO

Em nenhum dos grupos foram observadas alterações histopatológicas dos axônios e da mielina, indicando que não houve inflamação. Concluiu-se que, nas condições deste estudo, a aplicação de microesferas com BP e BP em excesso enantiomérico de 50% sobre o nervo ciático de ratos Wistar não causa alterações neurotóxicas diretas.

Submetido em 22 de maio de 2011

Aprovado para publicação em 19 de junho de 2011

Recebido da Universidade Federal do Paraná (UFPR), Brasil.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  23 Mar 2012
• Data do Fascículo
  Abr 2012

Histórico

• Recebido
  22 Maio 2011
• Aceito
  19 Jun 2011