Análisis del potencial citotóxico agudo de la bupivacaína y bupivacaína en exceso enantiomérico de 50% (S75-R25) incorporadas a microesferas sobre el nervio ciático de ratones

Resúmenes

JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS: A duração do efeito dos anestésicos locais (AL) pode ser ampliada pela sua incorporação aos sistemas de liberação prolongada como microesferas. No entanto, a possibilidade de que os sistemas de liberação prolongada de AL sejam neurotóxicos não tem recebido a devida atenção na literatura. Este estudo teve o objetivo de investigar os efeitos de microesferas de ácido poliláctico-co-glicólico puras, preenchidas com bupivacaína em excesso enantiomérico de 50% ou com bupivacaína (BP), assim como os efeitos da bupivacaína em excesso enantiomérico de 50% em nervo ciático de ratos Wistar. MÉTODO: Os ratos foram alocados em quatro grupos de acordo com o tempo de avaliação (dois, quatro, seis e oito dias) e denominados conforme a solução injetada sobre o nervo ciático: microsferas com bupivacaína em excesso enantiomérico de 50% (MBE), microesferas com bupivacaína (MB); microesferas puras (MP) e bupivacaína em excesso enantiomérico de 50% (BE). RESULTADOS: Nos cortes histológicos semifinos observou-se distribuição regular homogênea nas fibras de colágeno no endoneuro e nenhuma alteração degenerativa dos axônios ou das bainhas de mielina foi constatada. Nos cortes ultrafinos foram observados axônios mielinizados e fibras de Remak de aspecto normal com axoplasma apresentando distribuição homogênea de neurofilamentos e microtúbulos. A análise histomorfométrica dos axônios não revelou diferença significativa entre os diâmetros dos axônios dos grupos estudados.

ANESTÉSICOS; ANESTÉSICOS; ANESTÉSICOS; ANESTÉSICOS; ANIMAL

BACKGROUND AND OBJECTIVES: The duration of Local Anesthetic (LA) effects can be expanded by its incorporation into systems of sustained release microspheres. However, the possibility that LA sustained release systems are neurotoxic has not received due attention in literature. The objective of this study was to investigate the effects of pure microspheres of poly(lactic-co-glycolic acid), filled with 50% enantiomeric excess bupivacaine or bupivacaine (BP), as well as the effects of 50% enantiomeric excess bupivacaine in the sciatic nerve of Wistar rats. METHODS: The rats were allocated into four groups according to the evaluation time (two, four, six, and eight days) and nominated according to the injected solution on the sciatic nerve: Microspheres with 50% Enantiomeric excess Bupivacaine (MEB), Microspheres with Bupivacaine (MB), Pure Microspheres (PM), and 50% Enantiomeric excess Bupivacaine (EB). RESULTS: In semi-fine histologic sections, no regular homogeneous distribution of collagen fibers in the endoneurium or degenerative changes of axons and myelin sheaths were observed. In ultrathin sections, we found myelinated axons and normal Remak fibers with axoplasm showing homogeneous distribution of neurofilaments and microtubules. Histomorphometric analysis of axons revealed no significant difference between the axon diameters of the studied groups.

Anesthetics; Bupivacaine; Microscopy; Microscopy; Microspheres; Rats; Stereoisomerism

ARTÍCULOS CIENTÍFICOS

^IDoctor; Profesor asociado, Universidad Federal de Paraná (UFPR)

^IIProfessora Adjunta, UFPR

^IIIProfesor Adjunto, Asignatura de Anestesiologia, UFPR; Jefe del Servicio de Anestesiología de la UFPR

Correspondencia para

RESUMEN

JUSTIFICATIVA Y OBJETIVOS: La duración del efecto de los anestésicos locales (AL), puede ser ampliada por su incorporación a los sistemas de liberación prolongada como microesferas. Sin embargo, la posibilidad de que los sistemas de liberación prolongada de AL sean neurotóxicos, no ha recibido la debida atención en la literatura. Este estudio tuvo el objetivo de investigar los efectos de microesferas de ácido poliláctico-co-glicólico puras, rellenados con bupivacaína en exceso enantiomérico de 50% o con bupivacaína (BP), como también los efectos de la bupivacaína en exceso enantiomérico de 50% en nervio ciático de ratones Wistar.

MÉTODO: Los ratones se dividieron en cuatro grupos de acuerdo con el tiempo de evaluación (dos, cuatro, seis y ocho días), y fueron denominados conforme a la solución inyectada sobre el nervio ciático: microesferas con bupivacaína en exceso enantiomérico de 50% (MBE), microesferas con bupivacaína (MB); microesferas puras (MP) y bupivacaína en exceso enantiomérico de 50% (BE).

RESULTADOS: En los cortes semifinos se observó la distribución regular homogénea en las fibras de colágeno en el endoneuro y no se comprobó ninguna alteración degenerativa de los axones o de las vainas de mielina. En los cortes ultrafinos fueron observados axones mielinizados y fibras de Remak de aspecto normal con axoplasma presentando una distribución homogénea de neurofilamentos y microtúbulos. El análisis histomorfométrico de los axones no reveló diferencias significativas entre los diámetros de los axones de los grupos estudiados.

Descriptores: ANESTÉSICOS, Local, bupivacaína, bupivacaína (S75-R25), toxicidad; ANIMALES, Ratón.

INTRODUCCIÓN

La administración de anestésico local (AL) directamente sobre los nervios o troncos nerviosos para bloquear la percepción del dolor por el paciente, es una técnica eficaz. Los mecanismos fisiológicos de la neurotoxicidad causada por los ALs, fueron relacionados con la inhibición del transporte axonal, desestabilización del citoesqueleto axonal, degeneración axonal e isquemia neural ¹. Sin embargo, pocos estudios han descrito el mecanismo responsable por el traumatismo y si el traumatismo es causado directa o indirectamente por el AL.

Algunos autores ² comprobaron que concentraciones mayores de lidocaína y bupivacaína (BP) generan un bloqueo más duradero en los nervios ciáticos de los ratones, sin embargo, son claramente neurotóxicas bajo el análisis histopatológico. Esos resultados sugieren la existencia de una relación entre el tiempo prolongado de anestesia y la lesión neurotóxica.

Algunos estudios han investigado la farmacodinámica y la farmacocinética de la intoxicación aguda provocada por ALs, y pese a que existen relatos en la literatura sobre la neurotoxicidad ¹, no existen estudios experimentales in vivo sobre el uso de microesferas de bupivacaína en exceso enantiomérico de 50% (S75-R25), como tampoco de la evaluación morfológica de los efectos neurotóxicos de ese anestésico por microscopía óptica (MO) o electrónica (ME).

Este estudio quiso investigar los efectos citotóxicos en el nervio ciático de ratones Wistar de las microesferas de ácido poliláctico-co-glicólico puras, rellenas con bupivacaína en exceso enantiomérico de 50% (S75-R25) y con BP, como también de la bupivacaína en exceso enantiomérico de 50% (S75-R25).

MÉTODOS

La población de la investigación se constituyó de 16 ratones Wistar machos con aproximadamente tres meses de edad y 300 g de peso promedio, provenientes del Criadero de la Universidade Positivo. Durante todo el período de experimentación, los animales fueron mantenidos en una sala climatizada (temperatura promedio de 22ºC), con fotoperíodo de 12 horas con libre acceso al agua y al pienso. El proyecto de este estudio se sometió a la apreciación y aprobación del Comité de Ética en el Uso de Animales de la Universidade Positivo.

Los experimentos fueron realizados en un ambiente tranquilo y fueron llevados a cabo por el mismo investigador que no conocía el fármaco inyectado. Los ratones fueron divididos en 4 grupos de 4 animales denominados de acuerdo con la solución inyectada sobre el nervio ciático en: microesferas con bupivacaína en exceso enantiomérico de 50% (MBE), microesferas con bupivacaína (MB); microesferas puras (MP), y bupivacaína en exceso enantiomérico de 50% (BE).

Después de la anestesia de los ratones por vaporización de halotano entre el 2% y el 4% en oxígeno por máscara facial, se pudo hacer la manipulación para la inyección de la solución directamente sobre el nervio ciático.

Después de 2º, 4º, 6º y 8º días de la aplicación de las soluciones, los animales fueron sacrificados por inyección intraperitoneal de Tiopental al 2,5% y enseguida, la extremidad proximal del nervio ciático se disecó y se introdujo en una solución de glutaraldehido al 3% en tapón cacodilato 0,4 M y fue derivada para el procesamiento en el Centro de Microscopía Electrónica de la Universidad Federal de Paraná (UFPR).

La evaluación del potencial neurotóxico del fármaco se hizo en MO y MET investigando: desmielinización, degeneración axonal y signos de inflamación evidenciados por infiltración de células inflamatorias.

Los cortes semifinos (0,5 µm) se coloraron por el azul de toluidina y los campos que tienen una buena calidad de imagen se fotografiaron y sometieron a la histomorfometría por la aplicación del programa Image Pro Plus versión 4,5. Se realizó la medición del diámetro de 10 axones por campo fotografiado totalizando el registro del diámetro de 100 axones por nervio.

Los cortes ultrafinos (70 nm) fueron colorados con Uranila al 2% y solución de Reynolds para posterior análisis en microscopio JEOL JEM - 1.200 EX II del Centro de Microscopía Electrónica de la UFPR.

Los resultados obtenidos por la histomorfometría de los nervios ciáticos fueron comparados dos a dos por medio del test no paramétrico de Mann-Whitney. El nivel de significancia considerado fue de 0,05, siendo corregido por Bonferroni. En función de haberse hecho seis comparaciones de los grupos dos a dos, serán consideradas las diferencias significativas aquellas para las cuales el valor de p es menor que 0,008.

RESULTADOS

Este estudio presenta un análisis sistemático de los efectos toxicológicos sobre el sistema nervioso periférico entre los grupos estudiados entre las soluciones aplicadas sobre el nervio ciático de ratones Wistar. Usamos la MET para el análisis ultra estructural del nervio ciático de ratones Wistar buscando evidencias sobre el efecto neurotóxico de esos AL y de las propias microesferas. Junto con el análisis ultra estructural fue realizada la histomorfometría bajo la microscopía de luz en busca de diferencias entre los diámetros de los axones que pudiesen ser interpretadas como alteración neurotoxicológica.

En los cortes semifinos de todos los grupos y en todos los tiempos estudiados (2, 4, 6 y 8 días), ilustrados en la Figura 1, se observan fibras de aspecto normal dentro de los fascículos. Podemos ver axones con un diámetro pequeño, con una vaina de mielina fina, y axones mayores con una vaina de mielina espesa. Hay una distribución regular homogénea en las fibras de colágeno en el endoneuro. No se observan alteraciones degenerativas de los axones o de las vainas de mielina. En varios cortes semifinos fueron observados mastocitos. No se observaron células inflamatorias en el endoneuro o en el perineuro. El aspecto desarreglado de algunas vainas de mielina es interpretado como un artefacto de procesamiento.

En los cortes ultrafinos en todos los grupos de todos los tiempos (2, 4, 6 y 8 días), ilustrados en la Figura 2, se observan axones mielinizados de aspecto normal y axones no mielinizados envueltos por células de Schwann en las estructuras designadas como fibras de Remak. El axoplasma contiene una distribución homogénea de neurofilamentos y microtúbulos con ocasionales mitocondrias. En algunos cortes, se ven núcleos de las células de Schwann asociadas con el internodo de mielina y con las fibras de Remak. Se comprueba la presencia de fibroblastos y mastocitos en el endoneuro. En todos los cortes examinados, son conspicuas las fibras de colágeno en contacto con la membrana basal de las células de Schwann.

Los cortes semifinos de los nervios ciáticos de cada ratón se fotografiaron y se sometieron al análisis histomorfométrico con la ayuda del programa Image Pro Plus versión 4,5. En cada nervio ciático, fueron registrados los diámetros de 100 axones, considerando como criterio de selección del axón la coloración y el posicionamiento central de los axones en el campo fotografiado. Para el análisis estadístico, fue considerado el promedio de las 100 medidas obtenidas en cada ratón.

Se comprobó la hipótesis nula de resultados iguales en los dos grupos bajo comparación, versus la hipótesis alternativa de resultados diferentes. La Tabla I presenta los diámetros mínimo, máximo y medio de los axones, considerando las 100 mediciones para cada uno de los ratones. Notamos que uno de los ratones del grupo M tuvo el menor promedio del grupo. También observamos que el grupo M presentó una mayor dispersión de los resultados.

En la Tabla II aparecen los valores de p de las comparaciones de los grupos dos a dos. Se testó la hipótesis nula de resultados iguales en los dos grupos bajo comparación, versus la hipótesis alternativa de resultados diferentes.

DISCUSIÓN

La toxicidad de la BP para los sistemas nervioso central y cardiovascular conllevó a la investigación de nuevos ALs con un perfil semejante de bloqueo y menos tóxicos, surgiendo así nuevas preparaciones como la bupvacaína en exceso enantiomérico de 50%. En un estudio sobre la evaluación de la eficacia del bloqueo de nervio ciático de ratones caseros ³, la mezcla enantiomérica de BP (S75-R25) fue considerada como una alternativa para el desarrollo de formulaciones de liberación controlada más seguras y eficaces que la BP (S50-R50).

Investigaciones con formulaciones de AL de liberación controlada han mostrado resultados promisorios. A pesar de los grandes avances obtenidos en el desarrollo de esas formulaciones, todavía son necesarios estudios para evaluar la neurotoxicidad local y poder garantizar su utilización segura en la rutina clínica ⁴.

El uso de un pequeño número de animales (n = 16) se debe a varios factores: por un lado las limitaciones provenientes de las nuevas directrices de bienestar animal y por el otro, las limitaciones financieras que un estudio con la metodología desarrollada exige.

El nervio ciático es el punto de partida para el estudio in vivo de AL componiendo, junto con las investigaciones in vitro, los requisitos de la fase preclínica de nuevos compuestos antes de iniciar las fases de investigación en el ser humano ⁵. El nervio ciático de ratón es un modelo experimental mamífero bien establecido para las investigaciones sobre toxicología del nervio periférico ⁶.

La metodología de la inyección fue adecuada porque, después de la recuperación de la capacidad proprioceptiva del miembro anestesiado, los animales no indicaron secuelas motoras o sensoriales. Esos objetivos formaron parte del estudio realizado en paralelo con el mismo grupo de animales ⁷.

Es un imperativo que un fármaco sea testado para la neurotoxicidad periférica usando las técnicas neuropatológicas establecidas con mayor sensibilidad y resolución que las preparaciones de parafina coloradas con hematoxilina y eosina. Aunque sea útil para la evaluación de las alteraciones histológicas más evidentes, la MO puede ocultar alteraciones recientes entre los axones, células de Schwann y mielina que indiquen mecanismos neurotoxicológicos ⁸.

La comprobación de las alteraciones estructurales inducidas por fármacos depende del análisis ultra estructural. La elección del estudio por análisis de cortes semifinos y ultrafinos, puede ser considerada la más apropiada porque muchas veces, las alteraciones clínicas no corresponden con las alteraciones histológicas, o son muy tenues, por tanto, solamente el estudio ultra estructural permite observar las lesiones discretas ^9-10.

Teniendo en cuenta la necesidad de un análisis juicioso, en busca de una lesión axonal y desmielinización, el presente estudio presenta la evaluación de la ultra estructura de nervios ciáticos.

La microscopía electrónica fue indicada como un test más sensible capaz de diferenciar las lesiones neurotóxicas ultra estructurales ². Al evaluar los efectos neurotóxicos de seis formulaciones lipídicas de depósito diferentes constituidas por una mezcla de BP y lidocaína sobre el nervio ciático de ratones, se observó, a través de MO, una tumefacción axonal, degeneración neuronal y desmielinización en los nervios anestesiados con un 64% de BP y lidocaína en la proporción de 4:1. A pesar de esos hallazgos, concluimos que la BP puede ser usada como un compuesto activo de formulaciones de depósito y se sugiere que su potencial neurotóxico debe ser evaluado por test más sensibles, tal como la MET.

En ninguna de las muestras de este estudio hubo indicios de neurotoxicidad cuando se analizaron tanto por MO como por ME.

El proceso patológico indicativo de neurotoxicidad más mencionado en la literatura es la degeneración walleriana, descrita por primera vez por Augustus Waller en 1850. Es un proceso complejo desencadenado por un traumatismo al axón y con la degeneración del axón y de sus células de so-porte, conjunto conocido como fibra nerviosa. Inicialmente, ocurre un agrupamiento de organelas y de otras estructuras del axoplasma, evolucionando al edema del axón y a su desintegración. La mielina se desintegra y después es fagocitada por las células de Schwann y por los macrófagos que son reclutados en un gran número, como respuesta al aumento del factor de necrosis tumoral y de proteínas proinflamatorias ⁸.

Un aumento de la permeabilidad de la barrera hematoneural provocados por los ALs, puede aumentar la osmolaridad del fluido intersticial, conllevando a la reducción del tamaño de los axones o a la alteración de los gradientes de concentración de los iones inorgánicos y por ende, a la disminución de la conducción nerviosa ¹.

En este estudio, fue considerada la hipótesis de que la presencia de las microesferas y la liberación lenta del AL causarían una alteración de la permeabilidad de los vasos sanguíneos locales, haciéndolos más permeables y permitiendo la extravasación de las proteínas osmóticamente activas que normalmente no son encontradas próximas al endoneuro, y que podrían atraer el agua y limitar así, el espacio de los axones y células endoneurales. En las imágenes de ME, sin embargo, no se vio la distensión del espacio interaxonal e intercelular en el endoneuro, que caracterizaría la extravasación de plasma.

Algunos autores ¹¹ implantaron una matriz con microesferas en el tejido subcutáneo de ratones Wistar, y observaron que las microesferas empezaron a degradarse 15 días después de la aplicación del implante. Sin embargo, en el presente estudio, ninguna microesfera fue observada sobre los nervios ciáticos estudiados, indicando que las microesferas depositadas ya estaban degradadas 2 días después de su aplicación. Una razón para esa discordancia reside en la matriz utilizada en la producción de las microesferas.

Al contrario de la inestabilidad de la vaina de mielina demostrada a través de ME y por rayos X por Mateu y colaboradores ¹², después de la aplicación de tetracaína sobre el nervio óptico y ciático aislado de ratones, en este estudio no fueron evidenciadas alteraciones en las células de Schwann, que incluyen: vacuolización y desintegración citoplasmáticas y acumulación de gotículas de grasa en el citoplasma que indicarían una interrupción del metabolismo lipídico.

La posibilidad de una reacción inflamatoria causada por el procedimiento quirúrgico, se desechó en este estudio, considerando que la aplicación de las microesferas y de la bupivacaína en exceso enantiomérico de 50% fue por inyección transcutánea.

Ninguna alteración estructural se observó en el presente estudio después de la aplicación extra neural de microesferas conteniendo BP y BP en exceso enantiomérico de 50%. En otro estudio ¹³ tampoco fueron encontradas anormalidades en la investigación de los efectos neuro toxicológicos de la amitriptilina y de la BP en el nervio ciático de ratones. Las muestras que fueron retiradas después del 1, 3, 5 y 7 días de la aplicación de los fármacos, fueron analizadas bajo MO y tenían el epineuro y endoneuro intactos, fibras nerviosas organizadas, pocas células inflamatorias y una insignificante degeneración walleriana.

Los ALs usados en el presente estudio, libres o incorporados a las microesferas, como también las propias microesferas, no indujeron a las alteraciones histológicas o ultra estructurales en los nervios ciáticos evaluados. En las imágenes obtenidas, las estructuras nerviosas (fibras, células y espacio extracelular), no mostraron alteraciones: los axones presentaron una distribución homogénea de componentes del citoesqueleto (microtúbulos y microfilamentos), indicando que la difusión de las moléculas se daba normalmente. Las células de Schwann no mostraron signos de intoxicación que podrían ser visualizados bajo la forma de edema del citoplasma y un rechazo de las vainas. Sin embargo, es bueno remarcar, que las células de Schwann son elementos muy resistentes que se recuperan rápidamente de una agresión, independientemente del agente agresor ¹⁴. Los ratones sacrificados en los tiempos estudiados (2, 4, 6 y 8 días posteriormente a la inyección), no tenían alteración en esas células.

Las vainas de mielina presentaron un aspecto normal con eventuales deformidades explicadas como provenientes de artefacto de procesamiento. El sistema nervioso periférico, aunque con características diferentes del sistema nervioso central (comprobadamente por la presencia de una matriz extracelular colagénica en el primero), es un tejido delicado. Eso significa que la manipulación puede inducir a artefactos en las vainas y en los fascículos, lo que dificulta la interpretación de las imágenes ¹⁵.

En varios cortes semifinos y ultrafinos fueron visualizados fibroblastos y haces de fibras colágenas, lo que caracteriza la morfología normal del nervio. También se observaron ocasionales mastocitos repletos de gránulos. En cualquier tipo de agresión a los nervios periféricos, los mastocitos proliferan, sin que se conozca todavía la real causa de esa proliferación y la función que ella desempeñaría ¹⁴. En los cortes analizados, no se detectó la proliferación de esas células.

En ninguno de los cortes fue observada la presencia de células inflamatorias que serían abundantes en el caso de una lesión a los axones o a la mielina ¹⁶. La ausencia de alteraciones observables en la ultra estructura hasta el 8º día de la posterior inyección, sugiere que no habrá alteraciones cuando se apliquen a largo plazo los mismos anestésicos.

Sin embargo, los resultados obtenidos con un fármaco deben ser cuidadosamente extrapolados para otro fármaco aunque sean estructuralmente similares ¹⁷. Además, múltiples factores interfieren en la liberación del AL por la microesfera polimérica como la naturaleza y el peso molecular del polímero.

Considerando que uno de los signos de la inyección intraneural accidental es la resistencia a la introducción de la aguja o al aumento de la presión necesaria para la inyección del AL, es posible apartar la hipótesis de que haya ocurrido ese tipo de fallo técnico en el presente experimento, una vez que el anestesista no relató tales incidencias. Además, ninguna muestra de ese estudio presentó evidencias de degeneración walleriana de las fibras dentro de los fascículos o del perineuro. Solamente las inyecciones con una alta presión causarían un déficit neurológico detectable y alteraciones histológicas de la lesión a los fascículos.

El objetivo de la histomorfometría fue mensurar posibles alteraciones del diámetro de los axones considerando que el inicio del proceso de degeneración walleriana provoca un edema inicial y la posterior desintegración axonal.

El análisis histomorfométrico de los axones reveló una tendencia a la diferencia significativa entre los grupos BE y MP, en función de la dificultad encontrada para obtener cortes transversales homogéneos de los axones (eso se puede ver en las imágenes seleccionadas). Podemos observar que, en algunos cortes semifinos, la orientación axonal fue oblicua, lo que conllevó a una distorsión del resultado de las mediciones. Una manera de minimizar las consecuencias de un análisis tendencioso debido a las diferentes presentaciones de los axones, sería el estudio individual de la relación diámetro del axón/grosor de la vaina de mielina.

En las condiciones de este estudio, la aplicación aguda de microesferas con bupivacaína y bupivacaína en exceso enantiomérico de 50% sobre el nervio ciático de ratones Wistar, no presentó efectos perjudiciales para los nervios. De la misma forma, las microesferas puras y la bupivacaína en exceso enantiomérico de 50%, no generaron alteraciones ultra estructurales de los nervios estudiados.

CONCLUSIONES

En ninguno de los grupos se observaron alteraciones histopatológicas de los axones y de la mielina, indicando que no hubo inflamación. Concluimos por tanto que, bajo las condiciones de este estudio, la aplicación de microesferas con BP y BP en exceso enantiomérico de 50% sobre el nervio ciático de ratones Wistar, no causa alteraciones neurotóxicas directas.

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Análisis del potencial citotóxico agudo de la bupivacaína y bupivacaína en exceso enantiomérico de 50% (s75-r25) incorporadas a microesferas sobre el nervio ciático de ratones

Pedro Paulo Tanaka^I; Maria Fernanda Torres^II; Sergio Bernardo Tenorio^III

Fechas de Publicación

• Publicación en esta colección
  23 Mar 2012
• Fecha del número
  Abr 2012

Histórico

• Recibido
  22 Mayo 2011
• Acepto
  19 Jun 2011