Efectos neurotóxicos de sulfuro de magnesio intratecal

Ozdogan, Levent; Sastim, Handan; Ornek, Dilsen; Postaci, Aysun; Ayerden, Taner; Dikmen, Bayazit

doi:10.1590/S0034-70942013000100012

Resúmenes

JUSTIFICATIVA Y OBJETIVOS: Evaluar los potenciales efectos neurotóxicos en nivel ultraestructural de sulfuro de magnesio administrado por vía intratecal en dosis única o múltiple. MÉTODOS: Estudio realizado con 24 ratones Spraque-Dawley, con un peso promedio entre los 250 y los 300 g. Después del ayuno de 4 horas, los ratones recibieron 10 mg.kg-1 de cloruro de xilazina por vía intraperitoneal y enseguida fueron divididos aleatoriamente en tres grupos. El grupo I (n = 8) recibió 0,9% de suero fisiológico normal, Grupo II (n = 8) recibió una inyección de 0,02 mL de sulfuro de magnesio al 15% por vía intratecal y Grupo III (n = 8) recibió 0,02 mL de sulfuro de magnesio al 15% una vez por día durante siete días. Las inyecciones fueron aplicadas dentro de 0,40x50 milímetros del área lumbar. Después de siete días, los animales fueron sacrificados con anestesia con una inyección de formaldehido al 10% en la aorta y los tejidos fueron pegados. La médula espinal se examinó y fue histopatológicamente evaluada bajo microscopio electrónico. El test de Kruskal-Wallis fue usado para la evaluación estadística. Un valor de p < 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. RESULTADOS: La neurodegeneración significativa fue detectada en los ratones que recibieron una sola inyección o inyecciones repetidas de sulfuro de magnesio, en comparación con el grupo control. El puntaje en la evaluación histopatológica de ese grupo también fue alto. CONCLUSIONES: Basándonos en el examen de microscopía electrónica, descubrimos que la administración intratecal de sulfuro de magnesio indujo a la neurodegeneración.

Infusión Espinal; Microscopía Eletrónico; Sulfuro de Magnesio; Toxicidad

JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS: Avaliar os potenciais efeitos neurotóxicos em nível ultraestrutural desulfato de magnésio administrado por via intratecal em dose única ou múltipla. MÉTODOS: Estudo realizado com 24 ratos Sprague-Dawley, peso médio entre 250 e 300 g. Apósjejum de 4 horas, os ratos receberam 10 mg.kg-1 de cloreto de xilazina por via intraperitoneale, em seguida, foram divididos aleatoriamente em três grupos. Grupo I (n = 8) recebeu 0,9% desoro fisiológico normal, Grupo II (n = 8) recebeu uma injeção de 0,02 mL de sulfato de magnésioa 15% por via intratecal e Grupo III (n = 8) recebeu 0,02 mL de sulfato de magnésio a 15% umavez por dia durante sete dias. As injeções foram aplicadas dentro de 0,40x50 milímetros daárea lombar. Após sete dias, os animais foram sacrificados sob anestesia com uma injeção deformaldeído a 10% na aorta e os tecidos foram fixados. A medula espinal foi, então, examinadae histopatologicamente avaliada sob microscópio eletrônico. O teste de Kruskal-Wallis foi usadopara avaliação estatística. Um valor de p < 0,05 foi considerado estatisticamente significativo. RESULTADOS: Neurodegeneração significativa foi detectada nos ratos que receberam uma únicainjeção ou injeções repetidas de sulfato de magnésio, em comparação com o grupo controle. O escore na avaliação histopatológica desse grupo também foi alto. CONCLUSÃO: Com base no exame de microscopia eletrônica, descobrimos que a administraçãointratecal de sulfato de magnésio induziu neurodegeneração.

Infusão Espinal; Microscopia Eletrônica; Sulfato de Magnésio; Toxicidade

BACKGROUND AND OBJECTIVES: To assess the potential neurotoxic effects at the ultrastructural level of magnesium sulfate administered intrathecally as a single or multi-dose. METHODS: Our study was conducted with 24 Sprague-Dawley rats that weighed 250-300 g. After a 4-hour fast, the rats were given 10 mg.kg-1 xylazine chloride intraperitoneal and then randomly allocated into three groups. Group I (n = 8) received 0.9% normal saline, Group II (n = 8) was given one intrathecal injection of 0.02 mL of 15% magnesium sulphate, and Group III (n = 8) was given 0.02 mL of 15% magnesium sulphate once a day for seven days. The injections were given within 0.40x50 mm from the lumbar area. After seven days, the animals were sacrificed under anesthesia with an aortic injection of 10% formaldehyde and their tissues were fixed. The medulla spinalis was then examined and histopathologically evaluated under an electron microscope. The Kruskal-Wallis test was used for statistical evaluation. A value of p < .05 was considered to be statistically significant. RESULTS: Significant neurodegeneration was detected in rats given single or repeated magnesium sulphate injections compared to the control group. The histopathological evaluation score of this group was also high. CONCLUSIONS: Based on electron microscopic examination, we found that intrathecal magnesium sulphate administration induced neurodegeneration.

Magnesium Sulphate; Injections, Spinal; Toxic Actions; Microscopy, Electron

ARTÍCULO DE REVISIÓN

Departamento de Anestesiologia y Reanimacion, Hospital de Entrenamiento y Investigacion Ancara Numune, Turquia

Correspondencia para

RESUMEN

JUSTIFICATIVA Y OBJETIVOS: Evaluar los potenciales efectos neurotóxicos en nivel ultraestructural de sulfuro de magnesio administrado por vía intratecal en dosis única o múltiple.

MÉTODOS: Estudio realizado con 24 ratones Spraque-Dawley, con un peso promedio entre los 250 y los 300 g. Después del ayuno de 4 horas, los ratones recibieron 10 mg.kg^-1 de cloruro de xilazina por vía intraperitoneal y enseguida fueron divididos aleatoriamente en tres grupos. El grupo I (n = 8) recibió 0,9% de suero fisiológico normal, Grupo II (n = 8) recibió una inyección de 0,02 mL de sulfuro de magnesio al 15% por vía intratecal y Grupo III (n = 8) recibió 0,02 mL de sulfuro de magnesio al 15% una vez por día durante siete días. Las inyecciones fueron aplicadas dentro de 0,40x50 milímetros del área lumbar. Después de siete días, los animales fueron sacrificados con anestesia con una inyección de formaldehido al 10% en la aorta y los tejidos fueron pegados. La médula espinal se examinó y fue histopatológicamente evaluada bajo microscopio electrónico. El test de Kruskal-Wallis fue usado para la evaluación estadística. Un valor de p < 0,05 fue considerado estadísticamente significativo.

RESULTADOS: La neurodegeneración significativa fue detectada en los ratones que recibieron una sola inyección o inyecciones repetidas de sulfuro de magnesio, en comparación con el grupo control. El puntaje en la evaluación histopatológica de ese grupo también fue alto.

CONCLUSIONES: Basándonos en el examen de microscopía electrónica, descubrimos que la administración intratecal de sulfuro de magnesio indujo a la neurodegeneración.

Descritores: Infusión Espinal; Microscopía Eletrónico; Sulfuro de Magnesio; Toxicidad.

Introducción

El hallazgo de los receptores de opioides en el interior de la médula espinal hizo conocidos los métodos de administración de medicamentos por vía intratecal o epidural mundialmente usados para el tratamiento del dolor agudo o crónico ¹. El sulfuro de magnesio, usado hace muchos años en la pre-eclampsia y eclampsia como anticonvulsivo, también está siendo usado para tratar el infarto del miocardio, algunas arritmias, el asma, feocromocitoma y el tétano. Además, el sulfuro de magnesio, considerado como un bloqueante natural de los canales de calcio, es un antagonista no competitivo de los receptores N-metil-D-aspartato ². Estudios anteriores indicaron que el sulfuro de magnesio tiene un efecto analgésico postoperatorio cuando se administra por vía intravenosa³. Además, el sulfuro de magnesio ya ha sido usado anteriormente en seres humanos y animales por vía intratecal por sus efectos analgésicos y neuroprotectores^4,5. Sin embargo, se conoce que las secuelas neurológicas permanentes pueden surgir después de la administración espinal o epidural del medicamento⁶.

El objetivo de este estudio fue investigar los potenciales efectos neurotóxicos de la administración intratecal de sulfuro de magnesio a nivel ultraestructural.

Materiales y métodos

Este estudio fue llevado a cabo en el laboratorio de estudios en animales de la Facultad de Medicina Militar Gülhane con el consentimiento del Comité de Ética de la Facultad de Veterinaria de la Universidad de Ancara. Fueron incluidos en el estudio 24 ratones machos de la raza Spraque-Dawley (peso 250-300 g). Los ratones fueron alimentados con 20% de pienso proteico y agua suministrada ad libitum, de acuerdo con los criterios de uso y supervisión de animales de laboratorio. Antes del experimento, los animales se mantuvieron en una programación de 12h:12h, noche/día, en condiciones excelentes a 20-22ºC y 55% de humedad. Durante las experiencias, las mismas condiciones fueron mantenidas y los ratones fueron alojados separadamente en jaulas de policarbonato.

Después de un ayuno de 4 horas, los ratones recibieron una inyección intraperitoneal de clorhidrato de cetamina (100 mg.kg^-1) y cloruro de xilazina (10 mg.kg^-1). Después de anestesiados, los ratones fueron raspados, higienizados y sometidos a la aplicación intratecal (dentro de un área de 0,40x50 milímetros de las vértebras lumbares L5-L6). Después de observar el líquido cefalorraquídeo (LCR), 0,02 mL de la solución en estudio se administró por medio de un inyector Hamilton (calibre 28, puntiagudo, SGE, Australia). Posteriormente a la administración intratecal, los ratones fueron observados para la toxicidad clínica hasta que empezaron a caminar por sí mismos y a alimentarse.

Los ratones fueron aleatoriamente divididos en tres grupos para recibir inyecciones por vía intratecal. El Grupo I (n = 8) recibió 0,02 mL de suero fisiológico normal al 0,9%, el Grupo II (n = 8) 0,02 mL de sulfuro de magnesio al 15% y el Grupo III (n = 8) 0,02 mL de sulfuro de magnesio una vez por día durante siete días. Cada inyección fue administrada dentro de una región de 0,40x50 milímetros del área lumbar. Posteriormente a la observación de movilidad para los signos toxicidad clínica, todos los ratones fueron sacrificados bajo anestesia al octavo día, con una inyección de formaldehido al 10% en la aorta y enseguida se analizaron las médulas espinales.

Las muestras de tejido (1 mm³) de la región lumbar fueron incubadas durante dos horas en glutaraldehido al 2% (pH 7,4) y solución salina con tapón con fosfato (STF). Al final la incubación, los tejidos fueron lavados tres veces con STF y enseguida, pegados al tetróxido de osmio al 1% por una hora. Las muestras de tejidos fueron entonces deshidratadas en serie de alcoholes. Finalmente, los tejidos fueron tratados con óxido de propileno y después montados en bloques de tejidos con el uso del kit de resina epoxi (Araldit CY212 5x100 g). La mitad de las incisiones en el músculo grácil se hizo en los bloques que fueron polimerizados a 56ºC y coloreados con azul de toluidina. El músculo grácil se aisló de las áreas marcadas después de la evaluación en microscopía de luz, coloreado con acetato de uranilo y citrato de plomo y después evaluado en un microscopio electrónico de transmisión Carl Zeiss, modelo EM 900.

Alteraciones histopatológicas

Los puntajes de las alteraciones histopatológicas fueron los siguientes: ultra estructura normal (= 0); alteraciones degenerativas en la mitocondria donde el contenido del núcleo y otras organelas estaban normales (= 1) y degeneración mitocondrial con estructuras desordenadas en el retículo endoplasmático granular (REG), defecto en el contenido del núcleo o edema extracelular². Un valor de 0,5 también fue usado entre los hallazgos de 0 y 1, como de 1 y 2.

Evaluación estadística

El test de Kruskal-Wallis fue usado para determinar las diferencias significativas entre los dos grupos. Cuando una diferencia intergrupos fue detectada, el test de comparaciones múltiples de Kruskal-Wallis fue aplicado para determinar el grupo responsable de la diferencia. Todos los valores de p < 0,05 fueron considerados estadísticamente significativos.

Resultados

Durante la observación al final del estudio, la movilidad diurna de los ratones de los Grupos I y III y de los ratones en todos los grupos era normal. Ninguno de los animales fue excluido del estudio por ningún motivo. No hubo diferencias estadísticas entre los ratones en los tres grupos con relación al peso antes del estudio (Tabla 1, p > 0,05). El valor promedio obtenido a partir de los exámenes histopatológicos fue de 0 (0-0,5) en el grupo control, 1 (1-1) en el Grupo II y 2 (1,5-2) en el Grupo III.

Hubo una diferencia estadísticamente significativa en los índices de toxicidad entre los tres grupos (Figura 1A, p < 0,001). La toxicidad fue significativamente mayor en los ratones tratados con una dosis única de sulfuro de magnesio comparados con el grupo control (Figura 1B, p = 0,002). Además, los ratones que recibieron dosis repetidas de sulfuro de magnesio tenían una toxicidad más elevada que los controles (Figura 1C, p = 0,002). La toxicidad también fue mayor en los ratones que recibieron dosis repetidas de sulfuro de magnesio en comparación con los ratones que recibieron una sola dosis (Grupo II versus III, respectivamente; Figura 1D, p = 0,008).

En el examen de microscopía electrónica de la médula espinal, las neuronas multipolares con estructuras normales fueron observados en los ratones control y el núcleo de la célula era cicloide, centralmente localizado y eucromático. Los nucléolos también eran conspicuos y el citoplasma de la célula contenía cisternas del retículo endoplasmático que estaban maduras. La intensidad de los electrones era dependiente de la intensidad del ribosoma. Las mitocondrias tenían estructuras y crista normales (Figura 2).

En el Grupo II, la intensidad de los electrones era dependiente de la intensidad de los ribosomas. El núcleo y el nucléolo de la célula tenían estructuras normales y los gránulos y las cisternas del retículo endoplasmático en el citoplasma estaban maduros. Esos hallazgos fueron similares a los del grupo control. Sin embargo, cuando las mitocondrias se analizaron, observamos una degeneración generalizada, y la distensión y la cristalización de las mitocondrias estaban ampliamente diseminadas (Figura 3).

En el Grupo III, alteraciones degenerativas muy distintas se observaron. La pérdida de cromatina era evidente en el núcleo, lo que no fue observado. La disminución de la densidad citoplasmática fue observada y la dilatación conspicua fue detectada en las cisternas del retículo endoplasmático. La cristalización en formas diferentes fue observada en la mitocondria y alteraciones degenerativas muy significativas fueron observadas en las neuronas. Las células examinadas del Grupo III también venían con un aumento poco común en los lisosomas (Figura 4). Basándonos en esas observaciones, la neurodegeneración ultraestructural se concluyó en ese grupo.

Discusión

La ausencia de efectos colaterales graves y el aumento del uso para indicaciones en analgesia han hecho con que el uso del sulfuro de magnesio administrado por vía intravenosa sea un objeto común en los estudios científicos. Recientemente, el uso del sulfuro de magnesio ha venido siendo explorado también en la anestesia general^7,8. El sulfuro de magnesio es reconocido como un antagonista de los receptores de N-metil-D-aspartato (NMDA) y puede bloquear los canales iónicos asociados a esos receptores. Los receptores antagonistas de NMDA pueden bloquear la sensibilidad central asociada con el estímulo nociceptivo periférico. Estudios demuestran que los receptores antagonistas de NMDA tienen poco efecto directo sobre las fibras C conductoras de dolor, pero su efecto puede aumentar ostensiblemente durante la estimulación repetida⁹. Un estudio realizado por Mitani y col.¹⁰ demostró que alteraciones funcionales en los canales de los receptores de NMDA pueden desempeñar roles específicos en la lesión neuronal. Estudios anteriores demuestran también que el magnesio puede reducir la liberación de acetilcolina¹¹. Y ya que el sulfuro de magnesio deprime el tono colinérgico, ese mecanismo puede desempeñar un papel en la formación del bloqueo motor¹². Por otro lado, Cheng y col. ¹¹sugieren que el glutamato puede aumentar la concentración intracelular de magnesio, lo que puede provocar la neurotoxicidad.

En el estudio de caso conducido por Dror y col.⁴, se verificó que cuando el sulfuro de magnesio al 10% fue administrado vía epidural por equivocación, una irritación similar a la quemadura fue relatada, pero el bloqueo sensorial-motor no se dio. En otro caso, una inyección intratecal de 2 mL de sulfuro de magnesio al 50% administrada por equivocación causó la parálisis motora por 5 horas y un intenso dolor de cabeza, pero sin ninguna pérdida de sensación⁵.

En los ratones Chanimov sometidos a la raquianestesia con inyecciones intratecales en serie de sulfuro de magnesio, observamos más vacuolización en las células ganglionares de la masa gris en el grupo que recibió 0,02 mL de sulfuro de magnesio al 12,6% que en los grupos que recibieron 6,3% de sulfuro, 2% de lidocaína, 0,9% de SF o solamente con un catéter intratecal implantado ¹³. En otro estudio, los ratones que recibieron 6,3% de sulfuro de magnesio vía catéter intratecal tenían anestesia espinal y sedación general durante una semana en comparación con los ratones que recibieron lidocaína al 2% ¹⁴. Además, los ratones que recibieron sulfuro de magnesio desarrollaron neurotoxicidad clínica y déficit neurológico.

Las lesiones nerviosas pueden ser de origen isquémico, traumático o tóxico. Esas lesiones pueden traer consigo la toxicidad de los axones espinales y muchos componentes del sistema nervioso que pueden afectar directamente las túnicas, como las lesiones vasculares y el tejido cicatricial. Algunos anestésicos locales pueden reducir el flujo sanguíneo y poseen efectos tóxicos ^15,16. Además, la influencia neurotóxica puede afectar no solamente a la formación citoplasmática, sino también al núcleo directamente¹⁷.

Varios estudios anteriores de neurotoxicidad^18-20 evaluaron inyecciones de dosis única y múltiples dosis vía catéter intratecal o epidural. Debido al consenso de que el uso de catéteres intratecales también puede causar cambios histopatológicos, hemos sometido un grupo del estudio a un régimen de dosis repetidas, como también a un régimen de dosis única, porque ambos son usados como rutina en la práctica clínica. En estudios recientes, la formación de granulación epidural, como también en la médula espinal, y fibrinólisis maciza en las raíces espinales, fueron observadas en modelos animales sometidos a la canulación intratecal y a la administración de fármaco en los espacios subaracnoideo y epidural. Infarto del parénquima y abscesso apical también fueron observados durante la infusión de un euploide sintético. Sin embargo, como algunos de esos cambios también estaban presentes en los animales del grupo control que recibieron solamente suero fisiológico, es bastante difícil distinguir las alteraciones inducidas por el fármaco de otras alteraciones a causa del uso crónico del catéter solo. Además de eso, algunas evidencias indican que el propio catéter puede bloquear el dreno del LCR y causar alteraciones relacionadas con esa condición²¹.

No queda claro si los estudios morfológicos usados para determinar los efectos neurotóxicos del compuesto por medio de una administración intratecal son suficientes, porque las toxicidades mediadas por el compuesto pueden tener más de un efecto en la función celular que en la estructura de la célula. La ausencia de las alteraciones morfológicas no es suficiente para determinar si un compuesto tiene un efecto neurotóxico en potencial. Por tanto, los estudios morfológicos y funcionales deben ser realizados concomitantemente durante el análisis toxicológico de un compuesto preparado para el uso humano²².

En este estudio, una neurodegeneración significativa fue observada después de la administración de sulfuro de magnesio, especialmente durante la administración de dosis repetidas. Esa degeneración puede ser el resultado de un aumento extremo en la actividad celular y déficit simultáneo en el metabolismo de energía. Esa degeneración no solamente afecta a la estructura citoplasmática, sino también puede afectar al núcleo. Por tanto, la acumulación intracelular de magnesio también puede ser responsable por la neurodegeneración.

Se cree que los efectos neurotóxicos estén asociados con una concentración de los agentes previamente administrados²³. Sin embargo, en algunos casos, los compuestos que demostraron una potencial neurotoxicidad en los modelos animales terminan siendo clínicamente seguros en humanos en determinadas dosis o concentraciones²⁴. En el presente estudio, sugerimos que la administración intratecal del sulfuro de magnesio en concentraciones de un 15% o más puede causar riesgos imprevistos al paciente.

En este estudio, los ratones no presentaron trastornos de la motilidad después de la administración intratecal de sulfuro de magnesio. Sin embargo, basándonos en el examen microscópico de cada grupo, nuestra hipótesis es la de que la neurodegeneración observada todavía es significativa, especialmente en la administración repetida de sulfuro de magnesio al 15%. Además, el efecto que esa dosificación puede causar en la barrera hematoencefálica, en la corriente sanguínea y en las conducciones nerviosas se desconoce, porque los estudios neurofisiológicos no pudieron ser hechos a causa de dificultades técnicas. En los casos en que la administración de sulfuro de magnesio puede ser clínicamente útil, como en los dolores con aumentos progresivos que no responden a euploides²⁵, el uso a largo plazo puede ser necesario. Hasta ahora no encontramos ningún estudio neurofisiológico relacionado con el uso intratecal de sulfuro de magnesio en animales de experimentación.

Como conclusión, podemos decir que este estudio sugiere que la administración intratecal de sulfuro de magnesio en concentraciones de 15% o más puede causar riesgos imprevisibles para el paciente. La neurodegeneración fue observada por microscopía electrónica en animales que recibieron sulfuro de magnesio en esa concentración, especialmente después de la administración repetida, y puede traer como resultado un aumento extremo de la actividad celular y el posterior déficit en el metabolismo de energía. Hasta ahora, los estudios neurofisiológicos relacionados con el uso de sulfuro de magnesio son insuficientes para evaluar la seguridad clínica y por lo tanto, estudios adicionales son necesarios para una caracterización completa.

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