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"Crosslinking"de colágeno no tratamento do ceratocone

Collagen crosslinking for the treatment of keratoconous

Resumos

Em meados da década de 90, o crosslinking de colágeno corneano foto-induzido utilizando riboflavina foi proposto como uma nova modalidade terapêutica no tratamento do ceratocone. Desde então foram estudados os efeitos deste procedimento em ambiente laboratorial e posteriormente em ensaios clínicos. Neste artigo, revisamos a literatura que já foi publicada até o momento no intuito de expor sobre o procedimento e seus efeitos.

Ceratocone/terapia; Colágeno/efeitos de radiação; Riboflavina/uso terapêutico; Terapia ultravioleta; Fototerapia; Raios ultravioleta; Reagentes para ligações cruzadas


In middle of 90th decade, corneal collagen crosslinking photo-induced by riboflavin was considered as a new therapeutical modality in the treatment of keratoconus. Since then, the clinical effect of this procedure in laboratorial environment and clinical assays had been studied. In this article, we revise the literature already published until the moment in order to display on the procedure and its effects.

Keratoconus/therapy; Collagen/radiation effects; Riboflavin/therapeutic use; Ultraviolet therapy; Phototherapy; Ultraviolet rays; Crosslinking reagents


ARTIGO DE REVISÃO

"Crosslinking"de colágeno no tratamento do ceratocone

Collagen crosslinking for the treatment of keratoconous

Rodrigo Coelho AmaralI;Helena Parente SolariII

IResidente (R3) de Oftalmologia do Hospital dos Servidores do Estado do Rio de Janeiro HSE - Rio de Janeiro (RJ), Brasil

IIPós-Doutora em Patologia Ocular na Universidade McGill em Montreal, Canadá; Professora adjunto da Universidade Federal Fluminense UFF Rio de Janeiro - (RJ), Brasil

Endereço para correspondência Endereço para correspondência: Helena Parente Solari Av. Mariz e Barros, nº 459 - Icaraí CEP 24220-120 - Niterói - RJ - Brasil

RESUMO

Em meados da década de 90, o crosslinking de colágeno corneano foto-induzido utilizando riboflavina foi proposto como uma nova modalidade terapêutica no tratamento do ceratocone. Desde então foram estudados os efeitos deste procedimento em ambiente laboratorial e posteriormente em ensaios clínicos. Neste artigo, revisamos a literatura que já foi publicada até o momento no intuito de expor sobre o procedimento e seus efeitos.

Descritores: Ceratocone/terapia; Colágeno/efeitos de radiação; Riboflavina/uso terapêutico; Terapia ultravioleta; Fototerapia; Raios ultravioleta; Reagentes para ligações cruzadas.

ABSTRACT

In middle of 90th decade, corneal collagen crosslinking photo-induced by riboflavin was considered as a new therapeutical modality in the treatment of keratoconus. Since then, the clinical effect of this procedure in laboratorial environment and clinical assays had been studied. In this article, we revise the literature already published until the moment in order to display on the procedure and its effects.

Keywords: Keratoconus/therapy; Collagen/radiation effects; Riboflavin/therapeutic use; Ultraviolet therapy; Phototherapy; Ultraviolet rays; Crosslinking reagents.

Introdução

Idealizado por Seiler et al.(1), o uso de irradiação ultravioleta A (UVA) associada à riboflavina (vita- mina B2) para indução de crosslinking de colágeno da córnea apresenta-se como uma técnica promissora, que vem sendo amplamente divulgada através das experiências clínicas de pesquisadores do mundo inteiro.

Este estudo tem como objetivo avaliar os resultados da utilização do crosslinking no tratamento do ceratocone, revisando os dados publicados de estudos in vitro e de estudos clínicos.

Princípio bioquímico e molecular

O colágeno representa o principal elemento presente na matriz extracelular (MEC) humana, estando envolvido principalmente em processos de renovação e cicatrização tissular.É um polímero proteico natural, sintetizado a partir dos fibroblastos e formado por polipeptídios organizados em cadeias(2,3).

A reticulação polimérica é um processo onde cadeias poliméricas são interligadas por pontes de ligações formando uma rede polimérica tridimensional, processo também conhecido como crosslinking (formação de ligações cruzadas).Como resultado da reticulação, as estruturas tendem a perder sua fluidez e tornam-se mais rígidas(4,5).

O conhecimento da capacidade de reação das moléculas de colágeno com produtos provenientes de seu ambiente (reticulação) levou Dalle Carbonare e Pathak a testarem a sensibilidade do colágeno frente à associação de riboflavina sob irradiação UVA. Observou-se um efeito catalisador atribuído a riboflavina no processo denominado fotopolimerização do colágeno, com conseqüente aumento na resistência da estrutura colágena atribuída à formação de novas ligações covalentes inter e intraestruturais (crosslinking)(6).

A compreensão bioquímica da indução fotoquímica de crosslinking de colágeno foi demonstrada por Fujimori ainda em 1989. Como efeito, evidenciou-se um aumento no número de ligações interfibrilares, com subsequente aumento na estabilidade e densidade estrutural(7).

No final da década de 90, Spoerl et al. propuseram o uso de luz ultravioleta associada a um agente fotossensibilizante (riboflavina) para indução da reticulação do colágeno corneano(8).

Efeitos biomecânicos

Em córneas normais, a estrutura do estroma é formada por cerca de 300 lamelas de colágeno de tamanhos que variam entre 0,5 a 250µm, e espessura entre 0,2 a 2,5µm. Cada lamela é composta por fibrilas de colágeno dispostas paralelamente, e cada fibrila, por sua vez, composta por micromoléculas de polipeptídeos separados em cadeias(9).

A estabilidade biomecânica da córnea depende diretamente da interrelação destas estruturas e da manutenção de sua arquitetura. Em todos os níveis deste complexo morfológico encontram-se ligações do tipo crosslinking: intermoleculares, interfibrilares e interlamelares(10).

Em estudo de córneas com ceratocone, Stachs et al.observaram irregularidade estrutural na disposição dos ceratócitos, bem como diminuição das lamelas oblíquas de orientação ântero-posterior no estroma anterior(11,12).

O protocolo proposto de irradiação UVA com riboflavina em olhos de suínos e olhos humanos post morten demonstrou um aumento na rigidez elástica total de 328% nas córneas humanas tratadas, quando comparadas ao grupo controle. Este efeito mostrou-se mais evidente em olhos humanos se comparados ao de suínos, onde o incremento na resistência foi de apenas 71,9%% (13,14).

Estes resultados são justificados pelo fato de que a irradiação UVA associada à riboflavina apresenta uma absorção de 70% de sua intensidade concentrada nos 200a 300µm anteriores da córnea. Tendo a córnea humana em média 550µm de espessura central e a de suínos 850µm, esta medida torna-se proporcionalmente maior nas córneas humanas(13,14).

Efeitos termomecânicos

A desnaturação das moléculas de colágeno através de processos termoinduzidos resulta em perda da conformidade helicoidal de sua estrutura e consequente desaparecimento de sua birrefringência(15). O estudo destas alterações evidenciou um encurtamento das micro fibrilas, com consequente encurtamento do feixe colágeno como um todo(16).Quando aquecidas acima de um ponto crítico, as fibras colágenas apresentam uma fase pré-desnaturação, com a transição de um estado de solidez para um estado gelatinoso(15). Este processo é denominado hialinização, através do qual as ligações covalentes entre as moléculas de colágeno são quebradas e o processo de desnaturação se completa.

Spoerl et al. observaram os efeitos térmicos em córneas de suínos tratadas com diferentes intensidades de temperatura comparando-as com córneas não tratadas. Evidenciou-se um incremento significativo no limiar máximo de encurtamento pós-desnaturação no grupo de córneas tratadas(15).

Este efeito, no entanto, não se mostra homogêneo no tecido corneano. Durante a análise histológica e biomicroscópica dos botões corneanos submetidos à temperatura de 70º C pôde-se observar um efeito predominantemente acentuado nas 200µm anteriores da córnea, onde a arquitetura organizada e a presença de birrefringência ainda encontravam-se presentes(15).

Efeitos morfológicos

Durante o processo de envelhecimento natural do tecido corneano ocorre um aumento no diâmetro da fibra de colágeno de 4,5%(17,18).As alterações descritas no processo de envelhecimento foram evidenciadas na microscopia eletrônica de córneas de coelhos submetidos ao procedimento de crosslinking induzido pela UVA associado à riboflavina(16). As fibras de colágeno corneano apresentaram um aumento, em média, de 12,2% de seu diâmetro no estroma anterior e 4,6% no estroma posterior quando comparado ao grupo controle. A diferença de 9,3% maior do efeito no estroma anterior em relação ao posterior corroborou para evidência previamente descrita de uma indução maior de crosslinking na porção anterior da córnea(19).

O diâmetro da fibra colágena demonstrada por Wollensak et al. neste experimento obteve um aumento médio na ordem de 3,96 nm(16). Não houve perda da transparência corneana em nenhuma amostra corroborando para evidência de um procedimento seguro(19).

Efeitos enzimáticos

Em pacientes com ceratocone a detecção de produtos resultantes da degradação do colágeno (telopeptídeos), detectadas na lágrima, foi demonstrada como sendo cerca de 3,5 vezes maior, quando comparado ao grupo controle. Esta evidência contribuiu tardiamente para a detecção de um catabolismo enzimático acelerada no ceratocone, quando comparado a olhos normais(20,21).

Durante o processo de estudos laboratoriais, no intuito de avaliar os efeitos do tratamento de cross-linking fotoinduzido, foi possível observar um importante decréscimo nas taxas dos subprodutos da degradação do colágeno em córneas tratadas. A este fato atribui-se uma menor atividade de algumas enzimas envolvidas no turn-over de colágeno corneano, como as metaloproteinases matriciais tipo 1 e 13 (MMP's), tripsina humana tipo 2 e catepsina K(22).

Efeitos sobre os ceratócitos

A radiação ultravioleta, por si só, pode exercer um efeito deletério na camada de ceratócitos. A intensidade deste efeito está diretamente ligada ao comprimento de onda de cada um de seus espectros. O espectro UVA é o maior de todos, com comprimento entre 315 e 400nm. Esta característica confere ao mesmo uma capacidade de transmissão na ordem de 25 a 35% de sua irradiação às camadas mais profundas da córnea, sendo absorvido no estroma anterior onde exerce importante efeito citotóxico(23).

O processo de desepitelização corneana também exerce um efeito lesivo aos ceratócitos, porém de forma menos intensa, acometendo somente os 50µm anteriores da córnea.A riboflavina, por ser uma substância endógena, não exerce qualquer efeito citotóxico direto ao estroma corneano(23,24).

Wollensak et al. demonstraram in vitro os efeitos da irradiação proposta para o tratamento do ceratocone em culturas de ceratócitos provenientes de córneas de suínos. A análise dos tecidos tratados sob diferentes intensidades demonstrou um limiar de citotoxicidade na ordem de 5mW/cm² quando somente tratada com UVA, e uma redução para 0,5 mW/cm² quando se utilizou a associação UVA-riboflavina. Estes resultados evidenciam a função catalisadora da riboflavina no processo (24).

Posteriormente, Wollensak et al. estudaram através de microscopia eletrônica, córneas de suínos tratadas sob diversas intensidades de irradiação. Os achados in vivo demonstraram bastante semelhança com o experimento anterior utilizando cultura de ceratócitos suínos, reafirmando o limiar de citotoxicidade (25).

Nestes estudos, não foi observado nenhum caso de alteração na transparência ou espessura corneana, efeito também ausente durante a realização de ensaios clínicos com humanos que serão descritos a seguir (24,25).

Efeitos colaterais

A radiação UV representa um importante fator lesivo à córnea, cristalino, e retina. Os danos causados pelos raios UV dependem do comprimento de onda da radiação, da área sobre a qual ela incide, bem como do tempo de exposição.

Na ausência de um fotossensibilizante, lesões endoteliais foram demonstradas na presença de comprimentos de ondas maiores que 350nm e intensidade superior a 3mW/cm² (26). Durante experimentos realizados, o limiar de segurança para a lesão fotoativa foi de 70 J/cm² para o cristalino, 42 J/cm² para a córnea e 4.3 m W/cm² para a retina(24,25,27).

Comparando-se estes valores citados à dose utilizada durante o procedimento de crosslinking UVA-R induzido em humanos (3mW/cm², 5.4 J/cm²), nenhum dano é esperado no endotélio corneano, cristalino ou mesmo retina(24,25,27).

A concentração da riboflavina instilada na superfície ocular apresenta significativa relevância no processo de absorção e difusão da mesma nas camadas mais profundas da córnea. Com um peso molecular de 376,37 g/mol, o epitélio intacto representa uma barreira à sua difusão, fazendo-se de forma lenta e incompleta. Por esse motivo, deve-se realizar o desbridamento prévio do epitélio corneano, no intuito de acelerar a saturação de riboflavina no estroma corneano(27,28).

O coeficiente de absorção da solução de riboflavina aumenta linearmente até uma concentração de 0,04%, mantendo-se constante a partir deste ponto para concentrações entre 0,05% e 0,1%. Após trinta minutos da aplicação, a concentração de 0,04% de riboflavina passa a ser detectável em qualquer ponto a uma profundidade de 400µm, apresentando um decréscimo de concentração à medida que se aprofunda no tecido corneano. Esta concentração cria uma espécie de barreira adicional a todas as estruturas localizadas posteriormente ao estroma corneano, incluindo endotélio corneano, câmara anterior, íris, cristalino e retina(28).

A citotoxicidade da irradiação UVA-R durante a exposição terapêutica e seus efeitos na camada de ceratócitos e endotélio foi estudada por Wollensak et al.(23,24). Em córneas de coelhos e em cultura in vitro de ceratócitos de suínos, após o tratamento com UVA-R sob os parâmetros recomendados, foi observada apoptose de ceratócitos a uma profundidade de até 300µm(23,24).Em conformidade com estes achados laboratoriais, a microscopia confocal de 10 córneas tratadas nos parâmetros recomendados revelou morte de ceratócitos a uma profundidade de 270-350µm no estroma, com repopularização e recuperação total de sua densidade celular após seis meses do tratamento. Nenhum dano ao endotélio foi observado em qualquer momento do tratamento (29).

No ensaio clínico mais recente, onde foram estudados efeitos colaterais do tratamento em córneas de humanos tratadas in vivo, foram relatados como efeitos colaterais: opacidade estromal leve transitória e autolimitada, infiltrado estromal estéril na proporção de 7.6% e cicatriz estromal em 2.8% dos casos(30).

Estudos clínicos

O pioneirismo na utilização de UVA-R em pacientes com ceratocone data de 1998, na Alemanha, quando Wollensack et al. trataram 16 olhos com diagnóstico de ceratocone progressivo e moderado. Após o acompanhamento entre 1 e 3 anos, a progressão do ceratocone foi paralisada em todos os casos, com melhora da acuidade visual e redução do valor ceratométrico máximo em 50% dos casos. Em nenhum caso foi observada qualquer perda na transparência corneana ou diminuição na celularidade endotelial(31).

Na segunda fase deste ensaio, 22 pacientes com ceratocone moderado a avançado foram tratados, com 52% dos olhos incluídos apresentando progressão da doença, com valor ceratométrico máximo entre 48 e 72 dioptrias. A progressão do ceratocone foi interrompida em todos os pacientes tratados, além disso, em 70% dos casos ocorreu uma redução de duas dioptrias no valor ceratométrico (K) máximo. A acuidade visual medida após a melhor correção apresentou ganho médio de 1,26 linhas, com redução de 1,14 ± 2.18 dioptrias de equivalente esférico. Em 22% dos olhos contralaterais utilizados como controles, no entanto, houve progressão da ectasia com um aumento médio de 1,48 dioptrias na ceratometria máxima. A transparência da córnea e do cristalino, bem como a densidade das células endoteliais permaneceram inalteradas(32).

Novos resultados obtidos com acompanhamento de 3 a 5 anos, também em Dresden, mostraram que todos os 60 olhos com ceratocone tratados pararam de evoluir. Em 31 olhos ocorreu um aplanamento discreto do cone com valor médio de 2,87 D e a melhor acuidade visual corrigida aumentou em 1,4 linhas(33).

Outro estudo europeu mostrou uma redução média de 2,5 D no equivalente esférico, confirmada topograficamente, com melhora na acuidade visual e diminuição de parâmetros topográficos.Caporossi et al. e Mazzotta et al.publicaram seus resultados correlacionando os dados clínicos com evidências observadas à microscopia confocal e topoaberrometria no seguimento de seis meses(29,34). O HRT II-RCM (Heidelberg Retinal Tomograph II Rodstock Corneal Module) registrou um efeito confinado aos 350µm anteriores da córnea, enquanto que a topoaberrometria detectou um aumento na simetria corneana(34).

Nestes estudos não houve evidências de qualquer alteração endotelial ou da pressão intraocular e pôde-se confirmar in vivo o potencial de regeneração da camada de ceratócitos já especulada durante os ensaios laboratoriais(25,27,29,34).

Desde o início dos ensaios clínicos, mais de 272 pacientes, contabilizando um total de 480 olhos com ceratocone foram submetidos ao tratamento com o cross-linking em Dresden. A recente publicação dos resultados após o acompanhamento dos pacientes pelo período de 6 anos confirmou a tendência positiva dos resultados preliminares. Ao final do terceiro ano, o aplainamento do ápice corneano demonstrou um decréscimo do valor ceratométrico máximo na ordem de 4.84 dioptrias. Os parâmetros clínicos também obtiveram bons resultados, mostrando ganho de pelo menos uma linha de visão na tabela EDTRS em 57% dos pacientes em média e a ausência de perdas de mais linhas, em aproximadamente 22%%(35).

No Brasil, em 2008, Lamy et al. publicaram os resultados preliminares obtidos através da aplicação do protocolo internacional em pacientes do Hospital Universitário da Universidade Federal do Rio de Janeiro. Foram tratados 37 olhos com análise ao final de 90 dias.Os resultados mostraram uma redução do poder dióptrico médio (PDM) em até 1,3 dioptrias em 83,8% dos olhos e um aumento de 0,3 dioptrias em 16,2%, apresentando portanto uma média de 0,4 dioptrias de decréscimo. O valor ceratométrico máximo reduziu 0,6 dioptrias em média nos 3 milímetros centrais e a acuidade visual corrigida evoluiu com melhora média de 6,27 letras(36).

Em suma, pode-se concluir que a utilização clínica segura da irradiação UVA-R em córneas de humanos, no tratamento do ceratocone, depende de criteriosa seleção de pacientes e da manutenção das recomendações técnicas protocoladas. A literatura evidencia resultados promissores, porém são ainda necessários mais estudos prospectivos com maior número de pacientes e tempo de acompanhamento para confirmação da eficácia e segurança deste novo procedimento.

Recebido para publicação em: 19/11/2009

Aceito para publicação em 16/12/2009

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  • Endereço para correspondência:
    Helena Parente Solari
    Av. Mariz e Barros, nº 459 - Icaraí
    CEP 24220-120 - Niterói - RJ - Brasil
  • Datas de Publicação

    • Publicação nesta coleção
      17 Mar 2010
    • Data do Fascículo
      Dez 2009

    Histórico

    • Aceito
      16 Dez 2009
    • Recebido
      19 Nov 2009
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