INTRODUÇÃO

O olho seco é uma doença ocular multifatorial, de alta prevalência, que envolve alterações das lágrimas e da superfície ocular e resulta em sintomas de desconforto e distúrbio visual e instabilidade do filme lacrimal com potencial risco à integridade da superfície ocular^(1-3).

O potencial prejuízo a superfície ocular causado por alterações na quantidade e/ou na qualidade do filme lacrimal associadas ao olho seco tem sido exaustivamente estudado. ^(4-7) Essas alterações podem se justificar pelo acúmulo de mediadores inflamatórios, alterações hormonais, instilação de conservantes ou drogas com potencial tóxico ou alergênico^(8-10).

O filme lacrimal é fundamental para a qualidade óptica, conforto e manutenção da superfície ocular e pode ser alterado por doenças autoimunes, processos cicatriciais e degenerativos, além de comorbidades como diabetes, alergia ocular, menopausa e processos de senilidade e uso de medicações, sejam estas de administração tópica ou sistêmica^(11-16). É imprescindível que haja uma integração harmônica entre as glândulas lacrimais, a superfície ocular (córnea, conjuntiva e glândulas meibomianas), as pálpebras e os nervos sensoriais e motores. O dano ou doença de qualquer desses componentes pode desestabilizar o filme lacrimal e levar à condição de olho seco⁽¹⁷⁾.

Há uma grande variabilidade dos sintomas e da gravidade do dano à superfície ocular nos quadros de olho seco^(17,18). A fisiopatologia do olho seco apoia-se na hiperosmolaridade e inflamação da superfície ocular^(19,20). A hiperosmolaridade é uma alteração na composição da lágrima, pelo aumento na concentração de solutos e ocorre no olho seco, pela redução do volume da fração aquosa e tem sido vista como possível marcador para o diagnóstico de olho seco. O aumento da osmolaridade da lágrima leva à diferenciação anormal, perda acelerada das células epiteliais, indução de marcadores inflamatórios, instabilidade do filme, edema celular e alteração da barreira antimicrobiana^(21,22).

A inflamação da superfície ocular pode estar envolvida tanto na indução quanto na manutenção do olho seco: a disfunção das glândulas lacrimais altera a composição da lágrima, levando a um estado de hiperosmolaridade e estimulando a produção de mediadores inflamatórios, que por sua vez levam à disfunção das glândulas secretórias, a lise da membrana basal epitelial e das junções intercelulares, e no processo de exfoliação celular com conseqüente erosão do epitélio⁽¹⁰⁾.

Os conservantes são importantes componentes das preparações oftalmológicas, promovendo atividade antimicrobiana e prevenindo que a droga ativa se decomponha. No entanto, efeitos citotóxicos significativos na superfície ocular tem sido relacionados ao uso crônico destas substâncias⁽²³⁾. O conservante mais comum das preparações oftalmológicas comerciais para glaucoma e doenças da superfície ocular (irritações, alergias e infecções) é o cloreto de benzalcônio (BAC), utilizado em concentrações que variam de 0,004% a 0,02% em soluções tópicas multidoses⁽²⁴⁾. O BAC é um composto de amônia quaternária, que tem ação detergente, antibacteriana e antifúngica, tem ainda, a capacidade de quebrar a barreira epitelial da superfície ocular nas junções intercelulares o que em tese, aumentaria a penetração e ação do princípio ativo. Diversos estudos tem demonstrado que o BAC atua na superfície ocular como citotóxico, pró apoptótico e pró inflamatório, diminuindo a viabilidade celular e estimulando a expressão de citocinas inflamatórias⁽²⁵⁾. A exposição ao BAC pode ter papel importante na precipitação e aceleração do processo de instalação da síndrome do olho seco e na piora de olho seco preexistente, afetando tanto a córnea quanto a conjuntiva. O mecanismo fisiopatológico responsáveis por estes efeitos deletérios proporcionados pelo BAC relacionam-se a desequilíbrio no filme lacrimal, inflamação da superfície ocular e dano epitelial⁽²³⁾.

Independentemente do estímulo inicial, ocorre um ciclo vicioso inflamatório na superfície ocular, levando à gradual disfunção da secreção ou retenção da lágrima. O que não está claro é se, com tantos mecanismos diferentes e mesmo sem a inflamação nas fases iniciais, existiria um exame diagnóstico comum e para esse um valor de corte similar em diferentes grupos de doenças e como seria a correlação deste parâmetro a outros utilizados na prática clínica e suas limitações⁽²⁶⁾. Mais ainda, não temos hoje medidas curativas para reverter o olho seco, apenas tratamentos crônicos e paliativos⁽²⁷⁾. Diante dessas dúvidas se faz necessário o aprimoramento de modelos animais para o estudo da doença e aprimoramento do conhecimento dos mecanismos de doença e estratégias terapêuticas definitivas.

O objetivo desse estudo foi descrever um modelo animal de olho seco por toxicidade utilizando o BAC e avaliar os parâmetros clínicos utilizados para o diagnóstico de olho seco e as alterações histológicas induzidas pela toxicidade ao BAC.

MÉTODOS

Esse estudo foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa animal da (CETEA-FMRP) – Comissão de Ética em Experimentação Animal da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (USP) e segue as diretrizes internacionais para estudos com animais.

O olho seco foi induzido pela instilação tópica de cloreto de benzalcônio, conforme descrito anteriormente⁽²⁵⁾. Foram utilizados ratos wistar machos de 8 semanas obtidos do Biotério Central da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto. Os animais tiveram acesso livre à ração e água. Os animais (n=5) receberam instilação tópica de 5 µl cloreto de benzalcônio a 0,2% sem aditivos (Ophthalmos Ltda., São Paulo, Brasil), 2 vezes por dia (7 e 19h) durante 7 dias no olho direito. O olho contralateral foi preservado para ser utilizado como controle.

Os animais foram submetidos à avaliação propedêutica de superfície ocular, em ambiente com controle de umidade e temperatura e pelos mesmos examinadores, sem a utilização de colírio anestésico após sete dias de tratamento tópico com colírio de BAC 0,2%. As avaliações de corantes vitais foram fotografadas e quantificadas por 2 examinadores posteriormente em duplo cego. As técnicas utilizadas nesse estudo para avaliação da superfície ocular e do filme lacrimal são descritas a seguir e foram realizadas nesta ordem⁽²⁸⁾.

RESULTADOS

Osmolaridade do filme lacrimal

Foi encontrado diferença estatisticamente significante na osmolaridade do filme lacrimal dos grupos estudados (p<0,05), sendo demonstrado hiperosmolaridade da lágrima no grupo tratado com BAC 306,4±9,1mOsmol/L, comparado com o grupo controle 284,8±7,3 mOsmol/L (figura 1).

Figura 1 Imagem demonstrativa da realização da medida da osmolaridade lacrimal pelo osmômetro Tearlab Osmolarity System^® (A) e gráfico demonstrando elevação da osmolaridade no grupo tratado com BAC (B) (*p<0,05) 

Volume lacrimal

Através do teste de fenol vermelho foi avaliada a produção da fração aquosa do filme lacrimal. Neste teste observou-se a diminuição (p<0,05) do volume lacrimal nos olhos submetidos à aplicação do BAC 3,4±1,5mm demonstrando oposição aos olhos não tratados 7,6±4,5mm (figura 2).

Figura 2 Demonstração do teste de fenol vermelho (A) e gráfico evidenciando diminuição da secreção lacrimal no grupo tratado com BAC (B) (*p<0,05) 

Corantes vitais

Os olhos tratados com o BAC demonstraram uma maior impregnação tanto pela fluoresceína quanto pela lisamina verde como observado na figura 3 (p<0,05). No grupo controle observou-se coloração 1,0±1,7 e 2,2±1,6 para fluoresceína e lisamina, respectivamente. Enquanto que em olhos tratados com BAC a impregnação dos corantes foi de 8,4±3,0 para fluoresceína e 9,8±3,3 para lisamina (figura 3).

Figura 3 Fotografias representativas de olhos não tratados e tratados com BAC corados com fluoresceína (A e B, respectivamente); corados com lisamina verde (C e D, respectivamente); gráficos quantificando a maior impregnação pelo corante no grupo de animais tratados com BAC (E e F) (*p<0,05) 

Microscopia óptica

Na avaliação da espessura epitelial corneana, notou-se significativa redução desta nos animais tratados em confrontação aos valores observados no grupo não tratado (p<0,05)(figura 4).

Figura 4 Imagens representativas dos cortes histológicos das córneas dos animais tratados (A); não tratados (B); avaliação da espessura epitelial das córneas dos dois grupos (C) (*p<0,05) 

DISCUSSÃO

O presente estudo descreve um modelo animal de olho seco induzido pela aplicação tópica de cloreto de benzalcônio em ratos. A ação tóxica na superfície ocular causada por este composto foi avaliada em diversos parâmetros utilizados na prática clínica, tais como os corantes vitais, fluoresceína e lisamina verde; o volume lacrimal, incluindo a medida da osmolaridade da lágrima. Além disso, descrevemos ainda alterações histológicas da córnea nos animais tratados quando comparados aos controles.

O olho seco é uma condição multifatorial e complexa, nossos achados poderão apoiar a elucidação da fisiopatologia da síndrome do olho seco e servir de modelo para testes terapêuticos pré-clínicos.

A hiperosmolaridade é tida como um fator importante no ciclo vicioso que rege a fisiopatologia do olho seco, tanto como sinal inicial e perpetuador da doença uma vez que catalisa a inflamação e diminui a secreção lacrimal subsequente^{(22, 30)}. Desta forma, um modelo animal de doença que reproduz o padrão de aumento da osmolaridade se torna valioso para estudos de mecanismos e tratamentos do olho seco.

A medida da osmolaridade do filme lacrimal tem sido realizada em humanos com o osmômetro Tearlab Osmolarity System®, com grande facilidade de execução uma vez que a coleta de lágrima no menisco lacrimal inferior é feita por capilaridade de forma rápida e pouco invasiva e a leitura realizada imediatamente⁽³¹⁾. No modelo animal descrito, conseguimos a obtenção deste dado de valor propedêutico com boa reprodutibilidade e distribuição homogênea nos grupos, utilizando o mesmo equipamento e técnica padronizado em humanos; esse recurso permitirá em estudos prospectivos acompanhar a evolução da doença e resultados de tratamentos, com um modelo animal de simples reprodutibilidade e de rápida indução.

Corroborando com o descrito acima, os dados obtidos nesse estudo demonstram a factibilidade da avaliação da osmolaridade do filme lacrimal no campo experimental sem grandes dificuldades na sua aplicação em modelos animais, sendo necessária mínima contenção do animal e dispensando sedação, extrapolando assim ao modelo animal as características do teste já observadas na prática clínica.

Acreditamos que o mecanismo indutor de olho seco reproduzido neste experimento deva-se, provavelmente, à denervação parcial da córnea e inflamação e redução da produção de secreção. Porém, futuros ensaios são necessários para o melhor entendimento das vias relacionadas a esses mecanismos nesse modelo em questão. Tais eventos provavelmente ocorrem em usuários crônicos de colírio que tem conservante a base desse composto amônio quaternário, uma vez que achados similares são descritos por exemplo, em pacientes portadores glaucoma sob terapêutica tópica prolongada e múltiplas doses⁽³²⁾.

Na propedêutica disponível na atualidade tem-se a coloração com fluoresceína como detector das irregularidades e da desepitelização das superfície córneo-conjuntival que surge em diversas patologias que agridem a superfície ocular, sendo que no olho seco devido à inflamação e toxicidade impostas ao epitélio córneo-conjuntival, demonstrada neste estudo pela maior impregnação do colírio nas superfícies oculares dos olhos tratados com BAC. Do mesmo modo, procedeu-se a coloração com a lisamina verde e, mais uma vez, como já o era esperado, no modelo animal de olho seco esta impregnação foi mais intensa do que nos olhos do grupo controle. Além destas ferramentas, o volume lacrimal diminuído, já bem consolidado como sinal na síndrome do olho seco, também foi observado nesse modelo animal de olho seco. Somado a isso, promoveu-se a análise de parâmetros histológicos dos cortes de córnea dos animais tratados e não-tratados com BAC, quantificados nesse estudo pela medida da espessura do epitélio corneano, que não surpreendentemente, demonstrou-se menor nos olhos dos animais pertencentes ao grupo tratado, o que descende, dentre outros fatores, da lesão direta às camadas celulares deste tecido e da diminuição da densidade de populações (estímulo a apoptose) de células com potencial germinativo que dão origem às células epiteliais devido à inflamação existente na doença. Desta forma, os achados observados no modelo animal descrito neste estudo refletem os parâmetros clínicos utilizados na propedêutica da disfunção lacrimal e da superfície ocular descritas no olho seco.

O BAC, como já citado, é um importante conservante utilizado frequentemente em formulações oftálmicas. O papel dos conservantes é de extrema relevância, principalmente nas medicações de uso prolongado e apresentação multidose, tais como as medicações hipotensoras. O potencial tóxico para a superfície ocular advém de sua ação detergente no filme lacrimal, além de ação pró-inflamatória e pró-apoptótica e tem sido reconhecido em diversos estudos⁽²³⁾.

CONCLUSÃO

O presente estudo avançou na demonstração de um modelo de síndrome de olho seco induzido por toxicidade, com a aplicação tópica de BAC em ratos e na utilização inédita em animais da medida de osmolaridade da lágrima através de um método já incorporado na prática clínica em humanos, assim como os corantes de superfície, a medida do volume lacrimal e osmolaridade da lágrima. No futuro, espera-se que esses achados sejam usados para estudos dos mecanismos fisiopatológicos e propostas de tratamento definitivo e eficaz da doença.