Efeito da mitomicina C em polipose nasossinusal eosinofílica, in vivo: dosagem de IL5 e GM-CSF, RT-PCR

Resumos

Eosinophilic nasosinusal polyposis is a chronic inflammatory infection with elevated infiltration of eosinophils, which presents high rate of recurrence after surgical treatment. The continuous inflammatory process that leads to the formation of polyps requires constant clinical treatment. Contributing to the maintenance of eosinophilia are cytokines IL5 (interleukin-5) and GM-CSF (granulocyte macrophages colony-stimulating factor), which show up in elevated concentrations. These oligoproteins diminish the rate of apoptosis and prolong the survival of eosinophils. AIM: By diminishing these cytokines, the action of Mitomycin C (MMC), an antineoplasic drug which inhibits the synthesis of DNA, was studied. In a recent study the power of this drug to cause apoptosis in eosinophils, in vitro, of nasal polyps was verified. METHODOLOGY: A biopsy of the nasal polyps was undertaken in 15 patients carriers of eosinophilic nasosinusal polyposis 24 hours after applying 0.5 mg/ml of MMC during five minutes. RT-PCR (reverse transcription of polymerase chain reaction) for IL5 and GM-CSF was the method used to obtain the results. RESULTS: The comparison of the results of GM-CSF pre- and post-application of MMC, when the paired T-test was used, showed p=0.041 and for IL5 we found p<0.001. CONCLUSION: Topic use of MMC in patients with eosinophilic nasosinusal polyposis shows statistically significant reduction for GM-CSF and significant and important reduction for IL5.

nasosinusal polyposis; eosinophils; mitomycin C; interleukin 5; GM-CSF

ARTIGO ORIGINAL

Efeito da mitomicina C em polipose nasossinusal eosinofílica, in vivo: dosagem de IL5 e GM-CSF, RT-PCR

Mirian Cabral Moreira de Castro^I; Evaldo Assunção^II; Mariana Moreira de Castro^III; Ricardo Nascimento Araújo^IV; Roberto Eustáquio Guimarães^V; Flávio Barbosa Nunes^VI

^IMestranda em cirurgia na Faculdade de Medicina/UFMG Professora da Faculdade de Medicina da Ciências Médicas, Preceptora da residência médica do Hospital das Clínicas da UFMG e Santa Casa de Misericórdia

^IILivre-docente, Professor adjunto do departamento de parasitologia da Universidade Federal de Minas Gerais

^IIIResidente de Otorrinolaringologia do Hospital das Clínicas da UFMG

^IVDoutor em parasitologia - UFMG, Pós-doutorando em parasitologia pela UFMG

^VLivre-Docente, Professor adjunto do departamento de oftalmologia, otorrinolaringologia e fonoaudiologia da Universidade Federal de Minas Gerais

^VIMestre em Otorrinolaringologia pela Escola Paulista de Medicina, Preceptor da residência médica do Hospital das Clínicas da UFMG

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

A polipose nasossinusal eosinofílica (PNS) é manifestação de uma doença inflamatória crônica na mucosa do nariz e nos seios paranasais caracterizada por infiltração de granulócitos eosinófilos. O fator responsável pela eosinofilia e manutenção dessas células com a perpetuação do processo inflamatório e formação polipóide é objeto constante de estudos. As citocinas como IL5 (interleucina 5) e GM-CSF (fator estimulador de colônia granulócito macrófago) aumentam a sobrevida dos eosinófilos e prolongam a sua presença no tecido polipóide, diminuindo o índice de apoptose eosinofílica.

OBJETIVO: Avaliar o efeito da mitomicina C - MMC - por meio de aplicação tópica em pacientes portadores de PNS eosinofílica quanto à presença de IL5 e GM-CSF.

CASUÍSTICA E MÉTODOS: Quinze pacientes portadores de PNS eosinofílica foram submetidos à aplicação tópica de MMC na concentração de 0,5mg/ml, 1ml, durante cinco minutos, na cavidade nasal direita, e submetidos à biópsia para RT-PCR 24hs após. O grupo-controle foi a cavidade nasal esquerda. O perfil de citocinas foi analisado para IL5 e GM-CSF.

RESULTADOS: A comparação dos resultados de GM-CSF pré e pós-uso de MMC quando usamos o teste t pareado apresenta p=0,041. A comparação para IL5 resulta em p < 0,001.

CONCLUSÃO: O uso de MMC em pacientes com PNS mostra redução com significância estatística par GM-CSF e importante significância para IL5.

Palavras-chave: polipose nasossinusal, eosinófilos, mitomicina c, interleucina 5, GM-CSF.

INTRODUÇÃO

A polipose nasossinusal - PNS eosinofílica - é uma afecção inflamatória crônica proliferativa que se manifesta na mucosa do nariz e nos e seios paranasais e caracteriza-se por degeneração polipóide benigna (Figura 1). Geralmente é bilateral, tem maior incidência na quarta década de vida e acomete 2,7 % da população, com predomínio de 2,2/1 no sexo masculino. Está fortemente associada à asma; 1/3 dos pacientes portadores de PNS eosinofílica tem asma, portanto, o exame completo do aparelho respiratório deve ser rotina. Associa-se também à NARES (rinite eosinofílica não-alérgica), intolerância aspirínica, sinusite fúngica alérgica e síndrome de Churg-Strauss^1,2.

Histologicamente caracteriza-se por infiltração de granulócitos eosinófilos, cujo mecanismo patogênico não é totalmente conhecido, além de alterações morfológicas como a hiperplasia da membrana basal, irregularidade de distribuição glandular, metaplasia escamosa e edema (Figura 2)^3,4.

Embora tenha sido atribuída à hipersensibilidade mediada por IgE, ou alergia nasal, estudos mostram que a alergia é apenas uma possível causa ou um fator contribuinte^5-7. Os eosinófilos e as células estruturais dos pólipos secretam citocinas que mantêm o processo contínuo de inflamação e acúmulo de eosinófilos⁸. Citocinas como IL5 e GM-CSF aumentam a sobrevida dos eosinófilos e prolongam sua presença no tecido polipóide, diminuindo o índice de apoptose dessas células^9-12.

Os eosinófilos expressam receptor CD40 para produção autócrina de GM-CSF e CD40L é expresso por células T CD4 que estão presentes na PNS eosinofílica¹³.

A alta concentração de IL5 encontrada na PNS eosinofílica sugere um efeito autócrino para essa citocina na ativação dos eosinófilos, existindo ainda forte relação entre IL5 e ECP (proteína catiônica eosinofílica)^10,14. Esse aumento das citocinas está relacionado com aspecto genético das células da PNS eosinofílica⁵.

A maioria dos tratamentos tem como base o uso de corticóide sistêmico por curto período de tempo e tópico por tempo prolongado, além do tratamento cirúrgico¹⁵.

A MMC é um agente antineoplásico produzido por Streptomyces caespitosus que tem sido usada como agente antiproliferativo na concentração de 0,4mg/ml. Sua ação em fibroblastos leva à diminuição de formação de tecido cicatricial quando aplicada após procedimentos cirúrgicos. Tem ação tempo dependente e sua aplicação por cinco minutos tem efeito mensurável na proliferação e morfologia celular por até 36 dias in vitro¹⁶.

O mecanismo de ação da MMC baseia-se na indução seletiva da síntese de DNA, recombinação e troca de cromatinas irmãs. Sua associação com outras drogas antitumorais leva ao aumento do efeito citotóxico da mesma pelo crescimento da indução da apoptose^17-19.

Crosara et al. (2004) demonstraram que a MMC é eficaz na indução de apoptose em eosinófilos presentes em estroma de pólipos nasais eosinofílicos in vitro. Realizaram estudo pareado em nove amostras cultivadas. Os pólipos receberam tratamento de 0,4mg/ml durante cinco minutos e foram corados com hematoxilina eosina¹⁵.

Em aplicação tópica, essa droga tem sido usada em oftalmologia, otologia e laringologia sem toxicidade sistêmica, sendo, portanto, considerada segura. Não provoca sangramento, necrose ou infecção quando utilizada em dacriocistorrinostomia externa ou lesões ciliares permanentes em concentração de até 1mg/ml^16,18,20-27.

Este estudo tem como objetivo avaliar a ação da MMC, in vivo, em portadores de PNS eosinofílica por meio da análise de IL5 e GM-CSF, pré e 24hs pós-aplicação utilizando-se de RT-PCR (transcrição reversa em reação de cadeia da polimerase).

CASUÍSTICA E MÉTODOS

Esta pesquisa compôs-se de pacientes portadores de PNS eosinofílica que concordaram em participar do estudo, após aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa. As variáveis constituíram-se do perfil de GM-CSF e IL5. Foram estudados quinze pacientes, seis do sexo feminino e nove do sexo masculino. A faixa etária variou de 30 a 57 anos.

Como critério de inclusão, adotou-se: presença de PNS eosinofílica e ausência de intolerância aspirínica. Considerou-se pólipo eosinofílico quando a eosinofilia tecidual foi maior do que 30% dentre as células inflamatórias, determinada pelo encontro de pelo menos quatro eosinófilos em cada campo microscópico de grande aumento28. Pacientes com história prévia de intolerância aspirínica, submetidos à cirurgia prévia, ou portadores de asma grave corticóide dependentes foram excluídos.

Os pacientes selecionados foram submetidos à aplicação de MMC sobre os pólipos da cavidade nasal direita, na concentração de 0,5mg/ml em algodão embebido em 1 ml da droga, onde permaneceu durante cinco minutos. A cavidade nasal esquerda não manipulada foi o grupo-controle, considerado como pré-aplicação.

Biópsia para PCR - Após 24 horas da aplicação da MMC, realizaram-se biópsias na cavidade direita e, em seguida, na cavidade esquerda. Os tecidos colhidos que apresentavam tamanho médio de 10mm foram imediatamente conduzidos ao Laboratório de Imunologia da UFMG, onde permaneceram a 80 graus negativos.

O perfil de citocinas foi pesquisado no tecido polipóide por meio de transcrição reversa em reação de cadeia da polimerase (RT-PCR) para IL5 e GM-CSF.

Sequência de iniciadores utilizados nas PCRs

Gene Forward Reverse

GM-CSF AGAAATGTTTGACCTCCAGGA TTGCACAGGAAGTTTCCG

IL 5 CTGAGGATTCCTGTTCCTGT CAACTTTCTATTATCCACTC

Os produtos da PCR foram analisados por eletroforese em gel de poliacrilamida 8% corado pela prata. Os géis foram fotografados utilizando o sistema de foto-documentação AlphaDigiDoc 1201, e as bandas resultantes da PCR para cada amostra foram analisadas por densitometria utilizando o programa AlphaEaseFC software versão 3.3.0 (Alphalnnotech) (Figura 3). Esse programa calcula o valor integrado de densidade (IDV - integrated density value) para cada banda que é definida com a intensidade dos pixels da região delimitada pela banda subtraída da intensidade dos pixels da coloração de fundo da coluna da banda no gel.

RESULTADOS

Em relação aos valores obtidos para IL5, na Figura 4 observa-se o gráfico box-plot da distribuição pré e pós-aplicação de MMC. Constata-se que 75% (parte superior da caixa) dos valores de IL5 pós estão abaixo de 3.000 enquanto quase 100% (linha inferior do Gráfico pré) dos valores de IL5 pré estão acima desse valor.

A comparação da média de IL5 pré e pós, usando o teste t pareado, apresentou p<0,001, indicando uma importante significância estatística.

Em relação aos valores de GM-CSF na Figura 5, observa-se o gráfico box-plot da distribuição dos valores de GM-CSF pré e pós- aplicação de MMC e constata-se que 75% (parte superior da caixa) dos valores de GM-CSF pós estão abaixo de 15.000 enquanto apenas 50% dos valores de GM-CSF pré estão abaixo desse valor (linha do meio do Gráfico pré).

A comparação da média de GM-CSF pré e pós, usando o teste t pareado, apresentou p =0,041, concluindo-se que a diferença observada tem significância estatística.

Na Figura 6, observa-se o gráfico box-plot da distribuição dos valores da redução percentual de GM-CSF e IL5. Podemos observar que praticamente mais de 75% dos pacientes tiveram uma redução de IL5 maior que 60%, pois a primeira linha da caixa está pouco abaixo desse valor, e que 75% dos pacientes apresentaram redução de GM-CSF menor que 60%, pois a linha superior da caixa está pouco abaixo desse valor.

Na Tabela1 são apresentados os valores do coeficiente de correlação de Pearson para a comparação da porcentagem de variação da IL5 e GMCSF com as variáveis contínuas.

Não foi observada nenhuma correlação com significância estatística, ou seja, a variação na porcentagem de redução na IL5 e GMCSF não foi acompanhada pela variação de nenhuma das outras variáveis.

DISCUSSÃO

A participação de polimorfonucleares na interface epitelial da mucosa nasal e em outras doenças rinológicas está bem estabelecida. A concentração aumentada de citocinas demonstra sua natureza inflamatória. Os eosinófilos são fontes de interleucinas que têm efeito autócrino e modulador de função de outras células¹⁴. A continuidade da resposta inflamatória presente na PNS eosinofílica está relacionada com citocinas como IL5 e GM-CSF que aumentam a sobrevida e diminuem o índice de apoptose dos eosinófilos^7,8,10-12. Portanto, regulam a proliferação e ativação celular ampliando a resposta imune local e formação de pólipos. Os eosinófilos expressam IL5 em todas as PNS eosinofílicas e, aproximadamente 30% dos eosinófilos apresentam expressão genética para GM-CSF, com evidências de efeito autócrino dessas citocinas¹⁴. O clearance dos eosinófilos seria um mecanismo para diminuição do processo inflamatório. A produção das citocinas está relacionada com o fenótipo das células teciduais, e vários estudos demonstraram a participação-chave de IL5 e GM-CSF na manutenção da atividade inflamatória. Portanto, o bloqueio dessas citocinas seria uma forma terapêutica para melhora de tal afecção. Uma única aplicação de MMC durante cinco minutos tem efeito mensurável na proliferação e na morfologia celular por até 36 dias in vitro¹⁶.

Crossara et al. demonstraram que a MMC é eficaz na indução da apoptose em eosinófilos presentes em estroma de pólipos nasais eosinofílicos. Foi feito estudo pareado de nove amostras cultivadas e observou-se que culturas tratadas com MMC apresentaram índice de apoptose em 12 horas significativamente maior em relação ao grupo-controle (p<0,001)¹⁵.

A MMC mostrou ação inibitória da síntese de DNA com inibição da proliferação de muitas linhas celulares. Kim et al. demonstraram que seu efeito antifibroblastos humanos cultivados pode ser mediado não só pela ação antiproliferativa, mas também pelo grau de apoptose induzida²¹.

Nosso objetivo neste trabalho é demonstrar a ação da MMC na redução da concentração das principais citocinas que atuam na manutenção do processo inflamatório da PNS eosinofílica, trabalho não encontrado ainda na literatura médica.

O teste t-pareado mostrou que os valores de GM-CSF pós MMC foram significativamente menores que os valores pré (p=0,041). Comparando-se os valores de IL5 pré e pós MMC, encontramos importante redução, ou seja, a medicação foi eficaz na redução dessas substâncias. Comparando-se a porcentagem com as outras variáveis, não foi identificada nenhuma variável que apresentasse uma correlação significativa.

A MMC pode ser uma opção para tratamento pós-cirúrgico da PNS eosinofílica. Outros estudos são necessários para melhor uso dessa droga nessa afecção.

CONCLUSÃO

Em relação à ação da MMC nas principais citocinas envolvidas no processo inflamatório da formação da PNS e em relação à idade e percentagem dos eosinófilos, conclui-se que:

1. Os valores de IL5 pós-aplicação de MMC foram menores que os valores pré-uso da MMC com importante significância estatística;

2. Os valores de GM-CSF pós-aplicação de Mitomicina C foram menores que os valores pré-uso da MMC com significância estatística.

Este artigo foi submetido no SGP (Sistema de Gestão de Publicações) da RBORL em 21 de agosto de 2005.

Artigo aceito em 23 de setembro de 2005.

Trabalho premiado no IV Congresso Triológico de 2005

Departamento de Oftalmologia, Otorrinolaringologia e Fonoaudiologia da Universidade Federal de Minas Gerais. Laboratório de Imunologia: Prof. Evaldo Nascimento.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  08 Ago 2006
• Data do Fascículo
  Fev 2006

Histórico

• Aceito
  23 Set 2005
• Recebido
  23 Set 2005