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Revista Ceres

versão impressa ISSN 0034-737X

Rev. Ceres vol.59 no.2 Viçosa mar./abr. 2012

http://dx.doi.org/10.1590/S0034-737X2012000200006 

FISIOLOGIA E BIOTECNOLOGIA VEGETAL

 

Germinação, crescimento e desenvolvimento in vitro de orquídeas (Cattleya spp., Orchidaceae)

 

Germination, growth and development in vitro of orchids of the genus Cattleya

 

 

Danieli SchneidersI; Rosete PescadorII, *; Maristela Raitz BoozIII; Rogério Mamoru SuzukiIV

IBióloga. Mestranda em Engenharia Ambiental, Programa de Pós-Graduação em Engenharia Ambiental, Universidade Regional de Blumenau, Rua Antônio da Veiga, 140, Victor Konder, 89012-900, Blumenau, Santa Catarina, Brasil. s.danieli@yahoo.com.br
IIEngenheira-Agrônoma, Doutora. Departamento de Fitotecnia, Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Universidade Federal de Santa Catarina, Rodovia Admar Gonzaga, Km 3, Itacorubi, 88034-001, Florianópolis, Santa Catarina, Brasil e-mail: rosete@cca.ufsc.br
IIIBacharel em Biologia e Ciências Contábeis, Mestre. Programa de Pós-Graduação em Engenharia Ambiental, Universidade Regional de Blumenau, Rua Antônio da Veiga, 140, Victor Konder, 89012-900, Blumenau, Santa Catarina, Brasil. maristela.rb@terra.com.br
IVBiólogo, Doutor. Pesquisador Científico, Núcleo de Pesquisa Orquidário do Estado, Instituto de Botânica, Av. Miguel Stefano, 3687, Água Funda, 04301-902, São Paulo, São Paulo, Brasil. rogeriomsuzuki@yahoo.com.br

 

 


RESUMO

As orquídeas no ambiente natural sofrem exploração devido a sua importância ornamental, levando algumas espécies à extinção. O cultivo in vitro é uma forma alternativa para a conservação ex-situ. Procurou-se determinar um meio de cultura eficiente para a germinação in vitro de sementes e o crescimento inicial de plântulas de Cattleya forbesii, bem como para o crescimento de plântulas in vitro de Cattleya harrisoniana. No primeiro caso, sementes foram inoculadas em meio de cultura básico de Murashige & Skoog (MS) = T1 e MS básico acrescido de 2,5 g L-1 de carvão ativado (CA) = T2. No segundo, plântulas com 1 ± 0,2 cm de altura foram submetidas aos tratamentos T1, T2, MS com a metade da concentração original de macro-micronutrientes (T3) e MS com a metade da concentração original de macro-micronutrientes suplementado com 1,25 g L-1 de CA (T4). Verificou-se aos 30 dias em C. forbesii uma porcentagem de germinação de 45% em T1 e 90% em T2. A adição de CA ao meio de cultura trouxe aumento na altura de plântulas de C. forbesii de acordo com análises realizadas aos 180 dias de cultivo. Em relação ao crescimento de C. harrisoniana, aos 240 dias observou-se que todos os parâmetros médios avaliados (altura da parte aérea, massa de matéria fresca total, número de raízes e folhas, comprimento da maior raiz e diâmetro do pseudocaule) foram significativamente maiores em T2. Dessa forma, sugere-se o uso do meio MS acrescido de 2,5 g L-1 de CA (T2), uma vez que é significativamente favorável tanto para a germinação de sementes quanto para o crescimento de ambas as espécies.

Palavras-chave: carvão ativado, meio de cultura, micropropagação, orquídeas.


ABSTRACT

Orchids are over-exploited in their natural environment due to their ornamental importance, which is leading some species to extinction. In vitro culture is an alternative for ex-situ conservation. Our objective was to determine an efficient medium for in vitro seed germination and initial seedling growth of Cattleya forbesii and Cattleya harrisoniana. Seeds of Cattleya forbesii were incubated in Murashige & Skoog (MS) medium (T1) and MS added with 2,5 g L-1 of activated charcoal (T2). For the last, plants with 1 ± 0,2 cm of height were submitted to the following treatments: T1, T2, MS reduced to the half strenght (T3) and MS reduced to the half strenght supplemented with 1,25 g L-1 of activated charcoal (T4). Thirty days after seed inoculation of C. forbesii, it was verified 45% and 90% of germination in T1 and T2, respectively. The addition of activated charcoal also promoted an increase in the height of the C. forbesii seedlings after 180 days of in vitro cultivation. After 240 days of culture of C. harrisoniana shoot height, total fresh mass, number of roots and leaves, length of the largest root and diameter of the shoots were significantly stimulated in T2 compared to the other treatments. We suggest the use of MS medium added with 2,5 g L-1 of activated charcoal because is significantly favorable for seed germination and initial growth for both species.

Key words: activated charcoal, medium culture, micropropagation, orchids.


 

 

INTRODUÇÃO

As orquídeas são plantas herbáceas perenes bastante diversificadas quanto ao tamanho, à forma dos caules e folhas e à cor das flores. Espécies de orquídeas são comercialmente cultivadas para produção e venda em vaso e de flores para arranjos ornamentais (Tombolato & Costa, 1998).

Devido às características ornamentais, as orquídeas apresentam relevante importância econômica, por isso são retiradas excessivamente da natureza, levando inúmeras espécies à extinção. Nas duas últimas décadas, as técnicas de cultivo in vitro têm sido utilizadas para a propagação de orquídeas, para o estudo de aspectos fisiológicos relacionados ao crescimento e desenvolvimento e como método de conservação ex-situ para redução do risco de extinção (Ferreira & Suzuki, 2008).

Cattleya L. é um gênero de orquídea intensamente comercializado na atualidade. Agrupa inúmeras espécies e milhares de híbridos que apresentam flores grandes e vivamente coloridas (Paula & Silva, 2004). A maioria das pesquisas em propagação vegetal de orquídeas está pautada na produção de protocolos de germinação ou organogênese in vitro, como multiplicação de Cattleya x mesquitae L. C. Menezes (Ramos & Carneiro, 2007), desenvolvimento de plantas de Cattleya loddigesii Lindl., após a germinação (Moraes et al., 2009), e propagação de Cattleya walkeriana Gardner e Schomburgkia crispa Lindl. (Sousa et al., 2007).

Cattleya forbesii Lindl. e Cattleya harrisoniana Bateman ex Lindl. var. alba Barb.Rodr. são importantes espécies por causa da beleza de suas flores. C. forbesii é de médio porte, com cerca de 20 cm de altura e duas a quatro flores, em geral de coloração marrom a amarela, de labelo rosa a amarelo-ouro e sépalas e pétalas finas (Cardoso & Israel, 2005). A variedade alba de C. harrisoniana é caracterizada por apresentar fácil florescimento, geralmente no final do verão, e altura de uma planta adulta de até 20 cm, com duas a três flores de coloração violeta e labelo de pontas amarelas, pseudobulbo delgado e folhas estreitas (Withner, 1988).

A germinação de sementes de orquídeas in vitro vem sendo realizada desde o início do século passado, quando Knudson (1922) descreveu a germinação em meio de cultura asséptico. De acordo com Martini et al. (2001), a semeadura assimbiótica de orquídeas constitui técnica bastante relevante do ponto de vista comercial e ecológico. As plantas produzidas dessa forma podem ser utilizadas em programas de reintrodução de espécies nativas em áreas de preservação ambiental devido à variabilidade genética gerada pelo explante. O sucesso na tecnologia e aplicação dos métodos de cultura in vitro deve-se à melhor compreensão dos requerimentos nutricionais das células e dos tecidos em cultura. A formulação do meio de cultura é essencial para o explante, pois possibilita a presença dos constituintes necessários (minerais, vitaminas, reguladores de crescimento etc.) para seu desenvolvimento, podendo ser formulado com diferentes combinações, de acordo com os requerimentos de cada espécie (Faria et al., 2002).

Dentre os produtos que podem ser adicionados aos meios de cultura está o carvão ativado, que tem promovido alguns efeitos benéficos como melhores condições no desenvolvimento de embriões (Chagas et al., 2005) e maior crescimento de raízes (Ribeiro et al., 2000). Isso se atribui à presença de uma excelente rede de poros com grande superfície interna na estrutura do carvão ativado, em que muitas substâncias inibitórias do meio ou produtos tóxicos liberados pelos explantes podem permanecer adsorvidos (Chagas et al., 2005; Thomas, 2008).

Diante do exposto, o objetivo deste trabalho foi determinar um meio de cultura eficiente para germinação das sementes e crescimento inicial in vitro das plântulas de C. forbesii e para o crescimento de plântulas de C. harrisoniana.

 

MATERIAL E MÉTODOS

Espécies utilizadas e obtenção do material vegetal

A cápsula com as sementes de C. forbesii e as plântulas da variedade alba de C. harrisoniana foram obtidas a partir de indivíduos selecionados da coleção viva do Laboratório de Biotecnologia e Micropropagação Vegetal da Universidade Regional de Blumenau - FURB, Santa Catarina, Brasil.

Germinação das sementes e crescimento in vitro de Cattleya forbesii

Foram coletadas duas cápsulas fechadas contendo sementes maduras de C. forbesii. As sementes foram submetidas à assepsia por meio de solução de hipoclorito de sódio 1,5% durante 10 minutos, e em seguida foram realizadas três lavagens consecutivas com água destilada e esterilizada a 120 ºC sob 1,2 atm, durante 40 minutos em autoclave.

O meio de cultura Murashige & Skoog (1962) (MS) desprovido de carvão ativado (T1) e contendo 2,5 g L-1 de carvão ativado (T2) foi utilizado para a germinação das sementes. Ambos os tratamentos foram suplementados com 0,4 mg L-1 de tiamina, 100 mg L-1 de inositol, 2% de sacarose e 0,7% de ágar. O pH dos meios foi ajustado para 5,8 ± 0,05 antes da adição do ágar e, em seguida, foi esterilizado a 120 ºC e 1 atm, durante 20 minutos.

Posteriormente, em câmara de fluxo laminar horizontal, pequenas porções de sementes foram retiradas das cápsulas e colocadas em frascos com 60 mL de meio de cultura. Os frascos contendo as sementes foram mantidos em sala de cultura com fotoperíodo de 16 horas, sob 25 ± 2 ºC e densidade de fluxo de fótons de 50 µ mol m-2 s-1.

O delineamento experimental utilizado foi o inteiramente casualizado, com dois tratamentos e cinco repetições, cada uma representada por um frasco. Trinta dias após a inoculação das sementes, foi realizada a análise da porcentagem de germinação a partir da retirada de cinco amostras de cada tratamento; ou seja, de cinco frascos dos diferentes tratamentos. Foram consideradas sementes germinadas aquelas que apresentavam protocormos de coloração verde. Aos 180 dias de cultivo, o crescimento inicial foi analisado por meio da altura média das plântulas através de escala em centímetro presente na parede externa do frasco.

Crescimento in vitro de Cattleya harrisoniana

Para a realização deste experimento foram selecionadas 10 plântulas de C. harrisoniana var. alba com 1 ± 0,2 cm de altura, obtidas da germinação in vitro de sementes em meio MS, as quais foram transferidas para frascos contendo 60 mL de meio de cultura.

Os tratamentos adotados foram: meio MS (T1); meio MS suplementado com 2,5 g L-1 de carvão ativado (T2); meio MS com a metade da concentração original de macro-micronutrientes (T3); e meio MS com a metade da concentração original de macro-micronutrientes suplementado com 1,25 g L-1 de carvão ativado (T4).

Independentemente do tratamento utilizado, os meios de cultura foram acrescidos de tiamina, inositol, sacarose e ágar nas mesmas concentrações descritas para a germinação de C. forbesii. As plântulas, depois de inoculadas, permaneceram nas mesmas condições laboratoriais que as do ensaio anterior.

Dessa forma, o delineamento experimental foi o inteiramente casualizado, com quatro tratamentos, sete repetições e 10 plântulas por repetição. Duzentos e quarenta dias após o início do experimento foram avaliadas as seguintes variáveis médias: altura da parte aérea (considerando a base do pseudocaule até a extremidade da folha maior), massa de matéria fresca total, número de raízes e folhas, comprimento da maior raiz e diâmetro do pseudocaule. Diferenças significativas entre os tratamentos (média das sete repetições) foram avaliadas por análise de variância (ANOVA) e complementados pelo teste de Tukey-Kramer a 5% de significância. A distribuição normal dos dados foi verificada pelo teste de Shapiro-Wilk no software PAST versão 2.13 (Hammer et al., 2001). 

 

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Germinação das sementes e crescimento inicial in vitro de Cattleya forbesii

Adotou-se a fase de protocormo como a efetiva germinação de sementes dessa espécie, pois nas descrições de Arditti (1992) e Kraus et al. (2006) o padrão de germinação de sementes de orquídeas é bastante uniforme; ou seja, as sementes começam a intumescer, o que leva ao rompimento do tegumento seminal e à liberação do embrião. Este se desenvolve numa estrutura tuberiforme geralmente clorofilada, como foi verificado neste estudo, chamada de protocormo.

As sementes de C. forbesii germinaram aos 30 dias após a semeadura, independentemente do tratamento (T1 e T2) (Tabela 1), tendo o meio MS contendo carvão ativado (T2) promovido maior taxa de germinação das sementes em comparação com o T1, 90 ± 3% e 45 ± 3%, respectivamente.

 

 

No que se refere ao tempo de germinação, Santos et al. (2007), utilizando sementes de Cattleya bicolor Lindl., observaram a formação dos protocormos aos 20 dias após a inoculação das sementes em quaisquer dos tratamentos utilizados, independentemente da adição de diferentes concentrações de ácido naftalenoacético e ácido giberélico. Pereira et al. (2005) obtiveram 90% de germinação de Oncidium flexuosum Sims sete dias após a inoculação simbiótica das sementes, período significativamente menor ao observado neste estudo, que foi de 30 dias. As análises realizadas aos 180 dias revelaram que os protocormos se desenvolveram em plântulas com média de 1,2 cm de altura em T2 e 0,4 cm em T1 (Figura 1). Nota-se que o tratamento T2 influenciou positivamente a germinação de sementes, bem como o crescimento inicial das plântulas devido à adição de 2,5 g L-1 de carvão ativado.

 

 

Confirmando os resultados supracitados, Znaniecka et al. (2005) constataram que os meios de cultura Fast (1981) e PB2 (Kukulczanka & Paluch, 1971), suplementados com carvão ativado, foram muito eficientes para a germinação de sementes e para o crescimento das mudas de Encyclia aff. oncidioides Schltr. Hossain (2008) constatou no meio M (Mitra et al., 1976) que Epidendrum ibaguense Kunth. na presença de carvão ativado aumentou o número de sementes germinadas, estimulou o enraizamento precoce das plântulas e induziu significativamente a formação de protocormos de maior tamanho (1,63 ± 18 mm) em comparação com meios desprovidos desse componente (1,16 ± 18 mm).

A adição de carvão ativado no meio de cultura é uma prática reconhecida, e sua influência na diferença de altura média das plântulas pode ser atribuída à adsorção de substâncias inibitórias do meio ou à adsorção de produtos tóxicos liberados pelos explantes, pela manutenção do pH em valor ótimo para morfogênese (Pasqual et al., 2001; Thomas, 2008) e liberação de substâncias naturalmente presentes no carvão que poderiam promover o crescimento e escurecimento dos meios de cultura. Por outro lado, de acordo com Thomas (2008), o carvão ativado poderia atuar na adsorção de vitaminas, íons metálicos e reguladores de crescimento, resultando em efeitos positivos ou negativos para o desenvolvimento, dependendo da espécie.

Como observado neste estudo, o carvão ativado é eficiente na promoção do desenvolvimento in vitro de plantas de diferentes famílias: Bromeliaceae, Vriesea gigantea Gaudich. e Vriesea philippocoburgii Wawra (Droste et al., 2005); Piperaceae, Piper nigrum Linn. (Moura et al., 2008); e Ericaceae, Vaccinium ashei Reade e Vaccinium corymbosum L. (Mirtilo) (Damiani & Schuch, 2009).

Crescimento in vitro de Cattleya harrisoniana

Após 240 dias de cultivo in vitro, verificou-se que nas culturas de C. harrisoniana a adição de carvão ativado ao meio MS (T2) promoveu significativamente o desenvolvimento das plântulas em relação àquelas cultivadas nos demais tratamentos, apresentando valores maiores para todas as variáveis avaliadas (Tabela 2). Embora não diferisse significativamente dos tratamentos T1 e T3, as plântulas desenvolvidas no meio MS com a metade da concentração original de macro-micronutrientes e com 1,25 g L-1 de carvão ativado (T4) apresentaram maiores valores biométricos, sendo T4 o segundo melhor meio de cultura para o desenvolvimento de C. harrisoniana (Tabela 2).

A altura da parte aérea das plântulas inoculadas no tratamento T2 (MS com 2,5 g L-1 de carvão ativado) (6,62 cm) foi 54,6% maior que no tratamento T4 (MS com a metade da concentração original de macro-micronutrientes e com 1,25 g L-1 de carvão ativado) (4,28 cm). A massa de matéria fresca total (0,37 g) das plântulas crescidas no tratamento T2 foi 85% maior do que no tratamento T4 (0,20 g) (Tabela 2, Figura 2). De forma semelhante, Mohamed-Yasseen (2001) verificou aumento do comprimento de plântulas de milho quando da presença de carvão ativado no meio de cultura. Com a adição de 2,0 g L-1 de carvão ativado no meio de cultura composto de ¾ da concentração original do meio MS, Quoirin et al. (2001) observaram aumento na altura de plântulas de Acacia mearnsii De Wild., uma espécie de leguminosa. Por outro lado, Unemoto et al. (2006), avaliando os efeitos de diferentes diluições do meio MS e da adição de carvão ativado a esses meios para a micropropagação de Sinningia leucotricha H. E. Moore (Gesneriaceae), verificaram que nos meios contendo carvão ativado o desenvolvimento da parte aérea e a massa de matéria fresca total foram inibidos. Dessa forma, a adição de carvão ativado nem sempre apresenta resultado positivo para o crescimento vegetal, e as condições de cultivo são específicas para cada espécie.

 

 

Em relação ao número médio de raízes e ao comprimento médio da raiz maior, os valores médios obtidos foram 6,09 e 3,89 cm, respectivamente, para as plântulas do tratamento T2, o qual foi estatisticamente superior aos demais meios de cultura (Tabela 2, Figura 2). Segundo George (1993), o escurecimento do meio de cultura promovido pelo carvão ativado simulando uma condição de escuro promoveria o melhor desenvolvimento do sistema radicular. Entretanto, Erig et al. (2004) verificaram que o enraizamento in vitro em pereira (Pyrus communis L., Rosaceae) não foi influenciado pela presença de carvão ativado no meio de cultura, demonstrando mais uma vez que a adição de carvão ativado no meio de cultivo pode não ser benéfica.

O número médio de folhas (5,21) e o diâmetro médio do pseudocaule (2,28 mm) apresentado pelas plântulas do tratamento T2 foram, respectivamente, 5% e 54% superiores aos encontrados em plântulas do tratamento T4, e 24,9% e 100% maiores que os menores parâmetros verificados, respectivamente nas plântulas dos tratamentos T1 e T3 (Tabela 2, Figura 2).

Diferentes respostas foram observadas no meio de cultura e da concentração de carvão ativado empregada, dependendo da espécie utilizada. Lee & Lee (2003) obtiveram resultados positivos na regeneração de brotos e raízes a partir de protocormoides de Cypripedium formosanum Hayata adicionando 1 g L-1 de carvão ativado ao meio MS com ¼ da concentração de sais. Ket et al. (2004) observaram que a adição de 1 g L-1 ao meio Hyponex suplementado de 0,1 g L-1 de benziladenina e 1-2 mg L-1 de thidiazuron promovia a formação múltipla de brotos em segmentos nodais de Anoectochilus formosanus Hayata, entretanto o crescimento era lento e os caules não se alongavam. O último comportamento foi revertido retirando-se os reguladores de crescimento e reduzindo para 0,5 g L-1 a concentração de carvão ativado adicionado. Shiau et al. (2005) mostraram que o desenvolvimento das plântulas de Haemaria discolor Lindl. era favorecido no meio MS reduzido em metade da sua concentração de nutrientes e com a adição de 2 g L-1 de carvão ativado.

Contrariamente, Pedroza-Manrique & Mican-Gutierrez (2006) verificaram que o carvão ativado adicionado a três diferentes meios de cultura, incluindo o MS, não favoreceu a germinação de sementes ou o desenvolvimento das plântulas de Odontoglossum gloriosum Linden & Rchb.f. Uma resposta diferente foi obtida por Pierik et al. (1988) em Paphiopedilum ciliolare Pfitzer, pois o carvão ativado não favorecia a germinação de sementes; entretanto, a adição 2 g L-1 estimulava o desenvolvimento das plântulas nas fases posteriores à germinação. Os resultados mais positivos neste trabalho foram obtidos quando se utilizou a composição completa do meio de cultura de MS acrescido de carvão ativado (Tabela 2).

A utilização do meio MS mostrou resultados bastante contrastantes para outras espécies de orquídeas. Stewart & Kane (2006), estudando a germinação e o desenvolvimento inicial de Habenaria macroceratitis Willd., verificaram que não houve sequer a formação do protomeristema quando utilizaram esse meio de cultura, ocasionando a morte dos protocormos. Sorace et al. (2008) avaliaram o crescimento in vitro de Oncidium baueri Lindl. em diferentes concentrações de macronutrientes e sacarose. Esses autores constataram que o desenvolvimento vegetativo e o enraizamento da orquídea foram mais eficientes no tratamento contendo 40 g L-1 de sacarose e a metade da concentração dos macronutrientes do meio MS.

Dutra et al. (2009) observaram que em Cyrtopodium punctatum (L.) Lindl. as plântulas desenvolveram-se mais rapidamente, apresentando a promoção do alongamento de caules no meio de MS com metade da concentração de nutrientes. Suzuki et al. (2009) verificaram que o meio MS não promoveu o crescimento de plântulas de Hadrolaelia tenebrosa (Rolfe) Chiron & V.P. Castro. Suzuki et al. (2010) constataram em Cattleya bicolor Lindl. que o meio MS foi o que promoveu aumento significativo do número de folhas, das massas de matéria fresca e seca de caules e da massa de matéria seca de raízes. Esses resultados contrastantes reforçam a teoria de que há um meio de cultura específico para cada espécie de orquídea, não podendo generalizar um meio de cultura nem mesmo para espécies próximas filogeneticamente.

 

CONCLUSÃO

Diante do exposto, percebe-se que Cattleya forbesii e C. harrisonina desenvolvem-se mais rapidamente em meio básico de Murashige & Skoog (MS), ou seja, com força total de macro e micronutrientes e 2,5 g L-1 de carvão ativado.

 

AGRADECIMENTOS

Ao Dr. Eduardo Pereira Cabral Gomes, do Núcleo de Pesquisa em Ecologia - Instituto de Botânica, pelo auxílio na Análise Estatística e na realização do teste de Shapiro-Wilk. À fonte financiadora: Universidade Regional de Blumenau - FURB, Programa PIPe/Artigo 170 e Fundação Fritz Muller - FFM.

 

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Recebido para publicação em 10/12/2009
Aprovado em 24/02/2012

 

 

* Autora para correspondência

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