Multiplicação in vitro de Tapirira guianensis Aubl. (Anacardiaceae)

In vitro multiplication of Tapirira guianensis Aubl. (Anacardiaceae)

BIOTECNOLOGIA VEGETAL

Multiplicação in vitro de Tapirira guianensis Aubl. (Anacardiaceae)

In vitro multiplication of Tapirira guianensis Aubl. (Anacardiaceae)

Ingrid Estefania Mancia de Gutiérrez^I; Cristina Ferreira Nepomuceno^II; Tecla dos Santos Silva^III; Priscila Tavares Fonseca^III; Vania Celene Alecrim Campos^III; Bruno Freitas Matos Alvim^III; Fernando dos Santos Carneiro^III; Mara Márcia Sampaio Albuquerque^III; José Raniere Ferreira de Santana^IV

^IFarmacêutica, Mestre. Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Feira de Santana, Avenida Transnordestina, s/n, 44036-900, Feira de Santana, Bahia, Brasil. [e-mail] (autor para correspondência)

^IIBióloga, Doutora. Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Feira de Santana, Avenida Transnordestina, s/n, 44036-900, Feira de Santana, Bahia, Brasil. [e-mail]

^IIIBiólogos, Mestres. Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Feira de Santana, Avenida Transnordestina, s/n, 44036-900, Feira de Santana, Bahia, Brasil. [e-mail]; [e-mail]; [e-mail]; [e-mail]; [e-mail]; [e-mail].

^IVEngenheiro-Agrônomo, Doutor. Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Feira de Santana, Avenida Transnordestina, s/n, 44036-900, Feira de Santana, Bahia, Brasil. [e-mail]

RESUMO

Tapirira guianensis possui grande relevância medicinal, ecológica e socioeconômica, ocorrendo em todo o território brasileiro. O objetivo deste estudo foi estabelecer e determinar as melhores condições para a sua multiplicação in vitro. Os explantes, segmentos nodais, cotiledonares e epicótilos, oriundos de plântulas germinadas in vitro, foram testados em concentrações de 6-benzilaminopurina (BAP) e, ou, ácido naftalenoacético (ANA), em meio de cultura WPM. As características avaliadas foram a percentagem de explantes responsivos, o número de brotos e de gemas, o comprimento dos brotos e a matéria seca da parte aérea, aos 30 e 60 dias após inoculação. Foi observado que o segmento cotiledonar, nas condições deste estudo, foi o explante mais indicado para a multiplicação, não havendo indução de brotos adventícios nos epicótilos. O tratamento com 1,0 mg L^-1 de BAP na ausência de ANA é o mais responsivo para a regeneração de T. guianensis.

Palavras-chave: lenhosa medicinal, propagação in vitro, regeneração, organogênese direta.

ABSTRACT

Tapirira guianensis is of great medicinal, ecological and socio-economical importance occurring throughout the Brazilian territory. The objective of this study was to establish and determine the best conditions for the in vitro multiplication of T. guianensis. The explants nodal, cotyledonary and epicotyl segments from seedlings germinated in vitro were tested in diverse concentrations of 6-benzilaminopurine (BAP) and/or napthaleneacetic acid (NAA) in medium WPM. The following parameters were evaluated: the percentage of responsive explants, the number of shoots and buds, and the length of shoots and shoot dry mass at 30 and 60 days after inoculation. The cotyledonary segment, under these conditions, is the most suitable explant for the multiplication, with no induction of adventitious buds in epicotyl. The treatment with 1.0 mg L^-1 BAP in the absence of NAA is the most responsive to the T. guianensis regeneration.

Key words: medicinal woody, in vitro propagation, regeneration, direct organogenesis.

INTRODUÇÃO

Tapirira guianensis Aubl. (Anacardiaceae), popularmente conhecida como pau-pombo ou cipiúva, é uma árvore nativa, com ampla distribuição no país (Silva-Luz & Pirani, 2010). A população emprega suas cascas e folhas para fins ritualísticos (Almeida et al., 2007) e em práticas caseiras da medicina popular, para tratar problemas de pele (Souza & Felfili, 2006).

Extratos de folhas, sementes e cascas de T. guianensis apresentaram atividade citotóxica, sendo promissor o uso contra diversas linhagens de células tumorais (David et al., 1998; Taylor et al., 2006; Mahmoud et al., 2011). Além dessa, a atividade in vitro antileishmaniose, antimalárica, antibacteriana e antifúngica foram detectadas, para substâncias isoladas do extrato clorofórmico das suas cascas (Roumy et al., 2009).

A espécie normalmente é empregada no reflorestamento de áreas degradadas, principalmente de locais úmidos (Lorenzi, 1992), graças à fácil adaptação a esse ambiente e à produção de frutos, que são altamente apreciados pela fauna (Lenza & Oliveira, 2005). Sua madeira tem aplicação na construção e obtenção de energia (Cunha & Albuquerque, 2006), o que torna a planta uma fonte alternativa de renda para as comunidades. Esse elevado potencial madeireiro de T. guianensis faz com que o vegetal esteja listado na Portaria nº 67, no qual é estabelecido o preço mínimo para a comercialização dos produtos advindos de sua madeira (SEFAZ, 2011).

Nesse contexto, a Cultura de Tecidos Vegetais, por micropropagação ou propagação in vitro, apresenta-se como uma alternativa viável para a produção de mudas, utilizadas em programas de reflorestamento ou plantio comercial da espécie, reduzindo a pressão sobre áreas nativas, nas quais impera o extrativismo, além de se obter e atender às exigências das entidades certificadoras e às necessidades dos produtores de mudas de qualidade. Segundo George (2008), a técnica permite a multiplicação rápida de genótipos, selecionados por maior produtividade, uniformidade e desempenho no campo, sendo uma importante ferramenta na propagação de mudas sadias, em tempo e espaço físico reduzidos. Diversas espécies de plantas medicinais têm sido micropropagadas com o intuito de aumentar a produção de metabólitos de interesse, quer seja por estímulo químico ou por manipulação das condições no microambiente da cultura in vitro (Moyo et al., 2011), a exemplo de algumas lenhosas, como Ephedra procera C.A. Mey., Syzygium cordatum Hochst. e Aquilaria hirta Ridl. (Parsaeimehr et al., 2010; Dewir et al., 2011; Hassan et al., 2011).

Diante do grande potencial medicinal, ecológico e socioeconômico de T. guianensis, faz-se necessário desenvolver metodologias para a multiplicação eficiente, conservação e preservação desta espécie. Até o momento, inexistem estudos, na literatura, sobre a propagação vegetativa em espécies de Tapirira. Por esse motivo, o presente trabalho objetivou avaliar a indução de brotos adventícios em explantes de plântulas assépticas de T. guianensis, obtidas in vitro.

MATERIAL E MÉTODOS

Obtenção de explantes a partir de sementes

Os frutos maduros de T. guianensis foram coletados, em março de 2009, no município de Mata de São João, Bahia. Os frutos foram levados para o Laboratório de Cultura de Tecidos Vegetais, da Universidade Estadual de Feira de Santana, onde foram selecionados, sendo descartados os que continham qualquer rasura no seu epicarpo. Os frutos íntegros foram lavados abundantemente em água corrente e detergente, sendo o último enxágue realizado com água destilada; em seguida, foram desinfestados em câmara de fluxo laminar, por imersão em etanol, a 70%, durante três minutos; em solução de cloro ativo, a 2,5%, contendo cinco gotas de detergente neutro, por 30 minutos e, por fim, lavadas sucessivas vezes em água estéril. Em seguida, foi realizado o despolpamento dos frutos, em placas de Petri, na ausência de água, com o auxílio de pinça e bisturi. As sementes foram desinfestadas em etanol, a 70%, durante um minuto; em solução de cloro ativo a 2,5%, por 15 minutos, seguidas de sucessivas lavagens em água estéril. Dez sementes foram, então, inoculadas em placas de Petri, contendo papel germitest previamente esterilizado e umedecido com água estéril, e fechadas com filme de polivinilcloreto (PVC). Após 15 dias da inoculação, quando as primeiras raízes haviam sido emitidas, as plântulas que não apresentaram contaminação microbiana foram transferidas para tubos de ensaio, contendo meio de cultura WPM (Lloyd & McCown, 1980), permanecendo por mais 30 dias, até a coleta dos explantes.

Indução de brotos a partir de explantes

Na multiplicação in vitro, três tipos de explantes foram utilizados (segmento cotiledonar, epicótilo e segmento nodal), os quais foram inoculados em diferentes concentrações de BAP (0,0; 0,5; 1,0; 1,5 e 2,0 mg L^-1) e ANA (0,0; 0,25 e 0,50 mg L^-1).

O delineamento experimental utilizado foi inteiramente casualizado em esquema fatorial 3 x 5 x 3, totalizando 45 tratamentos. Cada tratamento constou de seis repetições, cada uma constituída por quatro tubos de ensaio, cada um dos quais contendo um explante.

Após 30 e 60 dias da inoculação, foram avaliadas as seguintes variáveis: número de brotos por explante, número de gemas do maior broto e comprimento da maior brotação. A matéria seca da parte aérea e a percentagem de explantes responsivos foram avaliadas apenas aos 60 dias da inoculação.

Condições de cultivo

O meio de cultura utilizado para o estabelecimento e multiplicação in vitro foi o WPM, solidificado com 0,6% de Agar (Himedia^®) e suplementado com 3% de sacarose. O pH foi ajustado para 5,7 ± 0,01 antes da esterilização em autoclave, a 121 ºC, por 20 min. Todas as culturas foram incubadas em sala de cultura mantida a 60% de umidade relativa, temperatura de 25 ± 2 ºC, sob fotoperíodo de 16 h e uma densidade de fluxo de fótons de 60 µmol m^-2 s^-1, fornecido por lâmpadas fluorescentes brancas.

Análise estatística

Os dados foram submetidos à análise de variância (ANOVA) e as médias estatísticas comparadas pelo teste de Scott-Knott, a 5% de significância, para os fatores qualitativos e ajustes, usando as equações de regressão polinomial para os fatores quantitativos. A análise foi realizada com o software SISVAR (Ferreira, 2008).

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Das 1.600 sementes de T. guianensis inoculadas em Placas de Petri e transferidas para tubos de ensaio, 39,4% apresentaram contaminação fúngica e, ou, bacteriana. Com o mesmo tempo de imersão em hipoclorito para T. guianensis, as sementes de Swietenia macrophylla King apresentaram taxa média de contaminação bacteriana de 26,2% (Couto et al., 2004). Geralmente, a fase de estabelecimento in vitro de lenhosas é influenciada pela contaminação de micro-organismos endofíticos, não removidos durante a desinfestação superficial do tecido (Harry & Torpe, 1994). Após os 30 dias de transferência das sementes germinadas para o meio de cultura, percebeu-se que 59,8% apresentavam crescimento normal, sendo estas plântulas utilizadas para fornecer explantes à etapa de multiplicação.

Na etapa de multiplicação in vitro, observou-se que a interação tripla, para todas as variáveis analisadas, aos 30 e 60 dias, foi significativa (p < 0,01 ou p < 0,05), exceto para número de brotos e matéria seca da parte aérea avaliadas aos 60 dias, para cujos resultados houve significância (p < 0,01) para a interação dupla (concentração de BAP x concentração de ANA) (Tabelas 1, 2).

Em T. guianensis não foi possível observar, diante dos tratamentos testados, o desencadeamento da capacidade organogênica no explante epicótilo (dados não mostrados). Resultado semelhante foi observado para o hipocótilo de Erythrina velutina Willd., em que o estímulo hormonal com BAP e, ou, ANA, não foi suficiente para favorecer a formação de brotos (Costa et al., 2010). Muitos fatores podem influenciar o processo de indução organogênica, como a concentração e os tipos de reguladores vegetais, a idade do explante, o genótipo, as condições físicas do cultivo, a composição e consistência do meio de cultura (Dobránszki & Silva, 2010).

A taxa responsiva do explante segmento nodal apresentou um comportamento linear crescente, em função do aumento da concentração de BAP na ausência de ANA, podendo ser testadas concentrações acima de 2,0 mg L^-1 de BAP (Figura 1A). Para o segmento cotiledonar, na ausência e na menor concentração testada de ANA, não foi possível o ajuste de uma equação significativa com significado biológico, porém observaram-se, com maior frequência, altas taxas responsivas (80-100%) (Figura 1B).

 

Neste trabalho, percebeu-se a formação de brotos nos explantes de T. guianensis, mesmo na ausência de reguladores vegetais (Figura 2), o mesmo sendo observado para Aniba rosaeodora Ducke (Jardim et al., 2010) e Syzygium cordatum (Dewir et al., 2011). Todavia, estes resultados discordam dos obtidos para os segmentos nodais de Maclura tinctoria (L.) D. Don ex Steud. (Gomes et al., 2010) e de Myrica esculenta Buch.-Ham. ex D. Don (Bhatt & Dhar, 2004), nos quais não foi observada a iniciação do processo morfogenético, em meio de cultura ausente de reguladores. Essa maior capacidade morfogenética de alguns tecidos pode ser causada pela variabilidade genética de cada cultura (George & Debergh, 2008).

 

O maior número médio de brotos observado (3,33), aos 30 dias de inoculação, ocorreu a partir do segmento nodal. A curva de resposta na ausência de ANA indica que a utilização de BAP, na concentração estimada de 1,33 mg L^-1, atinge o maior valor estimado para a variável em análise (2,83) (Figura 2A). O resultado encontrado foi superior ao reportado para Vitis champinii Planch. (Mukherjee et al. 2010), Bauhinia cheilantha (Bong.) Steud. (Gutiérrez et al., 2011a) e Parkia biglobosa (Jacq.) R. Br. ex G. Don (Sambe et al., 2010), em que, na concentração semelhante de BAP testada, o número médio de brotos foi de 1,3, 1,6 e 1,9 por segmento nodal, respectivamente. Já para Oroxylum indicum (L.) Kurz, uma média de 7,0 brotos por segmento nodal foi observada na presença de 1,0 mg L^-1 de BAP (Gokhale & Bansal, 2009). Diante disso, percebe-se que é difícil predizer como os reguladores podem afetar o sistema fisiológico da planta.

Para a mesma variável, a partir do segmento cotiledonar, não foi possível o ajuste de uma equação significativa, com significado biológico, na ausência de ANA, sendo observado o maior número médio de brotos (3,17) na presença de 1,0 mg L^-1 de BAP (Figura 2B), resultado superior ao reportado para Parkia biglobosa, para a qual a média do número de brotos foi de 2,08 por segmento cotiledonar, em meio de cultura MS, acrescido da mesma concentração de BAP (Sambe et al., 2010).

A interação citocinina e auxina não favoreceu a formação de brotos em T. guianensis; provavelmente, a presença de ANA, nas dosagens testadas, pode ter provocado uma diminuição nos níveis de substâncias endógenas naturais, que promoveriam a divisão celular. A interação também não foi benéfica nas culturas de B. cheilantha (Gutiérrez et al., 2011b); já, para Cecropia glaziovii Snethl., a interação permitiu obter uma média de 15 brotações por segmento nodal (Alves, 2010).

Siwach & Gill (2011) reportaram um número de brotos duas vezes maior aos 60 dias da multiplicação in vitro de Ficus religiosa L., em vez de aos 21 dias, comportamento diferente do observado para T. guianensis, para a qual, aos 60 dias, independentemente do explante utilizado, o maior número médio de brotos (3,21) observado (Figura 2C) assemelha-se ao encontrado aos 30 dias de inoculação.

Aos 30 dias, a curva de resposta na ausência de ANA indicou que o uso de BAP, na concentração de 1,33 mg L^-1, permite estimar o maior valor médio (3,25) para número de gemas a partir dos brotos advindos do segmento nodal (Figura 3A). Já, para o segmento cotiledonar foi observado um maior número médio de gemas (4,5) em 1,0 mg L^-1 de BAP (Figura 3B), enquanto, aos 60 dias, o maior número de gemas estimado para os brotos advindos de segmento nodal e cotiledonar foi semelhante (4,1), quando na presença estimada de 1,74 e 1,06 mg L^-1 de BAP, respectivamente (Figuras 3C, 3D). O maior valor, estimado pelas equações quadráticas, para o comprimento dos brotos oriundos de segmentos nodal e cotiledonar, são 9,5 e 10,2 mm, quando o meio de cultura for acrescido de 1,15 e 0,92 mg L^-1 de BAP, respectivamente, ambos na ausência de ANA aos 30 dias de inoculação. Incrementos de BAP, em concentrações superiores às concentrações estimadas, tendem a desfavorecer a formação das brotações (Figuras 4A, 4B). Esses resultados divergem dos reportados por Ayub et al. (2010), para os quais as citocininas testadas foram prejudiciais ao desenvolvimento dos brotos, pois as maiores brotações (1,7 cm) de videira cv. Bordô, a partir de segmento nodal, foram obtidas no meio de cultura MS/2, na ausência de BAP.

 

 

O comprimento médio das brotações de T. guianensis, a partir do segmento cotiledonar, na ausência de ANA, estimado pelas equações quadráticas, aos 60 dias, foi de 11,8 mm, valor semelhante ao do comprimento estimado para o segmento nodal, 10,9 mm (Figuras 4C, 4D). Esses resultados são inferiores aos reportados para cultura de Vitex negundo L., advindos de segmento nodal inoculado em meio MS acrescido de 1,14 mg L^-1 de BAP, que apresentaram cerca de 45 mm de comprimento, aos 56 dias de inoculação (Ahmad & Anis, 2011), e para culturas de F. religiosa, cujas brotações advindas do segmento nodal, em 1,0 mg L^-1 de BAP, mediam 24 mm de comprimento aos 60 dias (Siwach & Gill, 2011).

Com relação à variável matéria seca da parte aérea, não foi possível o ajuste de uma equação significativa, com significado biológico, porém, o maior acúmulo massal foi observado em 0,5 mg L^-1 de BAP, independentemente da presença de ANA (Tabela 2).

Percebe-se que, para todas as variáveis analisadas na multiplicação in vitro de T. guianensis, não foi observado efeito sinérgico dos reguladores de crescimentos testados. Segundo Staden et al. (2008), a interação pode atuar sinérgica ou antagonicamente, a depender de inúmeras circunstâncias, uma vez que a presença de um determinado regulador pode afetar a biossíntese ou metabolismo de um outro regulador, alterando os níveis das substâncias endógenas, ou ainda os fatores ambientais inerentes ao processo podem modificar as respostas dos reguladores ou, até mesmo, inativá-los.

CONCLUSÃO

O presente estudo descreveu, pela primeira vez, a multiplicação in vitro para um representante do gênero Tapirira, por meio de um método eficiente para a indução de brotos adventícios, a partir do segmento cotiledonar de T. guianensis, cultivados em meio WPM acrescido de 1,0 mg L^-1 de BAP.

Recebido para publicação em 23/03/2012 e aprovado em 08/01/2013.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  23 Maio 2013
• Data do Fascículo
  Abr 2013

Histórico

• Recebido
  23 Mar 2012
• Aceito
  08 Jan 2013