Pesquisa de antigenos aglutinantes "major" 1, 2 e 3 em cepas de Bordetella pertussis, isoladas de crianças com coqueluche atendidas no Hospital de Isolamento Emílio Ribas de São Paulo, Brasil

Determination of 1, 2 and 3 major antigens in Bordetella pertussis strains isolated from Brazilian children with whooping-cough

ARTIGO ORIGINAL

Pesquisa de antigenos aglutinantes "major" 1, 2 e 3 em cepas de Bordetella pertussis, isoladas de crianças com coqueluche atendidas no Hospital de Isolamento Emílio Ribas de São Paulo, Brasil

Determination of 1, 2 and 3 major antigens in Bordetella pertussis strains isolated from Brazilian children with whooping-cough

Sebastião Timo Iaria

Do Departamento de Microbiologia e Imunologia do Instituto de Ciências Biomédicas da USP "Setor Saúde Pública" – Av. Dr. Arnaldo, 715 – São Paulo, SP – Brasil

RESUMO

Em 30 cepas de Bordetella pertussis isoladas de crianças com coqueluche, atendidas no Hospital de Isolamento Emílio Ribas de São Paulo, foram pesquisados os antígenos aglutinantes ''major" 1, 2 e 3. Levando-se em conta a presença combinada dos três antígenos, as provas de soro-aglutinação rápida em lamina revelaram que 25 (83,3%) cepas possuiam os fatores 1, 2 e 3, enquanto que 3 (10,0%) e 2 (6,7%) foram positivas, somente, para 1, 2 e 1, 3, respectivamente. Os resultados foram discutidos, considerando-se a importância deste antígeno no preparo de vacinas.

Unitermos: Coqueluche, diagnóstico de laboratório. Bordetella pertussis. Coqueluche, vacina.

ABSTRACT

The presence of major antigens, 1, 2 and 3 were determined in 30 strains of B. pertussis isolated from children with whooping-cough hospitalized at the Hospital Emílio Ribas, São Paulo Brazil. The method used was the slide-agglutination test. Tests showed that 25(83.3%) of strains were positives for factors 1, 2 and 3. Factores 1 and 3 alone were present in 3 (10%) of strains and 1 and 2 alone in 2 (6.7%).

Uniterms: Whooping-cough diagnosis, laboratory. Bordetella pertussis. Pertussis vaccine.

INTRODUÇÃO

No passado considerava-se a Bordetella pertussis como um único tipo antigênico. Leslie & Gardner¹² (1931), porém, verificaram que estas bactérias podem apresentar-se em 4 fases: I, II, III e IV. Quando recentemente isoladas, elas se apresentam na fase I e lisa e, através de sub-culturas ou em culturas velhas, vão sofrendo modificações até chegarem à fase IV, tornando-se rugosa e avirulenta. As fases II e III são intermediárias.

Estudando cepas de B. pertussis, B. parapertussis e B. bronchiseptica, muitos anos mais tarde, Andersen ¹ (1952) observou, através da prova de aglutinação, a presença de dois tipos de antígenos, sendo um do tipo "O", termoestável e comum às três espécies e um do tipo "K", de envoltório, compreendendo vários fatores termolábeis. Esse autor denominou os fatores "K" termolábeis de a, a1, a2, a3, a4, a5 e f para a B. pertussis, b, bl e g para B. parapertussis e c, cl, d, dl e g para a B. bronchiseptica. Um ano mais tarde, os antígenos "K" da B. pertussis foram denominados 1, 2, 3, 4 e 5, após terem sido estudadas cepas isoladas, empregando-se soros monoespecíficos absorvidos (Andersen², 1953).

Eldering e col.⁹ (1957) num estudo sobre antígenos termolábeis, por meio da técnica de absorção de aglutininas e da prova de soro-aglutinação, identificaram nas bactérias do gênero Bordetella, 14 fatores antigênicos "K", numerados de 1 a 14. Segundo estes pesquisadores, na B. pertussis o antígeno 1 mostra-se presente em todas as cepas e as diferenças sorológicas são dadas pela presença ou ausência dos antígenos 2, 3, 4, 5 e 6, em combinações várias; na B. parapertussis o antígeno comum é o 14, porém pode conter também os de números 8, 9 e 10; com relação à B. bronchiseptica, o antígeno comum é o 12, podendo possuir também os de números 8, 9, 10 e 11. O antígeno 13 pode estar presente nas B. pertussis e B. bronchiseptica e o 7 é comum às três espécies. Este último é mencionado por Kendrick e col. ¹¹ (1970) como "antígeno hipotético" Da forma "S" ou lisa de B. pertussis, vários componentes antigênicos têm sido isolados, como toxinas, aglutinogênios (Flosdorf & Kimball (1940), citados por Bradford³, 1965) e antígenos ditos protetores (Bradford ³, 1965).

Pelo exposto, parece que a estrutura antigênica da B. pertussis não está, até o momento, totalmente bem conhecida. O seu conhecimento, porém, é muito importante porque dele depende o preparo de vacinas eficientes para a adequada imunoprofilaxia da coqueluche.

A este respeito, é importante referir as investigações realizadas por Preston & Punga²², Preston ¹⁹,²⁰ (1963 e 1965) Preston & Evans²¹ (1963), os quais relacionaram a eficiência de vacinas com os antígenos "K" presentes nas mesmas e em estirpes de B. pertussis isoladas de doentes.

No Brasil, poucas pesquisas foram feitas sobre a eficiência de vacinas contra a coqueluche, entre elas a de Lima & Arantes ¹³ (1943) relativamente ao preparo e doses a serem aplicadas e, a de Sampaio ²⁶ (1954) o qual estudou, empregando vacina importada, a capacidade de produção de anticorpos em crianças, medida através de provas c!e soro-aglutinação. Entretanto, objetivando o conhecimento da presença dos antígenos aglutinantes "major" 1, 2 e 3 em cepas de B. pertussis isoladas de doente com coqueluche, apenas uma investigação foi realizada em nosso meio, no Rio de Janeiro (Ubatuba & Salmito ³⁰, 1970).

O presente estudo tem por finalidade verificar a presença desses antígenos em cepas de B. pertussis, isoladas de crianças com coqueluche, atendidas no Hospital de Isolamento Emílio Ribas de São Paulo.

MATERIAL E MÉTODOS

Logo após terem sido identificadas morfológica, bioquímica e urologicamente, 30 cepas de B. pertussis, isoladas em 1969 e 1970 de crianças com coqueluche atendidas no Hospital de Isolamento Emílio Ribas de São Paulo (Iaria¹⁰, 1973), foram submetidas a provas de soro-aglutinação rápida, a fim de ser determinada a presença dos antígenos aglutinantes "major" 1, 2 e 3.

Nestas provas foram empregados soros mono-específicos contra os antígenos aglutinantes 1, 2 e 3 ^*

As referidas provas de soroaglutinação foram realizadas empregando-se a técnica de Preston 19 (1963). Assim, inicialmente, prepararam-se suspensões espessas das cepas de B. pertussis, em solução de cloreto de sódio a 0,85%, partindo-se de culturas com 48 horas a 35°C, em meio de Bordet & Gengou contendo 50% de sangue desfibrinado de carneiro. A seguir foram misturadas, em lâminas separadas, uma gota de suspensão bacteriana e uma gota de soros monoespecíficos anti-antígenos 1, 2 e 3. A homogeneização das misturas foi feita, inicialmente, com alga de niquel-cromo e, posteriormente, por movimentação manual das lâminas.

As leituras, para a verificação da presença ou não de aglutinação, foram realizadas, sempre, até cinco min. após o início da prova, com o auxílio de uma lupa.

Paralelamente realizaram-se provas controles, misturando-se, em lâminas, uma gota da suspensão bacteriana em prova, com uma gota de solução de cloreto de sódio a 0,85%, a fim de se verificar a ocorrência ou não de auto-aglutinação.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Das 30 cepas de B. pertussis submetidas a provas de soro-aglutinação, frente a soros monoespecíficos anti-fatores "major" 1, 2 e 3, todas revelaram-se possuidoras do antígeno 1, como era esperado. Por outro lado, 28 (93,0%) apresentaram o antígeno 2, e 27 (90,0%) mostraram-se positivas para o 3.

Entretanto, levando em conta a presença combinada dos três antígenos, por cepa, as provas de soro-aglutinação revelaram que das 30 cepas, 25 (83,3%) possuiam os fatores 1, 2 e 3, enquanto 3 (10,0%) mostraram-se positivas apenas para 1 e 3 e somente 2 (6,7%) para 1 e 2.

Apesar do número de observações ser relativamente pequeno, podemos verificar que pelos resultados houve grande predominância de cepas apresentando, simultaneamente, os fatores 1, 2 e 3.

Este mesmo fato, entre nós, foi também observado por Ubatuba & Salmito ³⁰ (1970) no Rio de Janeiro, onde de 116 cepas isoladas de crianças com coqueluche, 70,0%) revelaram-se positivas para os fatores 1, 2 e 3, 18,0% somente para 1 e 3 e 12,0% apenas para 1 e 2. Assim, esses autores obtiveram, no Rio de Janeiro, um percentual menor de cepas apresentando os três fatores e, maior, respectivamente daquelas possuidoras dos fatores 1, 3 e 1, 2.

Considerando apenas os fatores "major" 1, 2 e 3 e comparando os resultados obtidos neste estudo com os valores encontrados em pesquisas realizadas em alguns países, podemos depreender que na Alemanha (Mebel ¹⁵, 1968) e na Rússia (Demina & Permitina, 1967, citados por Ubatuba & Salmito³⁰, 1970) os isolamentos de cepas, apresentando aqueles três fatores, são também referidos como predominantes. Porém, em outros países como o Canadá (Chalvardjian⁴ 1965), Inglaterra (Preston²⁰, 1965), Holanda (Cohen ⁵, 1958) e Estados Unidos (Eldering e col.⁸, 1969) são mais freqüentes os isolamentos de cepas possuindo somente os fatores antigênicos 1 e 3.

O conhecimento da composição antigênica da B. pertussis é importante, levando-se em conta a sua identificação sorológica aplicada ao diagnóstico e à epidemiologia da coqueluche e, também, ao preparo de vacinas altamente eficientes para a adequada imunoprofilaxia desta doença.

Da forma "S" de B. pertussis, foram isolados vários componentes antigênicos, como toxinas termolábil e termoestável, aglutinógeno, não tóxico, com capacidade de determinar, em coelhos, níveis altos de aglutininas (Flosdorf & Kimbal, 1940, citados por Bradford ³, 1965; Smolens & Mudd²⁸, 1943), hemaglutininas capazes de aglutinar hemácias humanas de camundongo e outros animais (Keogh & North, 1948, citados por Smith e col.²⁷, 1964). Estes últimos antígenos têm a propriedade de provocar a formação de anticorpos específicos em animais (Marsy ¹⁴, 1952) e eventualmente no homem (Winter³¹, 1953), mas que não dão proteção contra a doença (Pillemeri¹⁸, 1950; Thiele29, 1950 e Winter ³¹, 1953). Têm sido descritos também os chamados antígenos protetores, porém são ainda mal conhecidos (Bradford ³, 1965). Já foi atribuída capacidade protetora a um carbohidrato (Cruickshank & Freeman ⁶, 1937 e Eldering ⁷, 1942) enquanto que Flosdorf & Kimbal, 1940, (citados por Bradford ³, 1965) e Smolens & Mudd ²⁸ (1943) associaram o efeito protetor ao aglutinógeno. Por outro lado, Robbins & Pillemer ²⁵ (1950) isolaram e purificaram um antígeno considerado protetor, a partir de um extrato aquoso de B. pertussis, o qual não era carbohidrato, aglutinógeno, toxina e nem hemaglutinina.

Vários são os estudos sobre a eficácia das vacinas contra a coqueluche e destes serão referidos alguns realizados na Inglaterra.

Foi efetuado pelo Medical Research Council ¹⁶ (1951) uma investigação em crianças com 6 a 18 meses de idade, divididos em dois grupos, sendo um vacinado contra a coqueluche e outro controle. Observadas por um período de dois a três anos, verificou-se que no grupo vacinado a incidência da coqueluche foi de 18,2% enquanto que no grupo controle foi de 87,3%. Alguns anos mais tarde, o próprio Medical Research Council ¹⁷ (1965), num estudo, comprovou a correlação entre a eficiência das vacinas e a prova de proteção, realizada pela técnica de inoculação da B. pertussis por via intracerebral em camundongos, previamente vacinados.

Por outro lado, Preston ^19,20 (1953 e 1965) verificou que as amostras de vacinas por ele estudadas, preparadas na Inglaterra, apresentavam, dos antígenos termolábeis "major", na sua grande maioria, apenas os 1 e 2. Estas vacinas, segundo este pesquisador, eram altamente eficientes, pois a B. pertussis tipo 1, 2 que predominava naquele país antes de 1958, praticamente desapareceu. Verificou, também, que em 1963 e 1964 isolava-se o tipo 1, 2, 3 apenas de doentes não vacinados, e considerou que apesar de haver nas vacinas apenas os antígenos 1 e 2, elas davam também alguma proteção contra o tipo 1, 2, 3. Outrossim, de 155 cepas de B. pertussis, por ele isoladas de indivíduos vacinados e não vacinados, 85,0% pertenciam ao sorotipo 1, 3.

A este respeito, numa investigação feita pelo Public Health Laboratory Service ²⁴ (1969) foi constado que, em 1966 a 1967, cerca de 50,0% das crianças vacinadas adquiriam coqueluche e de mais de 80,0% dos casos isolavam-se cepas do tipo 1, 3.

Mais recentemente, Preston & Stanbridge²³ (1974) fizeram observações importantes relativamente a variações de sorotipos de B. pertussis. Verificaram que, por subculturas, cepas 1, 2, 3 mudaram para 1, 2 e cepas 1, 3 e 1, 2 para 1. Observaram também que cepas 1 se transformavam em 1, 2 ou 1, 3 e cepas 1, 2 em 1, 2, 3. Esses autores crêem que isto pode explicar as mudanças em sorotipos que são observadas no curso de uma infecção por B. pertussis. Isto também deve ser considerado com relação à possível instabilidade antigênica de cepas de laboratório, principalmente as utilizadas no preparo de vacinas e na produção e absorção de soros aglutinantes empregados no diagnóstico.

CONCLUSÕES

Os resultados obtidos no presente estudo permitem-nos apresentar as seguintes conclusões :

1. Das 30 cepas de B. pertussis isoladas de crianças com coqueluche, atendidas no Hospital de Isolamento Emílio Ribas de São Paulo, 80,0% possuiam os antígenos aglutinantes "major" 1, 2 e 3; 10,0% e 6,7%, apresentaram, respectivamente, somente os antígenos 1 e 3 e 1 e 2.

2. Faz-se necessária em nosso meio, a atenção dos laboratórios relativamente à presença, nas vacinas contra a coqueluche, dos antígenos 1, 2 e 3, pelo fato da maioria das cepas isoladas dos casos clínicos da doença, possuirem esses antígenos.

Recebido para publicação em 14/03/1977

Aprovado para publicação em 28/03/1977

• 1. ANDERSEN, E.K. Serological studies on H pertussis, H. parapertussis and H. bronchisepticus: preliminary report. Acta path. microbiol. scand., 30: 54-8, 1952.
• 2. ANDERSEN, E.K. Serological studies on H. pertussis, H. parapertussis and H. bronchisepticus. Acta path. microbiol. scand., 33: 202-24, 1953.
• 3. BRADFORD, W.L.I. Bordetella group. In: DUBOS, R.J. & KIRSCH, J.G. Bacterial and mycotic infections of man. 4th ed. Philadelphia, Lippincott, 1965. p. 742-51.
• 4. CHALVARDJIAN, N. The content of antigens 1, 2 and 3 in strains of B. pertussis and in vaccine. Canad. med. Ass. J., 92: 1114-6, 1965.
• 5. COHEN, H.H. Pertussis vaccine research in the Rikjs Institut Voor de Volksgenondheid (The Netherlands). Arch. roum. Path. exp., 27: 33-50, 1968.
• 6. CRUICKSHANK, J.C. & FREEMAN, G.G. Immunizing fractions isolated from Haemophilus pertussis. Lancet, 2: 567-70, 1937.
• 7. ELDERING, G. Study of the antigenic properties of Haemophilus pertussis and related organisms. Amer. J. Hyg., 36: 294-302, 1942.
• 8. ELDERING, G. et al. Bordetella pertussis serotypes in the United States. Appl. Microbiol., 18: 618-21, 1969.
• 9. ELDERING, G. et al. Serological study of Bordetella pertussis and related species. J. Bact., 74: 133-6, 1957
• 10. IARIA, S.T. Isolamento de bactérias do gênero Bordetella e provas sorológicas, a partir de crianças com sintomas de coqueluche, atendidas no Hospital de Isolamento Emílio Ribas de São Paulo. Rev. Saúde públ., S. Paulo, 7: 409-32, 1973.
• 11. KENDRICK, P. et al. Whooping-cough. In: BODILY, H.L. et al. Diagnostic procedures for bacterial mycotic and parasitic infections. 5^th ed. New York, American Public Health Association, 1970. p. 106-17.
• 12. LESLIE, P.H. & GARDNER, A.D. The phases of Haemophilus pertussis. J. Hyg., 31: 423-34, 1931.
• 13. LIMA, J.P.C. & ARANTES, M. Vacinação contra a coqueluche. Rev. Inst. A. Lutz, S. Paulo, 3: 9-18, 1943.
• 14. MARSY, F.L.G. Production, extraction and purification of the hemagglutinin of Heamophilus pertussis. J. gen. Microbiol., 7: 201-10, 1952.
• 15. MEBEL, S. Zur serologie von B. pertussis. I Verbreitung der serotypen. Zbl. Bakt., 206; 481-5, 1968.
• 16. MEDICAL RESEARCH COUNCIL. The prevention of whooping-cough by vaccination. Brit. med. J., 2: 1463-70, 1951.
• 17. MEDICAL RESEARCH COUNCIL. Vaccination against whooping-cough: relation between protection in children and results of laboratory tests. Brit. med. J., 2: 454-62, 1956.
• 18. PILLEMER, L. Adsorption of protective antigen of Haemophilus pertussis on human red cell stromata. Proc. Soc. exp. Biol., New York, 75: 704-5, 1950.
• 19. PRESTON, N.W. Type-specific immunity against whooping-cough. Brit. med. J., 2: 724-6, 1963.
• 20. PRESTON, N.W. Effetiveness of pertussis vaccines. Brit. med. J., 2: 11-3, 1965.
• 21. PRESTON, N.W. & EVANS, P. Type-specific immunity against intracerebral pertussis infection in mice. Nature, London, 197: 508-9, 1963.
• 22. PRESTON, N.W. & PUNGA, W.A. The relation between agglutinin production by pertussis vaccines and their immunising potency in mice. J. Path. Bact., 78: 209-16, 1959.
• 23 PRESTON, N.W. & STANBRIDGE, T.N. Variation of serotype in strains of Bordetella pertussis. J. Hyg., London, 73: 305-10, 1974.
• 24. PUBLIC HEALTH LABORATORY SERVICE. Efficacy of whooping-cough vaccines used in the United Kingdom before 1968. Brit. med. J. 4:329-33, 1969.
• 25. ROBBINS, K. C. & PILLEMER, L. The separation of a protective antigen from a toxin-producing strain of Haemophilus pertussis. J. Immunol., 65: 393-406, 1950.
• 26. SAMPAIO, F.C.M. Contribuição ao estudo da imunização contra a coqueluche. Matern. e Inf., S. Paulo, 13: 31-59, 1954.
• 27. SMITH, D. T. et al. Zinsser microbiology. 13^th ed. New York, Appleton-Century-Crofts, 1964. p. 479-86.
• 28. SMOLENS, J. & MUDD, S. Agglutinogen of Haemophilus pertussis, phase I. for skin-testing: theoretical considerations, and a simple method of preparation. J. Immunol., 47: 155-63, 1943.
• 29. THIELE, E.H. Studies on the hemagglutinin of Haemophilus pertussis. J. Immuno.l, 65: 627-32, 1950.
• 30. UBATUBA, A. & SALMITO, A. Bacteriologia da coqueluche. II. Determinação dos fatores aglutinantes "major" nas amostras de Bordetella pertussis isoladas no Rio de Janeiro. Hospital, Rio de Janeiro, 78: 1301-10, 1970.
• 31. WINTER, J.L. Development of antibodies in children convalescent from whooping-cough. Proc. Soc. exp. Biol., New York, 83: 866-70, 1953.

*

Soros preparados e gentilmente cedidos pela Dra. Arlete Ubatuba, do Instituto Oswaldo Cruz do Rio de Janeiro – Brasil

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  02 Maio 2006
• Data do Fascículo
  Set 1977

Histórico

• Aceito
  28 Mar 1977
• Recebido
  14 Mar 1977