Reação de inibição da hemaglutinação para o vírus da rubéola: técnica simplificada

Rubella hemagglutination-inhibition test: a simplified technique

ARTIGO ORIGINAL

Reação de inibição da hemaglutinação para o vírus da rubéola – Técnica simplificada

Rubella hemagglutination-inhibition test – A simplified technique

J. A. N. Candeias^I; Lucía Neira^II; M. L. Rácz^I; Nelly M. F. Candeias^III

^IDo Departamento de Microbiologia e Imunologia do Instituto de Ciências Biomédicas da USP – "Setor Saúde Pública" – Av. Dr. Arnaldo, 715 – 01255 – São Paulo, SP – Brasil

^IIEstagiária do Departamento de Microbiologia e Imunologia do Instituto de Ciências Biomédicas da USP – "Setor Saúde Pública"

^IIIDo Departamento de Prática de Saúde Pública da Faculdade de Saúde Pública da USP – Av. Dr. Arnaldo, 715 – 01255 – São Paulo, SP – Brasil

RESUMO

A comparação dos resultados obtidos com uma técnica simplificada de inibição da hemaglutinação para o vírus da rubéola e a técnica padronizada pelo "Center for Disease Control", permitiu determinar índices de sensibilidade e especificidade da técnica simplificada em relação à técnica padrão de, respectivamente, 99,4% e 90,0%. Esta técnica pode facilitar a execução de levantamentos sorológicos para a rubéola em larga escala.

Unitermos: Rubéola, virus. Hemaglutinação. Anticorpos inibidores.

ABSTRACT

A hemagglutination-inhibition test for rubella is described. In comparing the results obtained using this technique and the CDC standard rubella hemagglutination-inhibition test, the sensitivity and specificity indexes were, respectively, 99.4% and 90.0%. This technique should simplify mass screening of populations for immunity to rubella.

Uniterms: Rubella virus. Hemagglutination-inhibition test.

INTRODUÇÃO

O diagnóstico sorológico da rubéola pode ser feito mediante o emprego de reações de inibição da hemaglutinação²¹, neutralização ^14,15, fixação do complemento ^12,19,20, imunofluorescência indireta ¹ e, mais recentemente, pela utilização de técnicas imunoenzimáticas²⁵ e de hemólise radial específica ⁸. Dentre estas, a inibição da hemaglutinação tem sido a reação de uso mais generalizado, tanto no diagnóstico clínico, como nos inquéritos sorológicos, dadas sua especificidade, sensibilidade e relativa simplicidade de execução ^{2-4,6,17,18,23,24}. No entanto, não é esta reação destituída, de todo, de certos problemas que a tornam de difícil reprodutibilidade e com resultados, por vezes, difíceis de interpretar, razões pelas quais o "Center for Disease Control" (CDC)⁵ definiu as normas para sua padronização, tanto em relação à titulação do antígeno, quanto em relação ao tipo e concentração das hemácias a utilizar e tipo de tratamento para remoção de aglutininas naturais e inibidores inespecíficos da hemaglutinação. Seguindo, fundamentalmente, estas normas, foram feitas tentativas no sentido de tornar a reação mais acessível a laboratórios que não tenham condições de dispor de aparelhagem dispendiosa e em que o número de reações a realizar, diariamente, seja relativamente elevado.

Apresentam-se e discutem-se os resultados obtidos, ao mesmo tempo que se sugere a possibilidade de utilização da presente técnica modificada.

MATERIAL E MÉTODOS

Soros de prova

As 201 amostras de soro, selecionadas para o presente estudo, provieram de um total de 2.153 soros a serem testados, qualitativamente, para determinação do grau de imunidade para a rubéola de professoras da rede municipal de ensino de São Paulo. Aquelas amostras foram testadas, quantitativamente, para a pesquisa de anticorpos inibidores da hemaglutinação segundo a técnica padronizada pelo CDC e, simultaneamente, pela técnica simplificada, que passamos a identificar como técnica ICB, iniciais de Instituto de Ciências Biomédicas.

Reação de inibição da hemaglutinação

Esta reação foi realizada em triplicata pelo método de microtitulação em placas "V" (Cooke Engineering Co.), com volumes 25 e 50 microlitros, seguindo-se, em paralelo, as operações estabelecidas pelo CDC e as que fixamos para a reação simplificada, operações estas que são descritas na Tabela 1. O antígeno utilizado, de origem comercial ^*, era titulado antes da execução da reação de inibição da hemaglutinação, de modo a poder ser confirmada a utilização de 4 unidades de antígeno, em cada reação. Os soros foram testados nas diluições de 1:8 até 1 :256.

RESULTADOS

A distribuição dos títulos de anticorpos inibidores da hemaglutinação obtidos com as técnicas CDC e ICB é apresentado na Tabela 2. Na dosagem de anticorpos inibidores da hemaglutinação pela técnica CDC, conforme pode calcular-se, pelos resultados apresentados nessa Tabela, 90,1% das amostras testadas apresentaram títulos iguais ou superiores a 8, enquanto pela técnica ICB esta percentagem foi de 90,5%. Na Tabela 3, faz-se a associação dos resultados obtidos com as duas técnicas já mencionadas, sendo possível avaliar a percentagem de eventos concordantes das mesmas, que para as reações positivas (³8) é de 99,4% e para as reações negativas (<8) de 90,0%. Estes valores percentuais expressam a sensibilidade e a especificidade da técnica ICB em relação à técnica CDC²².

DISCUSSÃO E CONCLUSÃO

O fato da rubéola poder desencadear o aparecimento de malformações congênitas tem forçado o desenvolvimento de extensos programas de vacinação, tanto em crianças de idade superior a um ano, quanto em mulheres adultas, respeitadas, neste último caso, três normas fundamentais: determinação do grau de imunidade do indivíduo a vacinar, proibição da vacinação nos casos de gravidez e recomendação de que a mulher vacinada não engravide, durante o três meses que se seguem ao processo vacinai. De um modo geral, estas normas de vacinação diminuem os riscos de ocorrências de malformações congênitas ocasionadas pelo vírus da rubéola; persistem, no entanto, situações particulares que requerem uma discussão mais pormenorizada deste problema ^11,16,26.

Sempre que está presente uma situação de gravidez, considerando-se a freqüência com que ocorrem as formas sub-clínicas de rubéola e o fato de que mesmo as formas clínicas típicas, muitas vezes, não possuem características patognomônicas, o diagnóstico sorológico torna-se obrigatório²⁷. Alguns autores chegam mesmo a considerar que a pesquisa de anticorpos contra a rubéola deve constituir-se em prática rotineira, numa tentativa de contornar situações que, invariavelmente, levam a "crises emocionais", por suspeita de contato da paciente grávida com casos de rubéola, quer em ambiente familiar ou não ^6,18. Dentro deste contexto, pode mesmo sugerir-se que da prática de assistência, durante o período interconcepcional, faça parte um conteúdo educativo visando ao esclarecimento da mãe sobre a problemática da rubéola. Poder-se-á orientar a mãe no sentido de averiguar o nível de imunidade que possui, o que ditará a necessidade ou não de ser vacinada; haverá oportunidade para esclarecê-la das vantagens em informar o médico sobre sintomas que simulem um quadro de rubéola e que se tenham manifestado em qualquer membro da família; com relativa freqüência será possível minorar estados de profunda ansiedade em mulheres grávidas, com a informação de que o caso com que houve suspeita de contato pode não ter sido de rubéola. Deste modo, abre-se campo para a Educação em Saúde colaborar em programas que venham a reduzir as trágicas conseqüências da infecção do feto pelo vírus da rubéola, programas estes que configurem a proteção global da mãe, da criança e da própria família. São oportunas as palavras de Chute⁷ quando diz que "...a participação entusiástica da comunidade em programas flexíveis e de múltipla natureza que se desenvolvam com vistas à imunização contra a rubéola, de ênfase prioritária na criança, mas suplementados com a proteção direta das mulheres suscetíveis adultas, poderá vir a eliminar o problema da rubéola, em futuro próximo".

Dada a precariedade do diagnóstico clínico, os pacientes com quadros suspeitos de rubéola devem ser submetidos, com urgência, a um diagnóstico preciso. O diagnóstico laboratorial da rubéola ampara-se, fundamentalmente, nas provas sorológicas, das quais a inibição da hemaglutinação é a preferida, pela relativa rapidez com que pode ser executada e pela segurança dos dados que fornece, desde que as amostras de sangue das fases aguda e convalescente sejam obtidas respectivamente, dentro de 48h e 15 dias. Assim, muitas das ações tomadas pelo médico frente a um caso de rubéola numa gestante, vão depender dos resultados fornecidos pela reação de inibição da hemaglutinação. A pesquisa de anticorpos inibidores da hemaglutinação para o vírus da rubéola, além de amparar a decisão do médico, vai ainda permitir avaliar o grau de imunidade e a eficiência do processo vacinal. Todas estas razões obrigam a que os resultados obtidos na reação de inibição da hemaglutinação possam ser aceitos com elevado grau de confiança.

As fontes de erro que, normalmente, se encontram associadas à dosagem de anticorpos inibidores da hemaglutinação, resultam da ocorrência, no soro humano, de inibidores inespecíficos da hemaglutinação e as técnicas utilizadas para sua remoção, nem sempre, atuam de modo eficiente. Em geral recorre-se à remoção pelo caolin²¹, pela mistura heparina-MnCl₂¹⁰, ou pelo sulfato de dextrano e cloreto de cálcio ¹³.

O método que utiliza a heparina e o MnCl₂ foi selecionado pelo CDC para remoção dos inibidores na técnica padronizada da reação de inibição da hemaglutinação para o vírus da rubéola e foi o utilizado em nossa técnica modificada. As diferenças entre a técnica simplificada ICB, e a técnica padrão CDC são, como pode ver-se na Tabela 1, de ordem operacional, respeitando-se a proporção e natureza dos reagentes utilizados nesta última. Enquanto na técnica CDC existem 6 operações, na técnica ICB o número de operações é reduzido para 3, sem prejuízo dos resultados e com a vantagem de poder aumentar-se o número de reações a executar, uma vez que pode usar-se uma centrífuga não-refrigerada – Modelo V, Internacional, Rotor 250, com capacidade para 128 amostras, por vez; o número de amostras que pode ser processado, de cada vez, na centrífuga refrigerada – Modelo RC2, Sorvall, Rotor SM24, é de 24. Na técnica CDC a absorção das aglutininas naturais para hemácias de pinto, existentes no soro humano, é feita com uma suspensão de hemácias a 50% e, freqüentemente, os controles de soro mostram, na leitura final da reação, aglutinação inespecífica, que tem de ser eliminada com nova absorção; na técnica ICB, o uso de papa de hemácias levou a resultados em que não era necessária absorção posterior.

A distribuição dos títulos de anticorpos inibidores da hemaglutinação, apresentada na Tabela 2, permite calcular as percentagens de positividade (³8) obtidas com ambas as técnicas, sendo os valores de 90,1% para a técnica CDC e 90,5% para a técnica ICB, bastante próximos. Foi verificada uma associação (X²_obs = 55,49) a um nível de significância de 5% (X²_crit.a = 5%, g.1. = 36). Utilizando o método Kappa, proposto por Cohen e col.⁹, a concordância entre os dois métodos foi de 0,5199 @ 0,52, significantemente diferente de 0 (zero), mostrando que a concordância não é simplesmente casual. Verifica-se ainda, nessa Tabela, que dois casos, dados como negativos, pela técnica CDC, surgem com títulos de 16 e 32, quando testados pela técnica ICB e que um caso negativo por esta última técnica, tem título 8, na técnica CDC. Considerando estes resultados como decisórios quanto à necessidade de se fazer a vacinação, só os casos que pela técnica ICB têm títulos de 16 e 32, não seriam vacinados. Se analisarmos na Tabela 3 o número de eventos concordantes por ambas as técnicas pode calcular-se tanto a sensibilidade, como a especificidade da técnica ICB em relação à técnica CDC, obtendo-se respectivamente os valores de 99,4% e 90,0%. No presente estudo, sensibilidade é a capacidade da técnica usada dar um resultado positivo, quando o indivíduo estudado tem realmente imunidade para a rubéola pela técnica padrão; especificidade é a capacidade da técnica usada dar um resultado negativo quando o indivíduo estudado não possui imunidade. No que respeita à especificidade, nossos resultados acusam 2 casos que, pela técnica ICB não seriam vacinados, por terem sido dados como possuidores de imunidade. Considerando que, nas populações continentais, em média, 75% das mulheres no período da puberdade, possuem anticorpos inibidores da hemaglutinação para a rubéola, um levantamento sorológico em ampla escala feito pela técnica ICB deixaria de detectar a ausência de imunidade e, portanto, a necessidade de vacinação de 2 mulheres (2,5) em cada 100 mulheres examinadas.

Das observações feitas parece razoável sugerir a utilização da técnica simplificada em levantamentos sorológicos para a rubéola em larga escala, uma vez que, pela redução do número de operações, existe uma ponderável economia material e de tempo dispendido na execução da reação.

Recebido para publicação em 04/08/1978

Aprovado para publicação em 09/08/1978

Pesquisa financiada pelo Departamento de Assistência Escolar da Secretaria de Educação da Prefeitura Municipal de São Paulo

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Flow Laboratories, Icn. Rockville, U.S.A.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  20 Mar 2006
• Data do Fascículo
  Dez 1978

Histórico

• Aceito
  09 Ago 1978
• Recebido
  04 Ago 1978