Variação dos níveis do componente C3 do complemento em Holochilus brasiliensis nanus experimentalmente infectados com Schistosoma mansoni

Variation in the levels of the C3 component of the complement in Holochilus brasiliensis nanus infected with Schistosoma mansoni

Resumos

As variações dos níveis do componente C3 do complemento foram verificadas em soros de exemplares do roedor silvestre Holochilus brasiliensis nanus infectados experimentalmente com Schistosoma mansoni, aplicando-se a técnica de imunoeletroforese bidimensional quantitativa. Foram utilizados soros de animais normais, da mesma espécie e idade, como controle da experiência. A quantificação foi feita durante oito semanas, contadas a partir da data da infecção. C perfil sérico mostrou que o nível inicial do C3 foi duas vezes menor que o observado no grupo controle. Este nível permaneceu até a 6ª semana de observação. A partir desta semana até a oitava foram registrados níveis aproximadamente 3 a 4 vezes menores que os observados no grupo controle.

Holochilus brasiliensis nanus; Schistosoma mansoni; Infecção experimental; Roedores Silvestres

The quantitative immunoelectrophoretic method was used to determine the consumption of the C3 component of the complement system in the sera of rodents (Holochilus brasiliensis nanus) infected with Schistosoma mansoni, during about eight weeks of observation. Normal animals were used as experimental controls. The results indicated that initial consumption of the C3 component in the infected animals was twice that of the controls. This level was maintained until the 6th week of observation. After the 6th week, the consumption of C3 was³ to 4 times greater than that of the controls.

Holochilus brasiliensis nanus; Schistosoma mansoni; Experimental infection; Wild rodents

ARTIGO ORIGINAL

Variação dos níveis do componente C₃ do complemento em Holochilus brasiliensis nanus experimentalmente infectados com Schistosoma mansoni

Variation in the levels of the C₃ component of the complement in Holochilus brasiliensis nanus infected with Schistosoma mansoni

Othon de Carvalho Bastos^I; Maria Helena Seabra Soares de Brito^I; Maria Salete Sipauba Schiavotelo^II; Eliane Pires de Souza^II

^IDa Universidade Federal do Maranhão – Programa de Imunologia – Campus Universitário do Bacanga – Bloco 3 – Sala 3A – 65000 – São Luís, MA – Brasil

^IIBolsista do CNPq, na Universidade Federal do Maranhão

RESUMO

As variações dos níveis do componente C₃ do complemento foram verificadas em soros de exemplares do roedor silvestre Holochilus brasiliensis nanus infectados experimentalmente com Schistosoma mansoni, aplicando-se a técnica de imunoeletroforese bidimensional quantitativa. Foram utilizados soros de animais normais, da mesma espécie e idade, como controle da experiência. A quantificação foi feita durante oito semanas, contadas a partir da data da infecção. C perfil sérico mostrou que o nível inicial do C₃ foi duas vezes menor que o observado no grupo controle. Este nível permaneceu até a 6^a semana de observação. A partir desta semana até a oitava foram registrados níveis aproximadamente 3 a 4 vezes menores que os observados no grupo controle.

Unitermos: Holochilus brasiliensis nanus, Schistosoma mansoni. Infecção experimental Roedores Silvestres.

ABSTRACT

The quantitative immunoelectrophoretic method was used to determine the consumption of the C₃ component of the complement system in the sera of rodents (Holochilus brasiliensis nanus) infected with Schistosoma mansoni, during about eight weeks of observation. Normal animals were used as experimental controls. The results indicated that initial consumption of the C₃ component in the infected animals was twice that of the controls. This level was maintained until the 6th week of observation. After the 6^th week, the consumption of C₃ was³ to 4 times greater than that of the controls.

Uniterms: Holochilus brasiliensis nanus. Schistosoma mansoni. Experimental infection. Wild rodents.

INTRODUÇÃO

Estudos realizados em linhagens de camundongos que apresentavam deficiência congênita de componentes do complemento, assim como em animais nos quais foi obtida a decomplementação, utilizando-se veneno de cobra, demonstraram que a resistência imunológica à infecção parasitária, de algum modo, depende da presença do sistema complemento ^12,13.

Na esquistossomose, vem sendo verificado o mecanismo de ação deste sistema, tanto pela via clássica de fixação ^1,11, como pela via alternativa ⁷, envolvendo, algumas vezes, células como macrófagos e eosinófilos ^6,9,10. Estes experimentos evidenciam os efeitos danosos do complemento sobre o hospedeiro e o modo pelo qual o verme escapa deste mecanismo de defesa imunológica. Entretanto, faltam maiores esclarecimentos quanto a variação dos níveis dos componentes do complemento, durante a evolução da parasitose. Procuramos, então, determinar o nível do componente C₃ em roedores silvestres esquistossomóticos, durante oito semanas de infecção, por ser hospedeiro natural do S. mansoni e, ao mesmo tempo, por sabermos da possibilidade destes pequenos mamíferos participarem da cadeia epidemiológica da verminose, em paralelo ao homem ⁴.

MATERIAL E MÉTODOS

Procedência dos roedores silvestres

Mamíferos de pequeno porte foram capturados na cidade de São Bento, situada na região da Baixada Maranhense. A captura foi feita por meio de tarrafa (malha confeccionada com fio de algodão pelos pescadores da região) ou par laço feito na extremidade da linha de anzóis. As armadilhas foram utilizadas em região alagada, onde estes animais costumeiramente fazem seus ninhos, utilizando vegetação aquática. Os animais capturados foram transportados para o laboratório, onde a infecção esquistossomótica foi investigada por exame de fezes. Os animais não infectados por S. mansoni foram acasalados, após a determinação da espécie. No experimento, utilizamos somente animais nascidos em cativeiro, com 30 dias de vida, da espécie Hotochilus brasiliensis nanus Thomas, 1897.

Infecção esquistossomótica

Foram formados dois grupos com 5 Holochilus cada um. Aleatoriamente, um dos grupos foi tomado para que seus roedores fossem submetidos a infecção esquistossomótica. Cada roedor foi exposto a 150 cercárias (Grupo I), na presença de luz e na temperatura de 28°C. Os animais do outro grupo foram tomados como controle da experiência (Grupo C).

As cercárias foram obtidas de Biomphalaria glabrata nascidas em moluscário, descendentes de moluscos coletados na Região da Baixada Maranhense, e infectadas por população simpátrica de S. mansoni.

Obtenção de soros anti-S. mansoni

Semanalmente, a partir da data da infecção, os roedores eram anestesiados com éter e sangrados pelo plexo venoso oftálmico. As amostras sangüíneas eram deixadas em temperatura ambiente para retração do coágulo e os soros eram juntados por grupos, rotulados e estocados em congeladores.

As siglas utilizadas nos rótulos serviram para identificar os soros por grupos: Controle (Cn) e Infectado (In), sendo que n correspondia ao número de semanas decorridas após a data da infecção.

Produção de soro Anti-C ₃ de roedor

Quinhentos miligramas (500 mg) de Zimosan (Fleishman Tipo A) foram fervidos por meia hora, em 50 ml de solução salina (0,15M). Em seguida, o Zimosan foi recuperado por centrifugação (1.200g/min, a 0°C) e deixado reagir com 11 ml de soro de roedor, a 37°C, por uma hora, com agitação constante. O complexo Zimosan-C₃ foi separado por centrifugação, desprezando-se o sobrenadante. O complexo foi lavado seis vezes com Tampão Veronal Isotônico, pH 7.6, e estocado em congelador até o momento do uso ⁸.

Coelhos da raça Nova Zelândia, com aproximadamente 1,5 kg de peso corporal, nascidos no Biotério da UFMa, foram imunizados com o complexo Zimosan-C₃ de roedor e adjuvante incompleto de Freund. A sensibilização foi feita com inoculações do antígeno em regiões próximas à dos gânglios poplíteos (1,0 ml) e no dorso do animal (1,0 ml). Decorridos 15 dias da data da imunização, outras inoculações antigênicas foram feitas, obedecendo o mesmo critério. O soro anti-C₃ foi obtido sete dias após a aplicação da última dose do antígeno.

Identificação do Componente C₃

O componente C₃ foi identificado pela imunoeletroforese bidimensional, utilizando a técnica de absorção "in situ"³. A técnica consistiu em depositar o soro padrão "Bionetics" anti-C₃ de camudongo, em uma canaleta aberta no trajeto da segunda eletroforese. Este soro reage cruzadamente com soro de Holochilus. A banda correspondente do C₃ foi determinada tendo em vista a redução da área de precipitação.

Imunoeletroforese bidimensional quantitativa (IBQ)

Para estudos de imunoeletroforese bidimensional quantitativa de Laurell (de acordo com as orientações de Weeke, descritas em Axelsen e col.²), placas de vidro foram cobertas com Agarose (Bio-Rad Lab) a 1% em tampão veronal – HCl (0,05 M; pH = = 8.6 e m= 0,02).

Foram utilizadas amostras de 1 ml de soros dos dois grupos (I e C), conforme esquema expresso nas lâminas em estudo (Figs. 1 e 2). A primeira eletroforese foi realizada a 6V/cm, durante uma hora e 20 min. Em seguida, foram retiradas porções de Agarose das regiões escolhidas para a realização das reações antígeno-anticorpo, conforme técnica de Weeke, e substituídas por uma mistura de agarose e anti-C₃, na diluição de 1/20. O passo seguinte foi a realização da eletroforese no segundo sentido (1,0V/cm, durante 15 h). A quantificação do C₃ foi feita pela medida da área do precipitado, com auxílio de papel milimetrado.

RESULTADOS

Posicionamento do componente C₃ de Holochilus na imunoeletroforese bidimensional (IBQ)

A lâmina da imunoeletrofose, preparada para identificação do C₃ de Holochilus, apresentou um arco de precipitação que se reduziu proporcionalmente à variação do volume de amostra aplicada. Quando as alíquotas tinham volumes iguais, constatou-se diferenças entre as áreas dos arcos em evidência, sendo que, a menor área, relacionou-se com a região em que foi realizada a absorção "in situ" (Fig. 3). Resultados semelhantes foram obtidos em replicatas.

Variações do nível do componente C ₃ durante a evolução da parasitose.

As reações correspondentes ao C₃ precipitado no grupo de animais infectados (In) apresentaram bandas com áreas menores do que as correspondentes ao sistema precipitante do grupo de animais normais (Cn), desde a primeira semana de trabalho até a oitava (Figs. 1 e 2). As relações entre as reações dos soros Cn e In, no decurso do período de observação mostraram que o nível do C₃ foi duas vezes menor que o nível detectado no grupo controle. Esta proporção permaneceu até a 6^a semana de infecção. Após a 6^a semana chegou a ser registrado um nível aproximadamente 3 a 4 vezes menor do que o verificado no grupo controle.

DISCUSSÃO E CONCLUSÃO

As áres formadas pelo precipitado oriundo da reação antígeno-anticorpo no decurso da imunoeletroforese bidimensional, variam linearmente com as concentrações antigênicas, conforme demonstrado por Axelsen e col.², 1973, permitindo uma análise quantitativa de razoável precisão. No presente trabalho, utilizamos este método quantitativo c, apesar de termos trabalhado com um reativo pluri-específico (anti-C₃), determinamos oscilações nos níveis séricos, tanto em animais normais, como nos parasitados com S. mansoni. Observamos que as oscilações ocorridas nos soros controles não apresentaram diferenças significativas entre si, fato que permitiu avaliar o crescente aumento de consumo de C₃ durante a evolução da infecção.

Estudando o perfil dos níveis de C₃ durante a evolução da parasitose, podemos imaginar que a queda do nível deste componente sérico, na fase inicial da infecção, está relacionado com o consumo de C₃ devido as intensas reações imunológicas no hospedeiro, desencadeadas para neutralizar tanto antígenos somáticos como os de excreção e secreção do helminto. Admite-se que, quando a parasitose atinge sua fase máxima de agressão, ou seja, época em que os vermes alcançam sua maturidade e começam a ovipor, o consumo do C₃ é ampliado, havendo relação direta entre carga antigênica parasitária e a participação do C₃ nos processos imunes.

AGRADECIMENTOS

Aos Professores L.A. Magalhães e L.C. de S. Dias, pelas sugestões científicas; ao Professor Fernando de Ávila Pires, pela taxionomia dos roedores; à Diretoria Regional da Superintendência de Campanhas de Saúde Pública (SUCAM), pela viabilização do trabalho.

Recebido para publicação em 13/06/1983

Aprovado para publicação em 28/10/1983

Financiado pelo Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq – Proc. n^o 40.3815/82)

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  28 Set 2005
• Data do Fascículo
  Fev 1984

Histórico

• Aceito
  28 Out 1983
• Recebido
  13 Jun 1983