Verificação da resposta de miracídios de Schistosoma mansoni a substâncias provenientes de moluscos planorbídeos: pesquisa de substâncias quimiotáxicas

Response of Schistosoma mansoni miracidia to snail substance: research on chemiotaxic substances

ARTIGO ORIGINAL

Verificação da resposta de miracídios de Schistosoma mansoni a substâncias provenientes de moluscos planorbídeos. Pesquisa de substâncias quimiotáxicas

Response of Schistosoma mansoni miracidia to snail substance. Research on chemiotaxic substances

Beatriz de Camargo Brasio^I; Luiz Augusto Magalhães^II; Joseph Miller^III; José F. de Carvalho^IV

^IBolsista da FAPESP junto ao Departamento de Parasitologia do Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) — Caixa Postal 6109 — 13100 — Campinas, SP — Brasil

^IIDo Departamento de Parasitologia do Instituto de Biologia da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) — 13100 — Campinas, SP — Brasil

^IIIDo Instituto de Química da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) — 13100 — Campinas, SP — Brasil

^IVDo Instituto de Matemática, Estatística e Ciências da Computação da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP) — 13.100 — Campinas, SP — Brasil

RESUMO

Foi testada a atividade miraxonal da água de condicionamento (SCW) e da hemolinfa de Biomphalaria glabrata e de B. tenagophila frente a miracídios de Schistosoma mansoni das linhagens BH e SJ. Foram pesquisados e isolados alguns componentes de SCW. Com os componentes isolados de SCW e com a hemolinfa foram preparados blocos de ágar. Esses blocos, assim preparados, foram colocados frente a miracídios de S. mansoni para avaliação da atividade miraxonal. Foram detectadas diferenças entre a ação miraxonal da hemolinfa e das substâncias isoladas de SCW. Observaram-se diferenças significativas entre os efeitos miraxonais das duas espécies de moluscos pesquisados frente a miracídios das linhagens BH e SJ.

Unitermos:Biomphalaria glabrata. Biomphalaria tenagophila. Quimiotaxias. Schistosoma mansoni.

ABSTRACT

Several substances isolated from SCW (snail conditioned water and from snail hemolymph were tested for a possible chemiotaxic effect on Schistosoma mansoni miracidia. Two strains of miracidia were considered (SJ and BH). Agar plates prepared with one of the substances were exposed to sixty miracidia for five minutes. The number of contacts and contacts with return were counted. Ten replications were made. Eight types (and four sub types) of agar plates were prepared: normal water (control), SCW (Biomphalaria glabrata and B. tenagophila), hemolymph (B. glabrata and B. tenagophila) and amonia, calcium, magnesium, sodium and potassium. Log-linear models were fitted to the data to study the proportions of attraction to each substance and to compare them. Any possible differences in proportions of attraction between the two S. mansoni strains were tested.

Uniterms:Biomphalaria glabrata. Biomphalaria tenagophila. Chemotaxis. Schistosoma mansoni.

INTRODUÇÃO

Em trabalho anterior (Brasio e col.², 1984) verificamos a atração de miracídios de Schistosoma mansoni por moluscos vetores. Verificamos ainda que esta atração ocorre mais intensamente entre o miracídio e seu molusco simpátrico. Na presente experiência procuramos identificar as substâncias quimiotáxicas responsáveis por este fenômeno.

Estudos feitos por Mac Inns⁹ (1965) que utilizou pequenas pirâmides de ágar Oxoid n.° 2, impregnadas com várias substâncias presumivelmente presentes no muco de caramujos, e por Chernin⁴ (1972), que usou discos de ágar impregnados com água na qual foram mantidos por algum tempo caramujos Biomphalaria glabrata (SCW: "snail conditioned water"), mostraram a existência de quimiotaxia e não exclusivamente de tigmotropismo.

Chernin³ (1970) sugeriu que uma ou várias substâncias solúveis em água e emanadas naturalmente por B. glabrata e por outras espécies de caramujos, alteravam o comportamento dos miracídios de S. mansoni, denominou estas substâncias de miraxonais.

Várias substâncias têm sido consideradas possuidoras de ação miraxonal: aminoácidos (Wright e Ronald¹⁷, 1972; Mac Inns e col.¹⁰, 1974; Prechel e col.¹³, 1976); ácidos graxos (Mac Inns⁹, 1965); Mg⁺² (Stibbs e col.¹⁶, 1976); Ca⁺²/ Mg⁺² (Spanholtz e Short¹⁵, 1976); ions H⁺ (Mac Inns⁹, 1965); seratina (Etges e col.⁷, 1975); amônia (Manson^11,12, 1977 e 1979); peptina (Manson ¹¹, 1977). Tais substâncias estão presentes na "SCW" de B. glabrata.

Em nossa pesquisa procuramos identificar possíveis substâncias miraxonais presentes na SCW de algumas espécies de vetores e interpretar, a luz de nossos resultados, o desempenho destes vetores no campo e no laboratório.

Recordamos que a incorporação de substâncias miraxonais em moluscicidas e larvicidas poderia ser utilizada para atrair tanto a larva do parasito como o vetor para uma área de atividade química. A presença de substâncias miraxonais em venenos insolúveis (que poderiam ser menos agressivos ao ambiente) poderá induzir, no caso das larvas do trematódeo, a perda de sua energia e de suas secreções nas tentativas inúteis para penetrar em partículas que emanassem estes atrativos.

MATERIAL E MÉTODOS

Nos experimentos foram utilizados miracídios de esquistossomos da linhagem paulista (SJ) e da linhagem mineira (BH). Estas linhagens de S. mansoni são mantidas na natureza e em nossos laboratórios nos moluscos B. tenagophila (SJ) e B. glabrata (BH).

Estas espécies de planorbídeos foram utilizadas na experiência para obtenção da água de condicionamento "snail conditioned water" (Chernin⁴, 1972) e da hemolinfa. Os miracídios eram provenientes de camundongos infectados pelas linhagens de S. mansoni acima referidas.

As substâncias testadas eram utilizadas dissolvidas em discos de ágar Oxoid (Mac Inns⁹, 1965).

Os discos de ágar foram preparados utilizando-se uma solução estoque de 0,5 g de ágar Oxoid n.° 2 dissolvidos a quente em 50 ml de água destilada. O efeito miraxonal foi verificado dissolvendo-se as substâncias a serem testadas nos discos de ágar. Os experimentos foram feitos em placas de Petri com 45 mm de diâmetro e 20 mm de altura, contendo 10 ml de água. As observações foram feitas através de lupa estereoscópica, usando-se dispositivo que permitisse transiluminação uniforme.

Sessenta miracídios foram colocados na placa de Petri com auxílio de seringa hipodérmica. A placa continha um disco de ágar preparado com uma das soluções testes e colocado logo após a deposição das larvas. Foram registrados, durante cinco minutos, o número de "contactos com retorno" e o número de "contactos sem retorno" descritos por Mac Inns⁹ (1965).

Para cada tipo de solução teste foram feitos dez experimentos.

Obtenção e preparação das substâncias de provável ação miraxonal utilizadas na experiência.

As substâncias miraxonais utilizadas na experiência foram isoladas da "água de condicionamento de caramujos", SCW e da hemolinfa dos planorbídeos.

Obtenção e análise da "água de condicionamento dos caramujos" SCW.

As amostras foram preparadas colocando-se vinte caramujos com diâmetro aproximado de 10 mm em 20 ml de água destilada e mantidos sem alimentação. Estes moluscos foram deixados durante 24 h imersos em água; após esse tempo, foram retirados, colocados durante 10 min sobre papel de filtro e então pesados. Após a retirada dos moluscos, a água era filtrada em papel e utilizada para as análises.

Nos experimentos foram utilizadas SCW de B. glabrata e de B. tenagophila. Pesquisou-se a constituição de SCW pelos métodos a seguir referidos: para a determinação de polissacarídeos totais o método de Dubois e col.⁶ (1956); para a determinação de amônia o método de Smith¹⁴ (1980); e para a determinação de aminoácidos o método de Kirkman⁸ (1974). Pesquisamos os cátions Ca⁺²; Na⁺; K⁺; e Mg⁺². Análises anteriores mostraram que Fe; Cu; P; e NO_-2 não são eliminados pelos caramujos.

Para as dosagens de cátions as amostras foram analisadas por absorção atômica. Para a dosagem de aminoácidos utilizamos um cromatógrafo a gás modelo 2.440 ss da Varian.

Obtenção da solução de hemolinfa dos planorbídeos

Para obtenção da hemolinfa foram utilizados espécimens adultos de B. glabrata e B. tenagophila com diâmetro médio de 25 mm. Com o auxílio de um bastão de vidro, foram fraturadas as conchas, provocando-se desta maneira a liberação de hemolinfa. Para a diluição em ágar utilizou-se 0,4 ml de hemolinfa diluída em 2 ml de água destilada.

Preparo dos discos de ágar para os testes.

Os discos de ágar foram preparados adicionando-se 2 ml da solução estoque de ágar a 2% dissolvida ao banho-maria em 2 ml de uma destas soluções: SCW de B. glabrata ou de B. tenagophila; hemolinfa de B. glabrata ou de B. tenagophila; amônia a 60 ppm e a 15 ppm; cálcio a 20 ppm e 7 ppm; potássio a 18 ppm e a 12 ppm; magnesio a 3,5 ppm e 1 ppm; sódio a 13 ppm e a 10 ppm; água destilada (controle).

Os discos de ágar tinham 7 mm de diâmetro e 3 mm de altura.

RESULTADOS

Análise química da SCW

Observamos, em nossas análises, que o valor médio do pH das amostras mostrou um pequeno aumento em relação à água destilada usada na preparação das amostras, todavia este aumento não se apresentou diferente para as duas espécies de caramujos (Tabela 1).

A análise de polissacarídeos totais mostrou que as duas espécies de caramujo liberam praticamente a mesma quantidade de açúcares na água (Tabela 2).

Pelos resultados das Tabelas 3, 4, 5 e 6 pudemos ver que, em relação aos cátions presentes na SCW, B. tenagophila elimina mais Ca⁺²; K⁺; Mg⁺²; Na⁺²; e NH₄⁺ do que B. glabrata.

Através dos dados da Tabela 5, pode-se notar que SCW de B. tenagophila contém, pelo menos, quatro vezes mais amônia, três vezes mais cálcio, duas vezes mais potássio e quatro vezes mais sódio do que a SCW de B. glabrata.

As Figs, 1 e 2 mostram os cromatogramas obtidos a partir de amostras de SCW de B. glabrata e B. tenagophila respectivamente.

A localização do pico relativo a cada aminoácido foi feita comparativamente a um cromatograma padrão.

As Tabelas 7 e 8 dão a altura do pico característico de cada aminoácido, em relação a nor-leucina, relação esta que é diretamente proporcional à concentração de cada aminoácido nas amostras. Analisando os dados dessas duas tabelas, observamos algumas diferenças quantitativas entre os aminoácidos presentes na SCW das duas espécies de planorbídeos estudadas. Verificamos que B. tenagophila eliminou nitidamente mais alanina, serina, ácido aspártico, fenilalanina, ácido glutâmico e tirosina. B. glabrata eliminou nitidamente mais leucina, prolina e arginina.

Análise do comportamento de miracídios frente a discos de ágar feitos com substâncias miraxonais.

Na tabela 9 está" apresentado o panorama global desta fase experimental.

Observamos, na presença dos blocos de ágar, vários comportamentos por parte dos miracídios e que já tinham sido descritos por Mac Inns⁹ (1965).

Pudemos observar que, com exceção dos discos feitos com solução de hemolinfa, o número de tentaitvas de penetração é muito pequena em comparação com o número de "contatos em retorno". Já nos blocos feitos com solução de hemolinfa, observamos um grande número de tentativas de penetração.

ANÁLISE ESTATÍSTICA

Atração de miracídios BH e SJ frente a substâncias quimiotáxicas

Descrição do Experimento

Um disco de ágar impregnado com um tipo de substância é mergulhado em água, dentro de recipiente apropriado. Aí são depositados 50 miracídios. Conta-se o número de contatos com retorno (CCR) e de contatos sem retorno (CSR), dos miracídios ao disco, em tempo fixado. Os contatos com retorno indicam atração do miracídio à placa.

Usaram-se as linhagens BH e SJ do Schistosoma mansoni e oito substâncias:

1) Água pura (controle)

2) Água de condicionamento (SCW) de

a) moluscos B. glabrata (SCWBG)

b) moluscos B. tenagophila (SCWBT)

3) Hemolinfa (HEMO)

a) moluscos B. glabrata (HEMOBG)

b) moluscos B. tenagophila (HEMOBT)

4) Amônia

a) 15 ppm (AMONIA 15)

b) 60 ppm (AMONIA 60)

5) Cálcio

a) 7 ppm (CA7)

b) 20 ppm (CA20)

6) Magnésio

a) 1 ppm (MG1)

b) 3,5 ppm (MG3,5)

7) Sódio

a) 10 ppm (NA10)

b) 13 ppm (NA13)

8) Potássio

a) 12 ppm (K12)

b) 18 ppm (K18)

Método de análise

Os objetivos principais são:

a) verificar possíveis efeitos das substâncias na distribuição dos contatos entre CCR e CSR; comparar cada substância com água.

b) comparar os dois níveis de cada substância entre si, determinando possível efeito de dose.

Os resultados do experimento constituem-se numa Tabela (Tabela 10) de freqüência a três classificações; substância, tipo de contato e linhagem do miracídio. A Tabela é de um tamanho 15x2x2. Nenhuma freqüência imaginável é fixada a priori.

As freqüências observadas podem ser consideradas como observações de processos de Poisson independentes. Sob esta hipótese, podemos usar o modelo log-linear (ver, p. ex.; Bishop, Fienberg e Holland¹ (1975), para estudar os itens a e b.

Resultados da análise

Inicialmente ajustamos todos os possíveis modelos hierarquizados, usando o programa P3F do BMDP (Dixon⁵, 1979), no computador PDP-11/45 do ICMSC-USP. Verificou-se que os três fatores estão fortemente relacionados. Tivemos, então, de passar a estudar associações parciais entre dois fatores, em cada nível do terceiro. Optamos por estudar Tipo de contato e Linhagem, em cada substância, em separado.

A análise detalhada que foi realizada consiste no estudo de várias tabelas 2x2.

A seguir apresentamos as estatísticas qui-quadrado, de Pearson (X²) e da razão de verossimilhança (G²) e seus respectivos níveis de significância (probabilidade de a estatística ser maior do que a observada, supondo-se não haver dependência entre os fatores). O logaritmo da razão de produtos cruzados (log a , com a =f₁₁f₂₂(f₁₂f₂₁)) é apresentado junto com um intervalo de confiança assintótico ao nível de 95%. Esse número indica não associação quando log a = 0. Estimativas da probabilidade de CCR (PCCR), com seus respectivos limites de confiança a 95%, também são mostrados.

Quando o teste de associação revelar-se não significante, consideramos as duas linhagens homogêneas e estimamos P_CCR da marginal correspondente, a mesma para as duas linhagens. No caso contrário, estimamos um valor de P_CCR para cada linhagem.

Os resultados encontram-se na Tabela 11.

Pode-se testar se P_CCR, por linhagem, quando for o caso, difere daquele de água. Trata-se ainda de formar Tabelas 2x2 e calcular as estatísticas apropriadas. Usaremos a X² de Pearson (Tabela 12).

Verifica-se que P_CCR de cada linhagem e substância difere de P_CCR de água. De fato, inspeção nas colunas de P_CCR, na Tabela 11, revela que são todas maiores; isto é, as substâncias empregadas, sem exceção, aumentaram a atração.

Da Tabela 11 nota-se que P_CCR de BH é muito maior para SCWBG e SCWBT (cerca de 80%), Já SJ foi atraído por diversas substâncias com P_CCR = 0,70 ou maior. Entretanto, é notável P_CCR (SJ) = 0,99 para SCWBT.

Finalmente resta comparar os dois "níveis" de cada substância entre si, por linhagem (Tabela 13). A mesma técnica é usada: analisam-se as tabelas 2x2 com estatística X² de Pearson, para comparar-se P_CCR em cada nível de substâncias.

No experimento com SCW verifica-se que a linhagem BH foi igualmente atraída por SCWBG e SCWBT.

A linhagem SJ foi específica: teve atração igual a de BH para SCWBG, mas apresentou P_CCR = 0,99 para SCWBT.

Com HEMO, verifica-se que HEMOBT atrai mais, porém igualmente ambas as linhagens, de que HEMOBG.

A amônia teve efeitos iguais nos seus dois níveis.

O cálcio apresentou diferença somente na linhagem SJ: a dose 7 ppm atraiu mais do que 3,5 ppm.

O magnésio não apresentou efeito de doses, do mesmo modo que sódio. Já o potássio apresentou efeito de dose só para a linhagem SJ: a dose 12 ppm atraiu mais do que 18 ppm.

DISCUSSÃO E CONCLUSÕES

Procuramos identificar substâncias presentes na SCW de B. glabrata e B. tenagophila que pudessem ser responsáveis por estímulos quimiotáxicos. Testamos também a ação da hemolinfa sobre os miracídios.

Após a análise estatística dos resultados pudemos constatar vários aspectos interessantes que passaremos a relacionar.

A SCW de B. tenagophila atraiu mais intensamente os miracídios simpátricos. A SCW de B. glabrata exerceu atração aparentemente semelhante sobre miracídio BH e SJ.

A hemolinfa de B. tenagophila apresentou maior poder de atração sobre miracídios SJ, exercendo também forte poder de atração sobre miracídios BH. A hemolinfa de B. glabrata exerceu menor poder de atração sobre os miracídios das duas linhagens. Parece que a hemolinfa das duas espécies de moluscos estudadas contém substâncias capazes de excitar a atividade de penetração dos miracídios BH e SJ.

B. tenagophila eliminou mais Ca⁺⁺, Mg⁺⁺, Na⁺, K⁺ e NH⁺₄ que B. glabrata. Não conseguimos detectar a eliminação de Fe, Cu, P ou NO^-₂ pelas duas espécies citadas de planorbídeos.

Os cátions Ca⁺⁺, Mg⁺⁺ , Na⁺, K⁺ e NH⁺₄ têm maior poder de atração para miracídios SJ. Exatamente estes cátions são mais eliminados por B. tenagophila, hospedeiro natural da linhagem SJ de S. mansoni.

Os miracídios SJ foram mais atraídos, em ordem decrescente, por Mg⁺⁺ , NH⁺₄, Na⁺, Ca⁺⁺ e K⁺.

Os miracídios BH foram mais atraídos, em ordem decrescente, por: K⁺, Mg⁺⁺, NH⁺₄, Na⁺ e Ca⁺⁺.

Nenhum cátion, isoladamente, mostrou poder de atração maior que o poder da SCW das duas espécies de caramujos.

Magnésio, sódio e amônia, não apresentaram diferença de atração devido a concentração nos limites testados no experimento.

Para a linhagem SJ, o potássio apresentou maior atração em concentração de 12 ppm que em 18 ppm.

Para a linhagem SJ, o cálcio apresentou maior atração em concentração de 7 ppm que em 3,5 ppm.

Em análise prévia de aminoácidos observamos que: B. glabrata eliminou mais leucina, prolina e argilina; B. tenagophila eliminou mais alanina, serina, ácido espártico, fenilalanina, ácido glutâmico e tirosina.

As conclusões acima relacionadas parecem mostrar que B. tenagophila elimina no meio ambiente substâncias capazes de atrair mais especificamente as larvas simpátricas de S. mansoni. B. glabrata elimina no meio ambiente substâncias que atraem larvas de S. mansoni porém sem discriminá-las quanto a linhagem simpátrica e alopátrica. Estas substâncias miraxonais, encontradas na água onde vivem os moluscos, estão presentes, em maior concentração, na hemolinfa destes moluscos, comportando-se aí com as mesmas características descritas anteriormente.

Recebido para publicação em 08/11/1984

Aprovado para publicação em 21/03/1985

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  21 Set 2005
• Data do Fascículo
  Abr 1985

Histórico

• Aceito
  21 Mar 1985
• Recebido
  08 Nov 1984