Diagnóstico de infecção congênita e perinatal por citomegalovírus utilizando a reação em cadeia da polimerase

Diagnosis of congenital and perinatal cytomegalovirus infection by using the polymerase chain reaction

ARTIGO

Diagnóstico de infecção congênita e perinatal por citomegalovírus utilizando a reação em cadeia da polimerase

Diagnosis of congenital and perinatal cytomegalovirus infection by using the polymerase chain reaction

Aparecida Yulie Yamamoto, Victor Hugo Aquino, Luis Tadeu Moraes Figueiredo e Marisa Marcia Mussi-Pinhata

Resumo Aplicou-se uma reação em cadeia da polimerase (PCR) no diagnóstico de infecção congênita e perinatal por citomegalovirus, comparando-a com a técnica de isolamento viral em cultura celular. Foram processadas 305 amostras de urina de crianças de 0 a 6 meses, por ambas as técnicas. Utilizou-se na PCR os primers que amplificam parte do gene codificador do principal antígeno precoce imediato de CMV. Detectou-se virúria em 47 amostras por PCR e comparando os resultados com aqueles obtidos pelo isolamento viral, observou-se copositividade de 89,6% e conegatividade de 98,5%. Estas amostras positivas tiveram o resultado confirmado por PCR utilizando outros primers que amplificam regiões dos genes codificadores das glicoproteínas B e H de CMV. O diagnóstico de infecção congênita e perinatal por CMV pela PCR mostrou sensibilidade comparável à do isolamento viral e o uso de vários primers conferiu alta especificidade ao teste.

Palavras-chaves: Citomegalovirus. Diagnóstico da citomegalovirose. Reação em cadeia da polimerase. Infecção congênita e perinatal.

Abstract The practical application of a polymerase chain reaction (PCR) amplification for the diagnosis of congenital and perinatal cytomegalovirus (CMV) infections was evaluated. Three hundred five urine samples were tested by PCR and conventional virus isolation in cell culture. Viruria was detected in 47 urine samples by PCR using a primer pair which amplifies part of the major immediate-early (MIE) CMV genome. The PCR compared to virus isolation showed 89,6% sensitivity, 98,5% specificity and 91,5% positive predictive value. PCR with primer pairs amplifying parts of the glycoprotein B and glycoprotein H genes of CMV were used for confirmation of the positivity of the 47 urine samples. We concluded that this CMV PCR assay in urine has a suitable sensitivity for the diagnosis of congenital and perinatal infections and its specificity is highly increased by use of more than one pair of primers among the ones we used.

Key-words: Cytomegalovirus. Cytomegalovirus diagnosis. Polymerase chain reaction. Congenital and perinatal infection.

Os citomegalovirus (CMV) representam atualmente os agentes etiológicos mais comuns de infecção congênita e perinatal em diversas partes do mundo. A infecção congênita ocorre em 0,2 a 2,2% dos recém-nascidos, com incidência maior em populações de classe sócio-econômica baixa^{1 18 23}. A infecção perinatal, como resultado da transmissão durante o parto, pelo leite materno ou por transfusões de sangue, é muito freqüente, com incidência de 5 a 38%^{1 15}.

Os CMV pertencem ao gênero Citomegalovírus, subfamília ß-Herpesvirinae da família Herpesviridae. Medem 200nm e possuem envelope, tegumento e capsídio protéico com simetria icosaédrica. Seus genomas são constituídos por ácido desoxirribonucleico de fita dupla contendo cerca de 230000 pares de bases^{3 14}.

Na compreensão da história natural da citomegalovirose grandes avanços tem ocorrido. Sabe-se que a infecção congênita por CMV pode resultar em sequelas importantes como a surdez e o retardo do desenvolvimento neuro-motor. A infecção perinatal pode estar associada a pneumonites de longa evolução e gravidade variável. Entretanto, por não se procurar o diagnóstico rotineiro e precoce de citomegalovirose nessas crianças, fica prejudicada a intervenção com recursos terapêuticos que poderiam minimizar a gravidade dos casos e particularmente nas infecções congênitas, possibilitaria diminuir a intensidade das seqüelas e também definir uma população de risco para o desenvolvimento de anormalidades futuras^{8 23}.

O isolamento viral na urina é o método clássico utilizado no diagnóstico da citomegalovirose congênita e perinatal²⁰. Porém, atualmente, métodos alternativos vem sendo utilizados para a detecção de virúria por CMV^{4 13 21}.

Objetivamos com este estudo avaliar a aplicação no diagnóstico de infecção congênita e perinatal por CMV de uma reação em cadeia da polimerase (PCR) utilizando 3 pares de iniciadores (primers) e comparar esta técnica com o isolamento viral.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram testadas 305 amostras da urina de 204 crianças com idade entre 0 e 6 meses, que foram atendidas no Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da Universidade de São Paulo (HCFMRP-USP), no período de 1993 a 1995. Também, utilizou-se amostra do protótipo de CMV humano cepa AD 169 em fluido da cultura de fibroblastos humanos.

Isolamento viral na urina em cultura de fibroblastos humanos com identificação do CMV por imunofluorescência usando anticorpo monoclonal ^{10 20}. Cem µl de urina fresca tratada por 1 hora com amicacina (500µg/ml) eram inoculados em duplicata nas monocamadas de uma linhagem celular diplóide de fibroblastos humanos, cultivadas em meio mínimo essencial com sais de Earle. As células eram mantidas em microplacas plásticas de 24 orifícios, a 37^oC e em estufa de CO₂. As culturas celulares eram observadas diáriamente em microscópio invertido (Zeiss, Alemanha), por período de até 30 dias, buscando detectar a infecção por CMV através da visualização de efeito citopático (ECP) característico. Neste caso, o ECP é definido pela presença de células grandes e arredondadas, dispostas em lesões focais ou por toda a monocamada e contendo numerosas granulações intranucleares e citoplamáticas. Fazia-se confirmação posterior do isolamento viral nas células infectadas utilizando teste de imunofluorescência com anticorpo monoclonal específico para CMV conjugado à fluoresceína (Baxter, USA).

Reação de amplificação gênica em cadeia catalisada pela polimerase (PCR) ^{5 6}. Amostras de urina frescas ou armazenadas a -70^oC foram testadas por PCR inicialmente utilizando o par de primers MIE^{3 6} (Tabela 1) que permite a amplificação de uma região do gene que codifica o principal antígeno precoce imediato dos CMV. As amostras de urina nas quais foi possível a detecção do ADN viral com os primers MIE, foram testadas novamente por PCR para confirmação da presença viral. Nos testes confirmatórios, em todas as amostras préviamente positivas com o primer MIE, utilizou-se separadamente outros 2 pares de primers, denominados gB e gH^{2 3} (Tabela 1), que amplificam regiões do genoma dos CMV codificadoras das glicoproteínas B e H, respectivamente. Em 11 dessas amostras positivas, foi realizado também um PCR multiplex, utilizando conjuntamente os 3 pares de primers em um mesmo teste⁹. Os primers MIE foram sintetizados no Laboratório de Hematologia do HCFMRP-USP e os primers gB e gH por GIBCO-BRL (USA).

A PCR era efetuada acrescentando-se a 2µl da amostra de urina, 2,5µmol de cada um dos 4 trifosfatos de desoxinucleotídeo, 15 pmol de cada primer, 5µl de tampão contendo 5mM de Tris (pH 9,0), 750µM de MgCl₂, 25mM de KCl e água destilada e deionizada, completando um volume de 50µl. A mistura era incubada a 94^oC por 6 minutos (hot start), adicionava-se 1U de Taq ADN polimerase (Pharmacia) e a mesma era submetida a 40 ciclos de amplificação, em ciclador térmico (Techne, Inglaterra), a 95^oC por 60 segundos, 55^oC por 90 segundos e 72^oC por 120 segundos, seguidos ao final por 3 minutos a 72^oC. Utilizou-se como controle positivo da PCR fluido da cultura de fibroblastos humanos infectados com CMV cepa AD169 e como controle negativo usou-se água deionizada.

Após eletroforese em gel de agarose a 2%, os produtos da PCR eram corados em solução de brometo de etídio e visualizados à luz ultra-violeta.

Titulação do CMV AD169. Diluições decimais e seriadas, até 1:1000, da amostra de CMV cepa AD169 foram inoculadas, em quadruplicata, 10µl por orifício, numa microplaca de 96 orifícios contendo monocamadas de fibroblastos humanos. As colônias foram observadas no 15º dia pós-inoculação quando determinou-se os orifícios em que as monocamadas apresentavam ECP característico. Com base nesta leitura do teste, calculou-se o título viral em dose infectante para 50% das culturas celulares (TCID₅₀), utilizando a técnica de Reed Muench¹¹. As mesmas diluições decimais e seriadas, até 1:1000, da semente do CMV cepa AD169 foram testadas por PCR, em quadruplicata, utilizando os 3 pares de primers.

Análise estatística. Os resultados dos testes PCR foram comparados com os obtidos pela técnica padrão, o isolamento viral, utilizando tabelas 2 x 2, com determinação da sensibilidade e da especificidade do método. Análise da associação entre PCR e isolamento viral foi feita por teste qui-quadrado (p < 0,05).

RESULTADOS

Os resultados observados com os controles positivo (fluido da cultura de fibroblastos infectados com CMV cepa AD169) e negativo (água deionizada), foram compatíveis em todos os testes efetuados.

Detecção do CMV na urina. Conforme mostrado na Tabela 2, das 305 amostras de urina testadas, isolou-se o CMV em 48 (15,7%) e a amplificação de ADN do CMV com o par de primers MIE foi possível em 47 (15,4%). Em 5 urinas das quais o CMV foi isolado, não se conseguiu amplificação do DNA viral e em 4 amostras em que a PCR foi positiva, o vírus não foi isolado. Assim, em 52/305 (17%) das urinas foi possível a detecção do vírus, por isolamento e/ou por PCR e, destas, 43/52 (82,7%) foram positivas por ambas as técnicas.

As 52 amostras urinárias, nas quais a virúria foi detectada por isolamento e/ou PCR, eram de 9 recém-nascidos com diagnóstico de infecção congênita e de 15 lactentes com infecção perinatal por CMV. Foram analisadas pelo menos 2 amostras da urina de cada uma destas crianças.

Comparação da PCR utilizando primers MIE e o isolamento viral. Com base nos números mostrados na Tabela 2, a copositividade entre isolamento viral e PCR foi de 89,6% e a conegatividade de 98,5%. O valor preditivo positivo da PCR para o isolamento viral foi de 91,5% e o valor preditivo negativo de 98%. A concordância entre os dois testes foi de 97%. Observou-se alta associação entre as técnicas (c² = 233,72 e p < 0,0001).

Resultados obtidos com os diferentes pares de primers. Em todas as 47 amostras de urina positivas por PCR com os primers MIE, foi possível a amplificação do ADN viral com os primers gB e gH, utilizados isoladamente. Em 11 amostras, nas quais foi realizado um PCR multiplex, ocorreu amplificação de 3 fragmentos distintos do ADN viral, obtidos com os 3 pares de primers simultâneamente. Produtos genômicos de CMV amplificados com o par de primers MIE estão apresentados na Figura 1 e na Figura 2 os produtos amplificados em PCR multiplex com os primers MIE, gB e gH.

Titulação da amostra do CMV AD169 e análise da sensibilidade da PCR. A detecção da presença viral por PCR utilizando os primers MIE e gB, nos testes com as diluições decimais da amostra de CMV AD169, ocorreu até a diluição 1:100 e na PCR com o primer gH até a diluição 1:10, conforme mostra a Figura 3.

A amostra do CMV AD169 mostrou título de 10^3,5 TCID₅₀/ml, com base na detecção do efeito citopático. Comparando este resultado com aqueles obtidos por PCR nas diferentes diluições da mesma semente viral (Tabela 3) observou-se uma sensibilidade 50 vezes maior da PCR com os primers MIE e gB o que permitiria detectar a presença viral em amostras com título viral tão baixo quanto 10^1,8 TCID₅₀/ml. Também, observou-se uma sensibilidade 5 vezes maior da PCR com os primers gH, sugerindo capacidade para detectar amostras virais com título de 10^2,8 TCID₅₀/ml.

DISCUSSÃO

É conhecido que crianças com citomegalovirose excretam grandes quantidades de vírus na urina e por períodos prolongados. As quantidades de vírus excretadas costumam ser bem superiores às observadas em adultos com infecção adquirida²³. A detecção do CMV na urina de recém-nascidos nas 3 primeiras semanas de vida define a infecção congênita^{1 7 23}. Por outro lado, a infecção perinatal é diagnosticada quando crianças em que a virúria era negativa ao nascimento, passam a apresentá-la entre a 4ª e 12ª semana de vida^{1 15 23}. Assim, a observação da presença viral na urina é a técnica mais comumente utilizada para o diagnóstico dessas infecções.

Método clássico para a detecção de virúria, o isolamento viral, tem seu uso rotineiro dificultado por necessitar recursos laboratoriais dispendiosos que permitam a manutenção de culturas celulares de fibroblastos humanos e por exigir que as amostras de urina sejam colhidas com assepsia rigorosa e inoculadas logo após a coleta, uma vez que os CMV são muito lábeis. Outro inconveniente desta técnica é a demora na obtenção do resultado do exame, uma vez que os CMV são de replicação lenta, podendo levar semanas para o aparecimento do ECP²⁰. A aplicação da PCR no diagnóstico da infecção por CMV apresenta algumas vantagens sobre o isolamento viral. Para o teste utiliza-se volumes diminutos de material (1 a 2µl) e o seu resultado pode ser obtido em menos de 24 horas. Também, as amostras clínicas a serem testadas por PCR podem ser congeladas e armazenadas.

Utilizamos na PCR os primers MIE, gB e gH com base em estudos prévios mostrando que estes primers amplificam regiões distintas do genoma altamente conservadas nas diversas cepas do virus e, também, possuem alta especificidade para CMV, não amplificando o ADN de outros herpesvirus^{2 5 8 16 17}.

Analisando os resultados obtidos pela PCR em nosso estudo e sua comparação com os obtidos pelo isolamento viral, observamos associação altamente significante entre as técnicas (c² = 233,72 e p < 0,0001) e resultados comparáveis, com sensibilidade (89,6%), especificidade (98,5%) e valor preditivo positivo (91,5%) adequados. Demmler e colaboradores⁶, utilizando os primers MIE, analisaram por PCR urinas de recém-nascidos com infecção congênita e comparando estes resultados com os obtidos pelo isolamento viral, encontraram sensibilidade de 93%, especificidade de 100% e valor preditivo positivo de 100%, valores semelhantes aos observados em nosso estudo.

Apesar de alguns trabalhos, como o de Khan e colaboradores¹², demonstrarem que existem inibidores na urina para a reação da PCR, como a uréia, sabe-se que os recém-nascidos, habitualmente, possuem baixos teores de uréia, lipídios e proteínas urinárias, o que reduz esta interferência com a ligação dos primers e a amplificação do genoma viral. Assim, a metodologia simplificada da PCR que utilizamos neste estudo permitiu realizar teste sem nenhum tratamento prévio com a vantagem de evitar os complexos procedimentos para extração do DNA viral^{5 16 17 21}. Em nosso estudo, observamos 5 amostras com isolamento positivo e PCR negativa. Acreditamos que, nestes casos, a presença de inibidores urinários tenha interferido nos resultados, reduzindo a sensibilidade da PCR. Estas urinas pertenciam a 4 crianças com idade entre 3 a 4 meses e portanto, com teores urinários de uréia superiores aos observados nos recém-nascidos.

Neste trabalho, observamos uma adequada sensibilidade da PCR utilizando os 3 pares de primers. Em todos as urinas que tiveram amplificação viral por MIE o teste mostrou-se positivo quando utilizou-se gB ou gH. Também, a adequada sensibilidade da técnica pode ser observada nos experimentos com o CMV AD 169, em que baixos níveis de vírus (10^1,8TCID₅₀/ml) mostraram-se detectáveis pelos primers MIE e gB. Nestes experimentos a sensibilidade de gH mostrou-se 10 vezes inferior (Tabela 3 e Figura 3).

A confirmação dos resultados obtidos na PCR para CMV pode ser realizada através de hibridação com seqüência de nucleotídeos específica para a região do genoma amplificada, marcada com isótopo radioativo ou enzima^{5 22}. Entretanto, tal técnica apesar de ser altamente específica, aumenta a complexidade e o custo do teste. A confirmação da seqüência dos nucleotídeos de CMV obtida por PCR, também pode ser feita por técnica denominada nested PCR, em que se produz nova amplificação genômica com o emprego de primers internos à seqüência inicialmente amplificada¹⁹. Em nosso estudo, foi possível a confirmação da PCR para CMV utilizando mais de um par de primers separadamente ou através de um PCR multiplex, em que os diferentes pares de primers são usados conjuntamente. Assim na PCR multiplex, utilizando 3 pares distintos de primers, amplificadores de regiões diferentes do genoma de CMV, conseguimos obter de forma rápida, o resultado característico com a presença de fragmentos de tamanhos diferentes (Figura 2), relacionados especificamente a cada um dos primers. Nesta situação, cada produto amplificado corresponde a um controle interno da especificidade dos outros fragmentos detectados no mesmo teste, dispensando procedimentos posteriores para a confirmação destes produtos⁹.

Portanto, a PCR tem uma grande aplicabilidade, comparável ao isolamento viral no diagnóstico da citomegalovirose, particularmente na infecção congênita e perinatal e o uso simultâneo de mais de um par de primers na PCR pode aumentar a especificidade do teste, sua rapidez, praticidade e economia.

Unidade Multidisciplinar de Pesquisa em Virologia, Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, SP.

Trabalho financiado parcialmente pela FAPESP e CNPq.

Endereço para correspondência: Drª Aparecida Yulie Yamamoto, Unidade Multidisciplinar de Pesquisa em Virologia, FMRP/USP, Av. Bandeirantes 3900, Campus da USP, Bairro Monte Alegre, 14049-900 Ribeirão Preto, SP. Fax [phone].

Recebido para publicação em 03/01/97.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  13 Jun 2000
• Data do Fascículo
  Fev 1998

Histórico

• Recebido
  03 Jan 1997