Relação entre o diagnóstico sorológico (ELISA) e a gravidade da tuberculose pulmonar na infância

Relationship between serological diagnosis (ELISA) and gravity of pulmonary tuberculosis in children

ARTIGO

Relação entre o diagnóstico sorológico (ELISA) e a gravidade da tuberculose pulmonar na infância

Relationship between serological diagnosis (ELISA) and gravity of pulmonary tuberculosis in children

Clemax Couto Sant'Anna¹, Leila de Souza Fonseca² e Maria Helena Féres Saad³

Resumo Foram estudadas 48 crianças de 0 a 13 anos através da realização do ensaio imunoenzimático ligado a enzima (ELISA) para pesquisa de anticorpos da classe IgG antiPPD, visando estabelecer correlação entre a resposta imune humoral medida pela sorologia e a gravidade da tuberculose, segundo formas radiológicas (leve, moderada e grave). A amostra foi composta de 29 crianças com tuberculose e 19 sem tuberculose comunicantes de tuberculose). Os valores médios (medianas) da densidade óptica do teste ELISA foram, respectivamente: 0,098 na forma gânglio-pulmonar (leve), 0,092 na forma pneumônica (moderada) e 0,134 na tuberculose miliar (grave). Nas crianças não tuberculosas com radiografia de tórax normal, o ELISA foi igual a 0,020. Os achados evidenciam valores mais elevados do teste sorológico relacionados à maior gravidade da doença (p= 0,0007).

Palavras-chaves:ELISA. Tuberculose pulmonar. Crianças. Diagnóstico sorológico.

AbstractForty eight children from 0 to 13 years old were submitted to the enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) serological test with a view to detect anti PPD IgG antibodies, for diagnosis of pulmonary tuberculosis and to establish the relationship between immune response and radiological gravity of pulmonary tuberculosis (mild, moderate and severe). There were 29 children with pulmonary tuberculosis and 19 children without tuberculosis. The median ELISA optical density were: 0.098 in children with primary complex (mild); 0.092 in children with pneumonic pattern (moderate) and 0.134 in children with miliary tuberculosis (severe). These data show higher positive serological test results in severe forms of pulmonary tuberculosis (p = 0.0007).

Key-words:ELISA. Pulmonary tuberculosis. Children. Serodiagnosis.

A tuberculose no Brasil, guardadas as diferenças regionais do país, ainda detém elevadas taxas de incidência. Nos últimos cinco anos, vem sendo notificados cerca de 85.000 casos novos por anos. A situação da doença no Estado do Rio de Janeiro, revela o coeficiente de incidência mais elevado no país, de 111,7/100.000 habitantes. Na cidade do Rio de Janeiro, seu coeficiente de incidência de 54,7/100.000 habitantes, representa o dobro da média nacional. Em 1997 foram notificados à Secretaria Municipal de Saúde do Rio de Janeiro, 10.073 casos. No período de 1995 a 1997, cêrca de 6% dos casos notificados eram de menores de 15 anos, dos quais 71,5% apresentavam tuberculose pulmonar⁵. Um dos obstáculos ao conhecimento da verdadeira situação da tuberculose infantil, não só no Brasil mas em todo o mundo, é a dificuldade de se estabelecer o diagnóstico da doença em crianças que geralmente, são abacilíferas. O primeiro contato do organismo humano com o Mycobacterium tuberculosis, denomina-se primo-infecção, na qual há sequência de eventos que vão da chegada do bacilo, quase sempre pela via inalatória, à formação do complexo primário e ao estabelecimento da imunidade adquirida, dominantemente celular que quase sempre leva o hospedeiro a suplantar a agressão da primo-infecção e a detê-la.

A atuação da imunidade humoral parece ser relevante nas fases iniciais da lesão tuberculosa, quando os macrofagos ativados iniciam a fagocitose de bacilos, cujos antígenos são capazes de propiciar resposta de linfócitos B. Estes, seriam estimulados pelas celulas T helper e sintetizariam lisozimas, imunoglobulinas capazes de inativar produtos de defesa e de degradação do M. tuberculosis, que é considerada a principal ação da imunidade humoral na tuberculose. A imunoglobulina G (IgG) específica tem papel importante na resposta à agressão do microorganismo. Entretanto, parece que na fase inicial é maior a participação da IgA, enquanto mais tardiamente destaca-se a IgG^{3 9 10}.

Dependendo da resposta exaltada da imunidade celular, se houver alta concentração de linfócitos T supressores, a imunidade humoral terá participação discreta.

Os métodos sorológicos de diagnóstico na tuberculose vem sendo valorizados, porém não são disponíveis na rotina, mesmo em países desenvolvidos que ainda os reservam a situações experimentais⁸.

Em se tratando de crianças, pela dificuldade de se obter positividade bacteriológica, o diagnóstico sorológico poderia ser útil para complementar os critérios diagnósticos convencionais, baseados no quadro clínico-radiológico, em dados epidemiológicos e no teste tuberculínico¹¹.

O método ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay), isto é, ensaio enzimático ligado a enzima, utiliza antígeno fixado em placa na qual é incubado o soro em que se deseja testar a presença de anticorpos que, posteriormente, entra em contato com um segundo anticorpo antiimunoglobulina marcado com enzimas⁵.

O ELISA foi inicialmente desenvolvido por Engvall & Perlman⁶. e por van Weeman & Schuurs¹⁴ e, posteriormente, muito utilizado como teste diagnóstico em varias doenças. Em tuberculose os anticorpos pesquisados, geralmente são da classe IgG, cuja elevação mais marcada costuma ocorrer em pacientes com doença em atividade.

O diagnóstico sorológico da tuberculose também recebeu grande contribuição com a identificação de anticorpos monoclonais de micobactérias permitindo isolar antígenos bacterianos específicos³.

Fonseca et al⁷ procuraram estabelecer correlação entre a positividade da resposta imune e a gravidade das formas clínicas de tuberculose, em adultos e crianças, medida pela resposta ao teste ELISA. Seus achados apontaram para a maior formação de anticorpos nas formas mais avançadas de tuberculose, principalmente nos pacientes pediátricos.

Neste sentido, desenvolveu-se o presente trabalho que tem por objetivo estudar o comportamento do diagnóstico sorológico da tuberculose pulmonar na infância em relação à gravidade da doença.

PACIENTES E MÉTODOS

O estudo transversal de teste diagnóstico, foi realizado prospectivamente com crianças internadas no Instituto de Puericultura e Pediatria Martagão Gesteira (IPPGM) e atendidadas no ambulatório do Instituto de Tisiologia e Pneumologia (ITP), ambos da Universidade Federal do Rio de Janeiro (UFRJ).

Pacientes. Critérios de seleção: foram estudadas 48 crianças e adolescentes de famílias de baixa renda, de ambos os sexos, com idades variando de 0 a 13 anos, sendo 29 tuberculosas e 19 não tuberculosas, sadias, contactantes de tuberculosos.

O diagnóstico de tuberculose foi feito com base em dados clínicos, radiológicos, epidemiológicos e evolutivos, sendo que em 17 casos houve confirmação bacteriológica, através de cultura para M. tuberculosis do lavado gástrico.

Foi considerado caso de tuberculose, a criança que tivesse cultura positiva para M. tuberculosis ou que preenchesse os seguintes critérios:

1) quadro clínico-radiológico de pneumonia com evolução igual ou superior a 15 dias, não responsiva a antibioticoterapia sem ação comprovada contra o M. tuberculosis; 2) contato com adulto bacilífero nos últimos 12 meses.

Ensaio sorológico: O ensaio imunoenzimático visou a detecção de anticorpos da classe IgG respondedores ao antígeno PPD Rt-23. Empregou-se solução antigência com PPD para sensibilização da placa na concentração de 10 microgramas/ml de Tampão Carbonato ph=9,6 para o sensibilizar os orifícios da microplaca Immulon I, fundo reto (Dynatech, VA, USA). Cem microlitros da solução foram utilizados em cada orifício e deixados overnight a 4^oC. Após lavagem da placa com PBS-Tween 20 0,1% (PBST) e bloqueio dos espaços interantígenos com o PBSt-BSA 1%, o soro do paciente foi diluído a 1:160 em tampão PBST e adicionado aos respectivos orifícios. Após incubação por uma hora a 37^oC, foi realizada nova lavagem e adicionado conjugado anti-IgG humana-beta galactosidase (BIOSYS, Compiègne, France) na diluição de 1:1000 em PBST-BSA. Após incubação por uma hora a 37^oC, seguida de nova lavagem foi adicionada a solução substrato-reveladora, contendo 0,8mg/ml de o-nitrophenyl-beta-galactopyranizidio (Sigma, USA), 90 microlitros beta-mercaptoetanol e tampão fosfato (0,1 MK2HPO4, 1mM MgSO4). Após incubação de uma hora a 37^oC, interrompeu-se a reação com carbonato de sódio a 32%. Os valores da absorbância foram obtidos no leitor Titertek Multiskan com filtro de 405mm. Todas as placas utilizadas para os testes foram incluídas dois soros referência negativo e positivo, para corrigir possíveis variações diárias da sorologia.

Para comparação das variáveis estudas em ambos os grupos foram calculadas as medianas para expressar os valores médios de densidade óptica (DO) do teste ELISA, por se tratar de amostra que não obedece à distribuição normal. Desta forma, foi possível comparar os resultados do presentre estudo com outros da literatura.

Os soros coletados foram congelados e os testes foram feitos simultaneamente, a posteriori da conduta clinica traçada para os pacientes.

A gravidade da forma de tuberculose foi estabelecida segundo critério radiológico que possibilitou definir as seguintes formas¹²: leve ¾ padrão gânglio-pulmonar; moderada ¾ imagens de condensação pulmonar; grave ¾ imagem hematogênica (infiltrado de padrão miliar).

Análise estatística. Os dados obtidos foram tabulados com auxílio de microcomputador e do pacote estatístico EPI INFO 6, empregando-se o teste não paramétrico Kruskal - Wallis e considerando-se o nível de significância do valor de p< 0,05. A análise estratificada utilizou para comparação das medianas o teste de Mantel-Haenszel.

RESULTADOS

A análise quanto à classificação de gravidade radiológica nas 28 crianças com tubeerculose mostrou a ocorrência de formas leves em nove (31%) pacientes, moderadas em 12 (41,4%) e graves em oito (27,6%). As 19 radiografias dos comunicantes de tuberculose eram normais.

A Tabela 1 descreve a análise do teste sorológico em relação às variáveis idade, teste tuberculínico e situação vacinal com BCG que não mostrou diferença estatística. Entretanto, foi observada uma difereça significativa entre os níveis de ELISA e as formas radiológicas de tuberculose, mostrando que títulos elevados do teste estavam realcionados a formas graves da doença (p = 0,0007). Ainda na Tabela 1 observa-se associação entre ELISA e o teste tuberculínico, sugerindo que títulos elevados do ELISA poderiam estar relacionados ao teste não-reator (p=0,060). A Tabela 2 compara o teste tuberculínico e formas radiológicas de tuberculose e mostra que o teste tuberculínico não reator apresentou associação com as formas mais graves da doença (p=0,007). Logo, tornou-se necessário avaliar se a associação ELISA e teste tuberculínico seria ou não fruto de fator de confusão. Através da análise estratificada de Mantel-Haenszel foi possível controlar o efeito da gravidade da doença, mostrando não haver relação entre ELISA e o teste tuberculínico (Tabela 3).

DISCUSSÃO

A radiografia de tórax tem papel fundamental no diagnóstico da tuberculose na infância, pois, com alguma freqüência a doença evolui de forma silenciosa, a ponto de se constatar a dissociação clínico-radiológica, na qual pacientes assintomáticos ou oligossintomáticos exibem extensas lesões radiológicas. Não há unanimidade quanto à classificação radiológica da tuberculose na infância. Adotamos três categorias: gânglio-pulmonar, pneumônica e miliar, que já havíamos empregado em trabalhos anteriores, pois simplifica a diversidade de aspectos radiológicos próprios da doença e procura padronizar a interpretação por vários observadores¹². Esta abordagem permitiu estabelecer a classificação de gravidade da tuberculose empregada no presente estudo.

Em nosso estudo, houve predominância da forma moderada de tuberculose, sobre as demais. Isto porque o padrão radiológico que permitiu tal classificação, na verdade foi o principal critério de inclusão de doentes na pesquisa, daí sua maior freqüência.

A sorologia pelo método ELISA aqui empregada, usou o PPD como antígeno, por sua facilidade de obtenção e baixo custo, em detrimento de antígenos mais específicos que vem sendo descritos na literatura. Deve-se assinalar que em geral, os valores de DO em crianças com tuberculose são mais baixos do que em adultos. Nossa experiência com ELISA pesquisando IgG anti-PPD¹³ mostrou resultados de sensibilidade e especificidade semelhantes aos de Barrera et al², na Argentina que empregaram o antígeno 5 de Daniel, para diagnóstico de tuberculose em crianças.

No presente estudo, avaliou-se a mediana da densidade óptica (DO) do teste ELISA, em relação à faixa etária das crianças, ao comportamento do teste tuberculínico e à gravidade da tuberculose. Buscou-se, desta forma, estabelecer possíveis correlações da resposta imune humoral, medida pelo ELISA, com atributos do hospedeiro. Não se encontrou correlação com o teste tuberculínico, a vacinação BCG e a idade, uma vêz que os testes estatísticos não foram significantes, à semelhança dos resultados de Alde et al¹ em crianças. Observou-se porém, que a mediana da DO de crianças com menos de um ano mostrou valores mais elevados do que os encontrados nas outras faixas etárias, porém sem significância estatística. Talvez com amostra maior fosse possível dados mais consistentes.

Ao se proceder à análise da gravidade radiológica da tuberculose, constatou-se que ocorreram valores mais elevados entre os pacientes com forma grave; valores intermediários nas forma moderada e leve e mais baixos nas criaças sem tuberculose, com significância estatística. A análise estratificada, para afastar fatores de confundimento veio confirmar este achado. Tal observação reitera a noção da maior participação da imunidade humoral nas formas mais graves, ou mais extensas, quando a imunidade celular teria sido depletada, como já havia sido apontada por Fonseca et al⁷.

Concluindo, a utilização do ELISA no diagnóstico de tuberculose pulmonar em crianças, correlacionou-se estatisticamente, com a gravidade radiológica da doença, isto é, valores mais elevados foram obtidos em formas consideradas mais graves, como a miliar.

Sabe-se que muitos casos de tuberculose em crianças passam despercebidos, com retardo de diagnóstico e que sem o tratamento adequado podem vir a falecer. A importância prática de tal achado, seria o fato de permitir o diagnóstico rápido e o conseqüente início de tratamento, em casos suspeitos de formas graves de tuberculose na infância.

AGRADECIMENTOS

Aos Professores: Afrânio Kritski (UFRJ) pela cessão dos soros das crianças comunicantes de tuberculosos; José Uéleres Braga (UERJ) e Antonio J.L. Alves da Cunha (UFRJ) pelas sugestões metodológicas; Bernardo Rangel Tura (UERJ) pela análise estatística e sugestões na revisão do texto.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  23 Jan 2002
• Data do Fascículo
  Dez 2001

Histórico

• Recebido
  16 Jun 1999