Avaliação da resposta imune celular em pacientes com candidíase recorrente

Evaluation of cellular immune response in patients with recurrent candidiasis

ARTIGO

Avaliação da resposta imune celular em pacientes com candidíase recorrente

Evaluation of cellular immune response in patients with recurrent candidiasis

Lucas P. Carvalho; Olívia Bacellar; Nilma A. Neves; Edgar M. Carvalho; Amélia R. de Jesus

Serviço de Imunologia do Hospital Universitário Prof. Edgard Santos da Universidade Federal da Bahia, Salvador, Bahia, Brasil

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

A candidíase recorrente cutânea ou mucosa é caracterizada pela ocorrência de, no mínimo, 4 episódios de candidíase no período de um ano. Não são conhecidos os fatores que levam à recorrência desta infecção. O presente estudo avaliou a resposta linfoproliferativa e a produção de IFN-g de pacientes com candidíase recorrente. Os índices de estimulação da resposta linfoproliferativa em culturas de células de pacientes com candidíase recorrente estimuladas com antígeno de Candida albicans, PPD e TT foram respectivamente de 6±8, 17±20 e 65±30. A adição de anticorpo monoclonal anti-IL-10 às culturas de células de 6 pacientes aumentou a resposta linfoproliferativa de 735±415 para 4143±1746 cpm. A produção de IFN-g em culturas de células estimuladas com antígeno de Candida, foi 162±345pg/ml. Pacientes com candidíase recorrente apresentam uma deficiência na resposta linfoproliferativa e na produção de IFN-g, podendo a resposta imune celular ao antígeno de Candida ser restaurada parcialmente através da neutralização da IL-10 in vitro.

Palavras-chaves: Candidíase. Linfoproliferação. IFN-g. Candida albicans.

ABSTRACT

Recurrent cutaneous or mucosal candidiasis is characterized by the occurrence of at least four candidiasis episodes within a one-year period. The factors involved in recurrence of infection are still unknown. In the present study the lymphoproliferative response and the IFN-g production by candidiasis patients were evaluated. The stimulation index of mononuclear cell cultures of candidiasis patients stimulated with Candida albicans antigen, PPD and TT were 6±8, 17±20 and 65±30, respectively. The addition of monoclonal antibody anti-IL-10 to Candida albicans antigen stimulated cultures raised the lymphoproliferative response from 735±415 to 4143±1746 cpm. The IFN-g production by cells of candidiasis patients stimulated with Candida albicans antigen was 162±345pg/ml. Candidiasis patients have an impairment in the lymphoproliferative response specific to C. albicans antigen and on IFN-g production and the lymphoproliferative response can be partially restored, in vitro, by IL-10 neutralization.

Key-words: Candidiasis. Lymphoproliferation. IFN-g. Candida albicans.

A maioria dos indivíduos infectados por Candida sp cura com terapia antifúngica. A ausência de resposta ao tratamento é uma característica de portadores da candidíase mucocutânea caracterizada pela presença de múltiplas lesões cutâneas e mucosas e está associada a poliendocrinopatias e doenças auto-imunes. Por outro lado, episódios repetidos de infecção por Candida albicans são observados na candidíase recorrente que é caracterizada pela ocorrência de, no mínimo, quatro episódios de vaginites no período de um ano. Dentre as mais de 180 espécies de Candida descritas, a C. albicans é responsável por 90% das infecções em pacientes com candidíase recorrente e é a espécie isolada na grande maioria dos casos de candidíase mucocutânea^{6 15 17}. A forma mais comum de candidíase de repetição é a candidíase vaginal recorrente, que acomete cerca de 6% das mulheres sadias em idade reprodutiva^{10 11 12}.

O papel da imunidade celular no controle da infecção causada por C. albicans tem sido bem demonstrado em modelos experimentais nos quais a dicotomia da resposta imune do tipo CD4+ Th1 e CD4+ Th2 é considerada um fator importante para a suscetibilidade ou resistência à infecção por Candida. Enquanto uma resposta tipo Th1 com produção de IFN-g e IL-2 está relacionada com resistência à Candida^{20 22 23}, a resposta tipo Th2, com secreção de IL-4, IL-5 e IL-10, está relacionada com susceptibilidade a este patógeno^{19 21 23 25 26}.

Dentre os fatores predisponentes para a ocorrência da candidíase humana esporádica tem sido descritos o uso de antibióticos e contraceptivos, gravidez e diabetes mellitus. Contudo, ainda não foi determinada a contribuição destes fatores para o desenvolvimento da candidíase recorrente²⁴. Adicionalmente, estudos controversos têm sido reportados sobre a imunopatogênese da candidíase vaginal recorrente tendo algumas observações mostrado uma baixa resposta linfoproliferativa e ausência de reatividade do teste cutâneo com antígeno de Candida^{7 9}, enquanto outras, detectado a existência de uma resposta do tipo 1 nesses pacientes⁴. O principal objetivo do presente estudo foi avaliar a resposta linfoproliferativa e a produção de IFN-g em pacientes com candidíase vaginal, e candidíase cutânea e mucosa recorrentes.

MATERIAL E MÉTODOS

Pacientes. Participaram deste estudo pacientes com diagnóstico de candidíase vaginal recorrente (n=17), candidíase mucosa recorrente (n=3) e candidíase cutânea recorrente (n=1) acompanhados no Serviço de Imunologia do Hospital Universitário Prof. Edgard Santos. Candida albicans foi o agente etiológico encontrado nas culturas de 7 pacientes com candidíase vaginal recorrente, nas quais foi realizado teste para caracterização da espécie de Candida. Nos outros pacientes foi confirmada a presença de Cândida porém não foi realizada a caracterização da espécie. Todos os pacientes avaliados apresentavam sorologia negativa para HIV. Este trabalho foi aprovado pelo Comitê de Ética do Hospital Professor Edgard Santos da Universidade Federal da Bahia.

Antígeno. O antígeno de C. albicans utilizado no estudo foi preparado a partir de uma cepa isolada de uma paciente com candidíase vaginal recorrente cultivada em meio de cultura sabouroud e centrifugada a 3000g por 30 minutos. O material centrifugado foi lavado com tampão fosfato 3 vezes, re-suspenso em NaOH 0,5N, e em seguida congelado e descongelado 30 vezes. Após centrifugação, o conteúdo protéico foi determinado pela técnica de Lowry¹⁴ no sobrenadante e o material (antígeno solúvel de C. albicans) foi congelado a -20ºC para uso posterior. Os antígenos protéicos toxóide tetânico (Wyeth-Ayerst Lab, Marietta, PA, USA) e PPD (Connaught Laboratories, Ontario, Canada), foram também utilizados.

Teste intradérmico. O teste intradérmico foi realizado com a inoculação de 0,1ml do antígeno de Candida (GIBCO, BRL, RJ, RJ) na região anterior do antebraço. O resultado foi obtido 48 horas após a realização do teste, e foi considerado positivo quando a induração foi maior do que 5mm.

Cultura de células, ensaios para citocina e transformação blástica. Células mononucleares foram obtidas do sangue periférico heparinizado (CMSP) através de gradiente de centrifugação com ficoll-hypaque. Após lavagem com salina, as células foram ajustadas para concentração de 1x10⁶ e cultivadas em meio RPMI 1.640 (GIBCO BRL, Grand Island, NY), suplementado com 10% de soro humano AB, 100IU/ml de penicilina e 100mg/ml de estreptomicina. Alíquotas de 200ml contendo 2x10⁵ células foram adicionadas a placas de microtitulação (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, USA) e estimuladas com antígeno de Candida (0,05mg/ml), após ter sido realizada uma curva dose-resposta. Toxóide tetânico (5LF/ml), PPD (2mg/ml), ou mitógeno pokeweed (PWM) na diluição final de 1:100 foram também utilizados. Em algumas culturas foram adicionados anticorpos monoclonais anti-IL-4 ou anti-IL-10 (Dr. Coffman, DNAX Institute Palo Alto, CA) na concentração de 200mg/ml. Após 5 dias de incubação a 37^oC e 5% CO2, as culturas foram pulsadas com 1mCi/ poço de 3H-timidina (New England Nuclear Research Products, Boston MA) durante 6 horas. As células foram então coletadas (PHD Cell Harvester; Cambridge Technology Inc, Cambridge, MA) e processadas para determinação da incorporação de 3H-timidina através de cintilação líquida. Os resultados foram expressos em contagem por minutos (cpm). Para a dosagem de IFN-g, as células foram ajustadas à concentração de 3x10⁶/ml e estimuladas com antígeno de C. albicans (0,05ug/ml) e antígeno de TT (5LF/ml). Após incubação por 72 horas, os sobrenadantes foram coletados e estocados a -70^oC. Os níveis de IFN-g foram obtidos através da técnica de ELISA sandwich, utilizando-se anticorpos comercialmente vendidos (R&D Systems, Minneapolis, MN, USA) e os resultados foram expressos em pg/ml, por interpolação numa curva padrão com IFN-g recombinante.

Análise estatística. A comparação das respostas proliferativas e a produção de IFN-g entre os grupos de pacientes com infecção recorrente por C. albicans e controle foi realizada utilizando-se o teste de Mann-Whitney, considerando que os dados não tinham uma distribuição gaussiana.

RESULTADOS

Dos 21 pacientes estudados, 17 tinham candidíase vaginal recorrente, 3 apresentavam candidíade mucosa de repetição e 1 paciente candidíase cutânea recorrente. Dentre os três pacientes com candidíase mucosa, uma era criança de dois anos de idade com candidíase bucal desde os quatro meses de vida, admitida por apresentar febre, monilíase oral e pneumonia, sendo C. albicans isolada em hemocultura. Os outros dois pacientes, um do sexo masculino e um do sexo feminino apresentavam candidíase esofágica, associada à disfagia, e candidíase intestinal associada à diarréia, respectivamente, sendo a C. albicans documentada em material obtido através de endoscopia digestiva alta ou colonoscopia. O paciente com candidíase cutânea de repetição apresentava uma micose superficial com cinco anos de duração que respondia a terapêutica tópica ou oral com antifúngico, havendo, entretanto, reaparecimento das manifestações após o tratamento. A resposta ao teste intradémico com antígeno de Candida albicans foi negativa em todos pacientes. A idade, forma clínica, duração da doença, resposta linfoproliferativa e níveis de IFN-g de 21 pacientes com candidíase recorrente são mostrados na Tabela 1. Avaliação somente da resposta linfoproliferativa foi realizada em 4 pacientes. Níveis de IFN-g isoladamente foram determinados em 10 casos, e em 7 pacientes determinados os níveis de IFN-g e a resposta linfoproliferativa. A idade dos pacientes variou entre 3 e 42 anos (29 ± 8 anos) e o tempo de doença foi de 6 ± 4 anos, variando entre 1 a 14 anos. Não houve correlação entre idade e tempo de doença com resposta linfoproliferativa ou produção de IFN-g. A resposta linfoproliferativa em culturas de CMSP estimuladas com antígeno de C. albicans foi ausente ou diminuída em 8 dos 11 pacientes (IE = 6±8) (1239±861cpm). Altos níveis de incorporação de timidina foram observados nas culturas de CMSP em sete pacientes nos quais as células foram estimuladas com PWM (IE = 111±129) (29381± 8479cpm) (Tabela 1). A resposta linfoproliferativa específica para os antígenos de C. albicans, PPD e toxóide tetânico de 11 pacientes com candidiase recorrente está representada na Figura 1. Culturas de células mononucleares de pacientes com candidíase vaginal recorrente ou candidíase mucosa e cutânea de repetição apresentaram baixos níveis de incorporação de timidina quando estas foram estimuladas com antígeno de Candida albicans (IE = 6±8). Níveis significativamente mais elevados foram observados quando PPD (IE = 17±20) ou TT (IE = 65±30) foram utilizados como estímulo nas culturas destes pacientes caracterizando uma imunossupressão específica para o antígeno de C. albicans.

Com a finalidade de verificar se a baixa resposta linfoprolifefrativa estava relacionada com uma predominância de resposta tipo 2 ao antígeno de C. albicans, anticorpos monoclonais anti-IL-4 ou anti-IL-10 foram adicionados a algumas culturas de células estimuladas com antígeno de C. albicans de 4 pacientes. A resposta linfoproliferativa, representada pelo índice de estimulação, ao antígeno de C. albicans (IE = 4,8 ±5) aumentou significativamente após a adição de anticorpo monoclonal anti-IL-10 (IE = 21±11). A adição de anticorpo monoclonal anti-IL-4 não restaurou significativamente a reposta linfoproliferativa de culturas estimuladas com antígeno de C. albicans (IE = 8,5 ± 9) (Figura 2). A adição isolada de isotipos controles não induziu proliferação linfocitária.

A resposta imune celular tipo Th1 foi avaliada através da dosagem de IFN-g. Na Figura 3 estão expressos os níveis de proliferação linfocitária em 11 pacientes e os níveis de IFN-g encontrados nos sobrenadantes de culturas estimuladas com antígeno de C. albicans em 17 pacientes. Em adição à baixa resposta linfoproliferativa, baixa produção de IFN-g foi encontrada em 15 dos 17 pacientes estudados (42 ± 67pg/ml). Apenas dois pacientes apresentaram elevada produção de IFN-g (1132 e 997pg/ml, respectivamente) em resposta ao antígeno de C. albicans.

DISCUSSÃO

Estudos a respeito do perfil imunológico da candidíase mucocutânea evidenciam uma inabilidade de ativação da resposta imune celular, com baixa produção de IFN-g e de IL-2, e incapacidade de linfoproliferação, o que impossibilita a eliminação deste patógeno¹³. Estudos contraditórios têm sido reportados sobre a imunopatogênese da candidíase vaginal recorrente. Enquanto alguns estudos apontam uma atividade linfoproliferativa reduzida com ausência de hipersensibilidade ao teste intradérmico em pacientes com candidíase vaginal recorrente^{7 9}, outros relataram a existência de uma resposta do tipo Th1 com produção de IL-2 e IFN-g⁴. O principal achado do presente estudo foi a constatação de uma imunodeficiência celular específica para o antígeno de C. albicans encontrada em pacientes com candidíase cutânea, candidíase mucosa, e candidíase vaginal recorrente, e que esta alteração da resposta imune pode ser restaurada pela neutralização da IL-10. A ausência de resposta linfoproliferativa e produção de IFN-g é antígeno-específica desde que uma resposta normal foi documentada quando as células foram estimuladas com antígenos não relacionados (PPD e TT). Depressão da resposta imune foi observada no único paciente com candidíase cutânea, nos três pacientes com candidíase mucosa e na maioria das pacientes com candidíase vaginal recorrente. Não pode ser afastada que nestes pacientes com evidências de resposta imune no sangue periférico a nível local exista uma alteração da resposta imune. Compartimentalização da resposta imune celular e humoral têm sido reportada em outras doenças infecciosas^{2 18}. Desde que esta imunodeficiência é periférica, pois foi restaurada com a neutralização da IL-10, é possível que a persistência do agente infeccioso contribua para a perpetuação da anormalidade imunológica.

Os mecanismos de defesa do hospedeiro contra C. albicans estão representados pela atividade microbicida de fagócitos e pela citotoxicidade celular mediada por células NK^{8 17}. Embora fagócitos e células NK sejam componentes da resposta imune inespecífica ou inata, a atividade plena destas células é dependente da resposta imune adaptativa, desde que IL-2 e IFN-g, produzidos pelas células CD4+ Th1 e células CD8+, ativam células NK e o IFN-g ativa os fagócitos¹⁶. A IL-10 é uma citocina moduladora da resposta tipo 1⁵ e a IL-2 é a principal citocina indutora de proliferação celular. Através da neutralização in vitro de IL-10, a resposta linfoproliferativa foi restaurada em sobrenadantes de cultura de células de 4 pacientes estudados, evidenciando o papel desta citocina em suprimir a proliferação linfocitária em pacientes com candidíase recorrente. O papel da IL-10 em suprimir a resposta imune tipo 1 tem sido observado em outras doenças infecciosas como a leishmaniose visceral e a esquistossomose^{1 3}. Além disso, níveis baixos ou ausentes de IFN-g em resposta ao antígeno de C. albicans confirmam a ausência de resposta do tipo 1.

A documentação de que pacientes com candidíase recorrente apresentam uma baixa resposta imune celular para antígenos de C. albicans, contribui não só para o entendimento da patogênese da candidíase recorrente como abre perspectivas para a utilização de agentes imunomoduladores com a finalidade de restaurar a reposta imune destes pacientes.

AGRADECIMENTOS

Agradecemos ao Dr. Robert L. Coffman (DNAX Institute, Palo Alto, CA) por nos ter cedido os anticorpos monoclonais anti-IL-4 e anti-IL-10, a Elbe M. Silva pela revisão do texto e a Lúcia Reis e Jackson Lemos pelo apoio administrativo.

Recebido para publicação em 15/4/2002

Aceito em 8/8/2003

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  22 Out 2003
• Data do Fascículo
  Out 2003

Histórico

• Aceito
  08 Ago 2003
• Recebido
  15 Abr 2002