Alterações nos níveis de colesterol, triglicerídeo e fosfolipídeo total em plasma de Callithrix jacchus (sagüi) reinfectado por Schistosoma mansoni

Alterations in cholesterol, triglyceride and total phospholipid levels in plasma of Callithrix jacchus (sagüi) reinfected by Schistosoma mansoni

ARTIGO ARTICLE

Alterações nos níveis de colesterol, triglicerídeo e fosfolipídeo total em plasma de Callithrix jacchus (sagüi) reinfectado por Schistosoma mansoni

Alterations in cholesterol, triglyceride and total phospholipid levels in plasma of Callithrix jacchus (sagüi) reinfected by Schistosoma mansoni

Thadzia Maria de Brito Ramos; Amanda Soares de Vasconcelos; Vera Cristina Oliveira de Carvalho; Vera Lúcia de Menezes Lima

Laboratório de Química e Metabolismo de Lipídeos e Lipoproteínas do Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Pernambuco, Recife, PE

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

Pouco se conhece a cerca de alterações nos lipídeos plasmáticos devido à reinfecção por Schistosoma mansoni. Neste trabalho, foram avaliadas alterações nos lipídeos plasmáticos decorrentes de uma reinfecção por Schistosoma mansoni no primata não humano Callithrix jacchus (sagüi). Amostras de sangue dos animais, antes e após serem infectados e reinfectados, foram coletadas por punção venosa, anticoaguladas com EDTA (1mg/mL) e centrifugadas a 2.500xg para obtenção do plasma. Os níveis plasmáticos de colesterol total, colesterol éster, fosfolipídeo total e triglicerídeo foram determinados por métodos espectrofotométricos. Os resultados mostraram haver redução significativa nas concentrações de colesterol total, colesterol esterificado, triglicerídeo e fosfolipídeo total em plasma de animais reinfectados por Schistosoma mansoni, em comparação com os mesmos animais antes da infecção e após uma infecção. Este estudo mostra que uma segunda infecção por Schistosoma mansoni causa alterações lipídicas plasmáticas significativamente mais acentuadas que as decorrentes de uma única infecção.

Palavras-chaves:Callithrix jacchus. Schistosoma mansoni. Reinfecção. Colesterol. Triglicerídeo.

ABSTRACT

Little information is available on the lipid changes caused by Schistosoma mansoni reinfection. In this work it was evaluated alteration in the plasma lipids due to one reinfection by Schistosoma mansoni in the non human primate Callithrix jacchus (sagüi). Blood samples from C. jacchus, prior and after 60 days infection and reinfection, were collected by intravenous puncture, anticoagulated with EDTA (1mg/mL) and centrifuged at 2,500xg, in order to obtain the plasma. Total cholesterol, cholesteryl ester, total phospholipid and triglyceride levels were determined by spectrophotometer methods. The results showed that there are significant reduction in cholesterol total, cholesteryl ester, total phospholipid and triglyceride concentrations in plasma of animals reinfected by Schistosoma mansoni, in comparison to the same animals prior and after one infection. This study showed that a second infection of Callithrix jacchus by Schistosoma mansoni causes plasma lipid alterations, which are more significant than after a single infection.

Key-words:Callithrix jacchus. Schistosoma mansoni. Reinfection. Cholesterol. Triglycerides.

A esquistossomose é uma das maiores causas de morbidade e mortalidade no mundo⁵, atingindo milhões de pessoas em países da África e América Latina. No Nordeste do Brasil, a doença é endêmica, atingindo áreas rurais e urbanas, bem como, tem sido constituindo novos focos de transmissão também em localidades de veraneio³. As falhas na erradicação do molusco vetor²⁹, a inexistência de vacina para a prevenção da doença, além da recente resistência desenvolvida pelo parasita frente às drogas anti-esquistossomóticas¹⁶ constituem algumas das dificuldades para o controle da doença, que vem permanecendo, ainda, como um importante problema médico-social².

A parasitemia humana causada pelo Schistosoma mansoni representa um ciclo contínuo de tratamento seguido de reinfecção. A morbidade da esquistossomose mansônica depende da intensidade da infecção, resposta imune, reação granulomatosa e conseqüente fibrose em torno dos ovos de Schistosoma mansoni depositados no tecido do hospedeiro²³. Os danos teciduais afetam órgão vitais como o intestino e o fígado, podendo alterar processos metabólicos e afetar as condições físicas do hospedeiro²². A esquistossomose na forma hepatoesplênica pode vir associada a varizes hemorrágicas do esôfago, hiperesplenismo e hipoevolutismo (em adolescentes), podendo a evolução clínica desses pacientes apresentar-se comprometida por carga parasitária residual ou reinfecção⁶.

Estudos anteriores em humanos portadores de esquistossomose mansônica na forma hepatoesplênica demonstram a ocorrência de alterações no metabolismo lipídico associadas à esquistossomose mansônica, na qual a concentração plasmática de colesterol total encontra-se diminuída, bem como os níveis de fosfolipídeo e triglicerídeo¹¹, além da fração esterificada do colesterol⁷. A utilização de um modelo animal no qual a deslipidemia, causada unicamente pela esquistossomose mansônica, possa ser estudada sem associação com desnutrição ou outras parasitoses comumente encontradas em humanos portadores de esquistossomose mansônica é de extrema importância para um melhor conhecimento da fisiopatologia da doença. Atualmente, primatas não-humanos vêm sendo usados para diversos estudos¹ inclusive aqueles envolvendo a migração de S. mansoni pelo hospedeiro definitivo³¹. Trabalhos publicados anteriormente demonstram que o Callithrix jacchus (sagüi), primata do novo mundo, animal de pequeno porte e comumente encontrado na América do Sul, apresenta a composição lipídica e das proteínas plasmáticas bastante similares àquelas encontradas em plasma de humanos²⁰. No presente trabalho foram avaliados os efeitos da reinfecção pelo parasita S. mansoni sobre os lipídeos plasmáticos de Callithrix jacchus.

MATERIAL E MÉTODOS

Animais. No presente estudo foram utilizados 11 Callithrix jacchus, machos adultos, pesando 300 a 400g. Os animais foram cedidos pelo Instituto Brasileiro do Meio Ambiente (IBAMA) e eram aqueles apreendidos em feiras publicas que não podiam ser re-introduzidos ao seu ambiente natural. Os animais foram mantidos no biotério do Departamento de Bioquímica da UFPE, onde permaneceram em quarentena antes do uso, sob condições adequadas de higiene e dieta⁸. A presença de parasitas nas fezes e no sangue dos animais foi investigada e foram utilizados apenas animais saudáveis, livres de qualquer parasitose detectada.

Infecção. Os animais foram percutaneamente infectados²⁶ com cerca de 400 cercárias de Schistosoma mansoni, ficando expostos à luz (35ºC) por aproximadamente 35min para a penetração das mesmas, sob anestesia com cloridrato de cetamina – Ketalar (Parke Davis Ache/São Paulo Brasil) na concentração de 15mg/kg de peso corpóreo.

Re-infecção. 60 dias após a infecção os animais foram novamente anestesiados com Ketalar (15mg/kg) e submetidos a uma segunda infecção percutânea com aproximadamente 400 cercárias de S. mansoni, nas condições de temperatura e luminosidade acima descritas.

Obtenção do plasma. Amostras de sangue de animais, em jejum de 12h, foram coletadas antes (grupo controle), após 60 dias da primeira (grupo infectado), e após 60 dias da segunda infecções (grupo reinfectado), em animais anestesiados, por punção da veia femoral. As amostras foram anticoaguladas com EDTA (1mg/mL) e centrifugadas a 2.500xg, a 4ºC, durante 15min, para a obtenção dos plasmas.

Extração, isolamento e determinação dos níveis de lipídeos plasmáticos. Os lipídeos plasmáticos foram extraídos com clorofórmio:metanol 2:1 (v/v) de acordo com o método de Folch¹⁰. O isolamento dos lipídeos neutros foi realizado por cromatografia em camada fina²¹, sendo em seguida removidos da sílica e processados como descrito em trabalho anterior¹¹. A determinação dos níveis de colesterol total, e esterificado no plasma de C. jacchus controles, infectados e reinfectados foi realizada segundo o método de Leffler¹⁷. A concentração de fosfolipídeo total foi determinada de acordo com o método de Bartlett⁴ e a análise de triglicerídeo foi realizada através de método enzimático/colorimétrico utilizando kit comercial Labtest Diagnóstica (Minas Gerais, Brasil).

Tratamento estatístico dos resultados. Os resultados representam a média dos valores encontrados ± o desvio padrão. A significância das diferenças entre os grupos de animais controles, infectados e reinfectados foi determinada pelo teste "t" de Student para análises dependentes, utilizando o software STATISTICA for Windows (StatSoft, Inc, 1999 – Tulsa, USA). Diferenças significativas entre os grupos foram estabelecidas considerando p < 0,05.

RESULTADOS

Os níveis de colesterol total, triglicerídeos e fosfolipídio total em plasma de C. jacchus após 60 dias da primeira infecção por S. mansoni foram significativamente reduzidos (p = 0,005; p = 0,000048; p = 0,000042, respectivamente) em relação aos animais controles, ou seja, antes da primeira infecção. Essa redução foi ainda mais significativa quando os animais foram submetidos a uma segunda infecção pelo parasita S. mansoni, tanto para a concentração de colesterol total (p = 0,0005), quanto para a de triglicerídeos (p = 0,000007) e de fosfolipídio total (p = 0,000000), se comparados aos animais controle, conforme demonstrado na Tabela 1.

Embora os níveis de colesterol total e fosfolipídio total tenham sido reduzidos a relação molar colesterol total/fosfolipídio total foi significativamente aumentada (p = 0,000802) em plasma de sagüis infectados em relação aos animais controles, tendo sido este aumento mais significativo após a reinfecção (p = 0,000324) quando comparado aos animais controle, como demonstrado na Tabela 1.

A percentagem de colesterol esterificado foi significativamente reduzida (p = 0,000128) em plasma de sagüis infectados por Schistosoma mansoni, quando comparados aos animais controles; após a reinfecção esta redução em relação aos animais controle foi ainda mais significativa (p = 0,000007), como demonstrado na Figura 1.

Na Tabela 1, podemos observar, também, que em comparação aos resultados obtidos para os lipídeos plasmáticos de animais submetidos à primeira infecção, a segunda infecção promoveu reduções significativas nos níveis de colesterol total (p = 0,040831), triglicerídeo (p = 0,001719) e fosfolipídio total (p = 0,000523), bem como na percentagem de colesterol esterificado (p = 0,00041) demonstrada na Figura 1. A relação molar colesterol total/fosfolipídio total (Tabela 1) foi significativamente aumentada (p = 0,007375) no plasma de sagüis submetidos à segunda infecção por S. mansoni, quando comparada aos valores obtidos para a primeira infecção (Tabela 1).

DISCUSSÃO

Em trabalhos anteriores foi demonstrado que o C. jacchus apresenta similaridade ao homem no que diz respeito à composição dos lipídeos e lipoproteínas plasmáticas²⁰, e que o fígado deste primata está histopatologicamente suscetível a infecção por Schistosoma mansoni²⁶.

A redução nos valores encontrados, no presente trabalho, para os níveis de triglicerídeo, colesterol e fosfolipídio total (Tabela 1 e Figura 1) após 60 dias de infecção de C. jacchus por S. mansoni foram similares aos reportados anteriormente por Lima et al²⁰. No plasma de C. jacchus saudável o nível de colesterol total e a concentração relativa de colesterol esterificado reportadas por Lima et al²⁰ foram 2,79 ± 0,79mmol/L e 73,8 ± 0,23%, respectivamente, porém, quando infectados por cercarias de S. mansoni o colesterol total e a percentagem de colesterol esterificado sofreram reduções significativas para 2,35 ± 0,32mmol/L e 65,9 ± 3,9%, respectivamente. Em humanos portadores de esquistossomose mansônica⁷ a redução do colesterol foi associada à gravidade da doença, sendo mais suave na esquistossomose hepatoesplênica compensada do que na forma hepatoesplênica descompensada¹³. Estudos realizados tanto em humanos^{27 18} quanto experimentalmente em roedores^{24 28} sugerem que o decréscimo na fração esterificada do colesterol está relacionado à diminuição na atividade de enzimas de origem hepática. Por exemplo, a lecitina: colesterol aciltransferase (LCAT, EC 2.3.1.43) plasmática, sintetizada pelos hepatócitos¹⁹ e secretada na circulação, atua catalizando a esterificação do colesterol na superfície da lipoproteína de alta densidade (HDL)¹⁵ plasmática, promovendo o efluxo de colesterol dos tecidos periféricos⁹, enquanto a acil CoA colesterol aciltransferase (ACAT, EC 2.3.1.26) é responsável pela esterificação de colesterol no fígado. Portanto, futuros estudos são necessários para avaliar se a redução nos níveis de colesterol esterificado plasmático de C. jacchus é decorrente de anormalidade na atividade, na síntese ou na secreção da LCAT e/ou da ACAT produzidas pelo fígado doente dos animais reinfectados.

Os lipídeos neutros e fosfolipídeos são transportados na circulação pelas lipoproteínas, as quais em contato com membranas celulares trocam lipídeos entre si²⁵. Neste trabalho, o aumento significativo na relação molar colesterol total/fosfolipídio total em Callithrix jacchus infectados e reinfectados parece estar mais relacionado ao decréscimo nos níveis de fosfolipídeos plasmáticos desses animais, do que ao do colesterol total. Alterações na composição dos lipídeos circulantes podem promover mudanças na composição dos lipídeos de membranas. Modificação na composição lipídica de membrana celular pode levar a alteração na função celular como demonstrado em trabalhos anteriores¹⁴. Em experimentos realizados com macaco foi demonstrado que alteração nos fosfolipídeos de HDL modifica o tipo de éster de colesterol formado no plasma afetando a quantidade plasmática de colesterol esterificado³⁰. Variação na relação molar colesterol total/fosfolipídio total foi reportadas na literatura para pacientes portadores de esquistossomose hepatoesplênica¹¹.

Em relação à primeira infecção, as diminuições significativas observadas nos níveis dos lipídeos plasmáticos de animais reinfectados implicam em um efeito cumulativo sobre o metabolismo lipídico de C. jacchus promovido pela reinfecção parasitária pelo S. mansoni. Alterações significativas nos lipídeos circulantes decorrentes apenas de reinfecção por S. mansoni podem estar associadas a mudanças na fluidez de membranas plasmáticas e/ou na função celular contribuindo para a patologia da doença. Imai e Owen¹⁴ demonstraram, experimentalmente, in vitro, que a função celular era alterada quando a composição lipídica da membrana celular estava modificada. Portanto, os achados deste estudo são importantes para o conhecimento da fisiopatologia da esquistossomose mansônica com relação às alterações no metabolismo lipídico em primata^{7 12 20}. Este trabalho também reforça a proposta de utilização de C. jacchus em pesquisas que promovam maior conhecimento sobre a fisiopatologia causada por infecções sucessivas pelo S. mansoni, tendo como alvo avaliação do metabolismo lipídico associado, por exemplo, à análise da eficácia de novas drogas anti-esquistossomóticas, vacinas e desenvolvimento de novos testes para diagnósticos laboratoriais da doença, haja vista que este primata apresenta base bioquímica segura para estudos envolvendo alterações no metabolismo lipídico na esquistossomose experimental.

AGRADECIMENTOS

Agradecemos à Dra. Geni Vilela da Silva Carvalho (IBAMA) pela disponibilização dos animais, à Dra. Silvia Montenegro Chefe do Departamento de Imunologia - CPqAM/FIOCRUZ por ter cedido as cercárias de S. mansoni pra infecção de C. jacchus, e ao CNPq, FACEPE, BNB e CAPES pelo suporte financeiro.

Recebido para publicação em 13/8/2002

Aceito em 13/11/2003

Apoio Financeiro: CNPq, FACEPE, BNB e CAPES

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  19 Mar 2004
• Data do Fascículo
  Fev 2004

Histórico

• Recebido
  13 Ago 2002
• Aceito
  13 Nov 2003