Atividade larvicida de taninos isolados de Magonia pubescens St. Hil. (Sapindaceae) sobre Aedes aegypti (Diptera, Culicidae)

Larvicidal activity of tannins isolated of Magonia pubescens St. Hil. (Sapindaceae) against Aedes aegypti (Diptera, Culicidae)

ARTIGO ARTICLE

Atividade larvicida de taninos isolados de Magonia pubescens St. Hil. (Sapindaceae) sobre Aedes aegypti (Diptera, Culicidae)

Larvicidal activity of tannins isolated of Magonia pubescens St. Hil. (Sapindaceae) against Aedes aegypti (Diptera, Culicidae)

Heloísa Helena Garcia da Silva^I; Ionizete Garcia da Silva^I; Regina Maria Geris dos Santos^II; Edson Rodrigues Filho^II; Carmeci Natalina Elias^I

^ILaboratório de Biologia e Fisiologia de Insetos e Xenodiagnóstico do Instituto de Patologia Tropical e Saúde Pública da Universidade Federal de Goiás, Goiânia, GO

^IIDepartamento de Química da Universidade Federal de São Carlos, São Carlos, SP

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

Apresenta-se, pela primeira vez, o estudo fitoquímico das frações larvicidas, isoladas da Magonia pubescens, monitorado pelo estudo de eficácia sobre larvas de 3º estádio de Aedes aegypti, na busca de alternativas para o controle desse mosquito e obtenção de estruturas químicas passíveis de aprimoramento da atividade pela via sintética de outros derivados. As frações bioativas foram monitoradas quimicamente através de cromatografia de camada delgada, utilizando como revelador uma solução ácida de vanilina, e analisadas por ressonância magnética nuclear de hidrogênio e espectrometria de massas. Os bioensaios com as frações foram realizados em quintuplicata, à temperatura de 28±1ºC, 80±5% de umidade relativa e fotofase de 12 horas. As concentrações letais encontradas da fração MP-9, que apresentou o maior potencial larvicida, CL₅₀ e CL₉₀, foram de 3,1 e 36,6ppm, respectivamente. Todos os experimentos foram acompanhados por uma série controle, contendo o mesmo número de larvas.

Palavras-chaves: Taninos. Larvicida. Magonia pubescens. Aedes aegypti.

ABSTRACT

Phytochemical study of the larvicidal fractions wich were carried out for the first time, isolated of the Magonia pubescens, monitored by the study of efficacy against the 3^rd larval instar of Aedes aegypti, in the search of alternatives for the control of that mosquito and to obtain structures susceptible to chemical improving of the activity for the synthetic via of other deriveds. The fractions with biological activity were monitored chemically through chromatography of thin layer, using as revealing a solution acid of vanillin, analyzed by nuclear magnetic resonance of hydrogen and spectrometry of masses. The bioassays with the fractions were accomplished wit five replications, controlled at the temperature of 28±1ºC, 80±5% of relative humidity and 12 h light. The found lethal concentrations of the fraction that it presented the largest potential larvicidal, MP-9, LC₅₀ and LC₉₀, were of 3,1 and 36,6ppm, respectively. All the experiments were accompanied by a control series, containing the same number of larvae.

Key-words: Tannins. Larvicidal. Magonia pubescens. Aedes aegypti.

Aedes aegypti (Lin,1762) é atualmente o mosquito que apresenta a maior dispersão em áreas urbanas no mundo. A importância médica dessa espécie está na sua capacidade vetorial dos quatro sorotipos do vírus da dengue e do vírus amarílico. As altas densidades estão relacionadas ao comportamento sinantrópico e ao hábito antropofílico dessa espécie. Além disso, sua atividade hematofágica diurna e a complexidade dos centros urbanos têm maximizado os problemas do combate por aplicações espaciais de inseticidas²⁷. Contudo, a perspectiva de controle desse vetor, na atualidade, esbarra na sua grande capacidade adaptativa a condições adversas, como o desenvolvimento em águas poluídas²⁶, e a quiescência dos ovos em ambientes inóspitos²⁴.

Uma das estratégias para combater a dengue é a eliminação do vetor através de produtos inseticidas. Como conseqüência do uso continuado desses produtos surgiram as populações resistentes^{3 13} de A. aegypti. Além disso, efeitos indesejáveis desses inseticidas como a permanência por longos períodos de tempo no meio ambiente, afetando os ecossistemas, estimularam a pesquisa de produtos naturais. Alguns estudos apontam compostos de origem botânica com atividade larvicida e potencial para uso no controle^{5 7 10 15 16 19 23 28 29 33} de vetores.

A Magonia pubescens St. Hil. (Sapindaceae) é uma planta característica do Cerrado brasileiro^{11 12}, apresenta grande densidade em áreas de terreno fraco e tem sido aproveitada na construção civil.

Estudos anteriores com extratos brutos etanólicos da M. pubescens mostraram atividade larvicida para A. aegypti e A. albopictus. Mesmo sabendo que as plantas constituem uma fonte incomparável de compostos químicos inovadores, trabalhos envolvendo atividade biológica ou toxicológica de princípios ativos puros^{18 23 33} são em números inexpressivos, sendo a maioria das publicações referentes à atividade de extratos brutos^{7 9 10 28 29 32} ou frações^{6 15 28 31}. Na bibliografia pertinente, não foram encontrados registros envolvendo os estudos sobre os componentes químicos da M. pubescens. Como existe atualmente uma exigência de que produtos de origem natural sejam quimicamente estudados⁴, para evidenciar sua eficácia e segurança de seu uso, este trabalho apresenta pela primeira vez, o estudo fitoquímico da M. pubescens, monitorado pelo estudo de eficácia sobre larvas de A. aegypti, na busca de alternativas para o controle desse mosquito e obtenção de estruturas químicas passíveis de aprimoramento da atividade pela via sintética de outros derivados.

MATERIAL E MÉTODOS

Material vegetal. As cascas do caule de M. pubescens foram coletadas na região de Alto Paraíso – Chapada dos Veadeiros – Goiás, no mês de novembro de 2001, e trazidas ao Laboratório de Bioatividade de Plantas, IPTSP/UFG.

Extração e fracionamento. As cascas foram secas em estufa de ventilação forçada, a 40ºC, e moídas até baixa granulometria. Em seguida, 1,4kg do pó foi extraído por percolação com etanol (72 horas), por duas vezes consecutivas, à temperatura ambiente, e o extrato bruto foi filtrado e concentrado em evaporador rotativo (60,2g). Após os resultados de atividade larvicida do extrato bruto etanólico (e.b.e.)^{28 30}, sobre A. aegypti, cerca de 51,2g deste material foi submetido à cromatografia em coluna utilizando como fase móvel os solventes n-hexano, diclorometano e metanol, seguindo a técnica de gradiente de polaridade. Foram obtidas nove frações, as quais foram codificadas como MP-1 a MP-9.

Bioensaios. Para a detecção da atividade larvicida nas frações foram utilizadas larvas de 3º estádio de A. aegypti, criadas de acordo com metodologia já definida²⁵. Uma solução-mãe foi preparada com uma determinada quantidade da fração de interesse, pré-solubilizada em dimetilsulfóxido (DMSO) e dissolvida em água, numa quantidade suficiente para obter a concentração de 1000ppm. A partir desta solução, a série de diluições foi preparada para obter soluções de concentrações desejadas. Em 25mL de cada uma dessas soluções foram adicionadas 20 larvas. Os bioensaios foram realizados em quintuplicata, a 28±1ºC, 80±5% de umidade relativa e fotofase de 12h. Todos os experimentos foram acompanhados de uma série controle, contendo o mesmo número de larvas em DMSO e água destilada. Os dados obtidos da mortalidade x concentração (ppm) foram analisados pelo programa SAEG (Sistema de Análises estatísticas), em gráfico de Probit, para determinar as concentrações letais (CL_{50 e 90}) e os respectivos intervalos de confiança.

Análise das frações bioativas. As frações bioativas foram monitoradas quimicamente através de cromatografia de camada delgada (CCD), utilizando como revelador uma solução ácida de vanilina. Além disso, essas amostras foram analisadas por ressonância magnética nuclear de hidrogênio (RMN ¹H) em um espectrômetro Bruker ARX-200, utilizando como solvente clorofórmio deuterado (CDCl₃) ou metanol deuterado (CD₃OD), e tetrametilsilano (TMS) como padrão interno de referência. A análise das frações por espectrometria de massas foi realizada em um espectrômetro QuattroLC – Micromass, utilizando como fonte de ionização ESI/APCI nos modos negativo e positivo.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Das nove frações obtidas a partir do e.b.e. da M. pubescens apenas as frações MP-7, MP-8 e MP-9 apresentaram atividade tóxica sobre larvas de 3º estádio de A. aegypti (Tabela 1). Com a partição dos extratos e separação cromatográfica foi possível obter concentrações letais extremamente baixas em relação aos estudos anteriormente feitos com o e.b.e.²⁸. Contudo, este apresentou a vantagem de ser hidrossolúvel, simplificando o preparo da solução para uso.

Estudos que já evidenciaram potencialidade de uso de frações botânicas para o controle de A. aegypti, apontam CL₅₀ variando de 0,1 a 49ppm ^{16 23 31 33}, o que permite considerar que a MP-9 apresentou resultado coerente com a literatura.

As análises por CCD das frações MP-7 (diclorometano:metanol, 6:4), MP-8 (diclorometano:metanol, 4:6) e MP-9 (metanol) revelaram manchas avermelhadas após revelação com a vanilina, sugerindo a presença de derivados fenólicos, mais precisamente, taninos. A formação de coloração vermelha, resultante da complexação do agente revelador vanilina com os taninos, é um método fácil e rápido para diagnosticar a presença dessas substâncias em extratos e frações, embora ainda não conclusivo para a identificação da classe a qual os taninos pertencem²².

Adicionalmente, essas frações também foram submetidas a análises de prospecção para definir a classe de taninos¹⁴ presentes, utilizando-se a solução de cloreto férrico. Na presença dessa solução, os taninos hidrolisáveis produzem uma forte coloração azul, enquanto que os taninos condensados ou catéquicos exibem uma forte coloração verde³⁴. Nossos testes químicos indicaram a presença de taninos catéquicos na fração MP-9. Os dados de RMN para essa fração corroboraram os testes químicos. Os espectros de RMN ¹H para MP-9 contêm vários multipletos com deslocamentos químicos para hidrogênios aromáticos entre 6,00 e 8,00ppm, os quais caracterizam os grupos catequinas nestes taninos. Neste mesmo espectro foram também observados sinais para uma série de hidrogênios carbinólicos (d 3,00 a 4,50) correspondendo a hidrogênios H-2 e H-3, bem como a hidrogênios de unidades de carboidratos indicando que parte das catequinas podem estar ocorrendo na forma de glicosídeos. Os espectros de massas obtidos por electrospray nos modos positivos e negativos, mostraram que a fração MP-9 é composta de uma mistura bastante complexa de substâncias. No entanto, uma das substâncias apresentou [M+H]⁺ a m/z 865 e [M-H]^- a m/z 863. Assim, a partir das análises por espectrometria de massas, uma das substâncias pode ser identificada como uma proantocianidina na forma trimérica (massa molecular = 864Da). A estrutura molecular para essa substância, que foi a fração mais promissora da M. pubescens, é mostrada na Figura 1.

As proantocianidinas são largamente distribuídas na natureza, em plantas altas, particularmente coníferas, e são também encontradas em muitos produtos alimentícios⁸ como chás, cacau e sorgo.

Taninos são substâncias fenólicas, solúveis em água, com massa molecular entre 500 e 3000Da. Muitas vezes, são os princípios ativos de plantas empregadas na medicina tradicional para o tratamento de diversas moléstias orgânicas, por apresentarem atividades biológicas como a ação bactericida²¹, fungicida, moluscicida e inibição enzimática³⁴. Os taninos condensados são oligômeros e polímeros formados pela policondensação de duas ou mais unidades flavanoídicas e possuem grande importância biológica por suas fortes interações com íons metálicos e macromoléculas como os polissacarídeos, além de apresentar a habilidade para formar complexos solúveis³⁴ com alcalóides, gelatinas e diversas proteínas. Essa habilidade que os taninos exibem para interagir com proteínas torna essa classe de substâncias bastante tóxica³⁴ a insetos, fungos e bactérias.

Estudos realizados²⁰ através de cortes histológicos, mostraram o efeito tóxico do ácido tânico, um tanino natural hidrolisável, sobre o epitélio do intestino médio de larvas de dípteros. Outros autores¹⁷, após avaliarem os efeitos tóxicos de taninos sobre a fauna associada aos culicíneos, sugeriram que os taninos vegetais podem ser úteis como complemento em programas de controle de espécies de mosquitos associados à atividade humana. Mais especificamente sobre a M. pubescens e anteriores à partição, fracionamento e identificação do tanino catéquico, estudos^{1 2 28} foram realizados com o extrato, evidenciando os mecanismos de ação e as alterações morfológicas que provocaram as mortes nas larvas de A. aegypti, sendo similares àquelas registradas pelo ácido tânico²⁸. Além disso, estudos toxicológicos²⁸ do e.b.e. realizados em coelhos, ratos e cobaios mostraram-se atóxicos de acordo com as normas para produtos vegetais. Testes de campo evidenciaram sua degradação e atoxicidade a partir da quarta semana²⁸. Mesmo com essas informações favoráveis, estudos toxicológicos adicionais com o tanino catéquico serão feitos para avaliar seu impacto, principalmente em espécies não alvo, e de formulações que dêem estabilidade e praticidade no uso desse fitoinseticida potencial.

Recebido para publicação em 31/5/2004

Aceito em 11/6/2004

Apoio Financeiro: CNPq, FAPESP, CAPES, OPAS, FUNAPE

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  03 Set 2004
• Data do Fascículo
  Out 2004

Histórico

• Aceito
  11 Jun 2004
• Recebido
  31 Maio 2004