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Padronização da técnica imunoenzimática do ELISA de captura, no sistema avidina-biotina para a identificação de sangue ingerido por Lutzomyia (Lutzomyia) longipalpis (Lutz & Neiva, 1912)

Enzyme-linked Immunosorbent Assay biotin/avidin method standardization, for identification of Lutzomyia (Lutzomyia) longipalpis bloodmeals (Lutz & Neiva, 1912)

Resumos

A identificação de sangue ingerido pelos insetos é um importante parâmetro para elucidar aspectos ligados à transmissão de zoonoses, dentre elas, as leishmanioses. Dos métodos empregados para esclarecer a atração de vetores por animais que possam atuar como reservatórios dessas parasitoses, destacam-se os imunológicos. O estudo teve como objetivo, padronizar a técnica imunoenzimática de captura e titular amostras de sangue ingerido em fêmeas de flebotomíneos ingurgitadas de Lutzomyia longipalpis criadas em laboratório e alimentadas experimentalmente em rato. Em vista da alta sensibilidade, favorecida pelo sistema avidina-biotina, foi possível a realização de pelo menos noventa testes, de cada uma das amostras em duplicata, e constatar a presença de sangue para todas as amostras com períodos de 12 e 24 horas pós-ingestão, observando-se diferença significativa entre os respectivos títulos.

Identificação de sangue ingerido; Lutzomyia longipalpis; Flebotomíneos; Técnica imunoenzimática de captura; Vetores


Bloodmeals taken by insects constitute an important parameter for clarifying aspects of the transmission of zoonoses, including leishmaniases. Immunological assays can be used to investigate the attraction of vectors to animals, which may be hosts of these parasitoses. The objective of this study was to standardize a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay and titer samples with different time periods of digestion, in laboratory-bred Lutzomyia longipalpis fed on rats. In the light of the high sensitivity that the biotin-avidin method permits, the technique provided at least ninety repeat tests for each sample and identified recent bloodmeals taken by these insects. Bloodmeals were detectable up to 12 and 24h after blood ingestion, and a significant difference between these titers was observed.

Blood meal identification; Lutzomyia longipalpis; Phlebotominae; Sandwich enzyme-linked immunosorbent assay; Vectors


ARTIGO ARTICLE

Padronização da técnica imunoenzimática do ELISA de captura, no sistema avidina-biotina para a identificação de sangue ingerido por Lutzomyia (Lutzomyia) longipalpis (Lutz & Neiva, 1912)

Enzyme-linked Immunosorbent Assay biotin/avidin method standardization, for identification of Lutzomyia (Lutzomyia) longipalpis bloodmeals (Lutz & Neiva, 1912)

Ana Maria MarassáI; Cleide Aschenbrenner ConsalesII; Eunice Aparecida Bianchi GalatiIII

IInstituto Adolfo Lutz, São Paulo, SP

IIInstituto Pasteur, São Paulo, SP

IIIDepartamento de Epidemiologia da Faculdade de Saúde Pública da Universidade de São Paulo, São Paulo, SP

Endereço para correspondência Endereço para correspondência Dra. Ana Maria Marassá Laboratório de Parasitoses Sistêmicas. Instituto Adolfo Lutz Av. Dr. Arnaldo 355 01246-902 São Paulo, SP Tel: 11 3068-2891

RESUMO

A identificação de sangue ingerido pelos insetos é um importante parâmetro para elucidar aspectos ligados à transmissão de zoonoses, dentre elas, as leishmanioses. Dos métodos empregados para esclarecer a atração de vetores por animais que possam atuar como reservatórios dessas parasitoses, destacam-se os imunológicos. O estudo teve como objetivo, padronizar a técnica imunoenzimática de captura e titular amostras de sangue ingerido em fêmeas de flebotomíneos ingurgitadas de Lutzomyia longipalpis criadas em laboratório e alimentadas experimentalmente em rato. Em vista da alta sensibilidade, favorecida pelo sistema avidina-biotina, foi possível a realização de pelo menos noventa testes, de cada uma das amostras em duplicata, e constatar a presença de sangue para todas as amostras com períodos de 12 e 24 horas pós-ingestão, observando-se diferença significativa entre os respectivos títulos.

Palavras-chaves: Identificação de sangue ingerido. Lutzomyia longipalpis. Flebotomíneos. Técnica imunoenzimática de captura. Vetores.

ABSTRACT

Bloodmeals taken by insects constitute an important parameter for clarifying aspects of the transmission of zoonoses, including leishmaniases. Immunological assays can be used to investigate the attraction of vectors to animals, which may be hosts of these parasitoses. The objective of this study was to standardize a sandwich enzyme-linked immunosorbent assay and titer samples with different time periods of digestion, in laboratory-bred Lutzomyia longipalpis fed on rats. In the light of the high sensitivity that the biotin-avidin method permits, the technique provided at least ninety repeat tests for each sample and identified recent bloodmeals taken by these insects. Bloodmeals were detectable up to 12 and 24h after blood ingestion, and a significant difference between these titers was observed.

Key-words: Blood meal identification. Lutzomyia longipalpis. Phlebotominae. Sandwich enzyme-linked immunosorbent assay. Vectors.

O padrão alimentar em flebotomíneos faz parte de um conjunto de informações necessárias para o entendimento e avaliação epidemiológica do comportamento de espécies em áreas de transmissão de leishmanioses. Pode ser considerado como indicador, em determinados ambientes, dos possíveis animais que estejam participando na manutenção do ciclo enzoótico, além de possibilitar a identificação do reservatório.

Diversas metodologias são empregadas na pesquisa de hábito alimentar de flebotomíneos e dentre elas, destacam-se observações visuais, capturas com isca humana, armadilhas contendo iscas animais, encontro em abrigos de animais silvestres e domésticos e técnicas imunológicas. Entretanto, a maioria dos estudos que objetivam a investigação do comportamento alimentar desses insetos, tem como enfoque a utilização de iscas animais3 6 7.

As técnicas imunológicas para detecção de sangue ingerido em artrópodes têm sido utilizadas desde os primórdios de 1900, quando King e Bull10, Rice e Barber17 adaptaram a técnica de precipitina para determinar a fonte alimentar em mosquitos e outros insetos.

A técnica imunoenzimática foi inicialmente desenvolvida para o diagnóstico de pacientes portadores de malária22, sendo posteriormente adaptada para o estudo do hábito alimentar de culicídeos2. Dessa maneira, diversas modalidades do método foram introduzidas, dependendo particularmente da concentração de sangue ingerido, contido nas amostras e das informações que se deseja obter no estudo13 18 19.

Diferentes autores empregaram a técnica imunoenzimática para o conhecimento de fonte alimentar em flebotomíneos5 12 24. Entretanto, com o estabelecimento da técnica imunoenzimática de captura, foi possível detectar nas amostras diluídas de diferentes espécies de vetores, a presença de sangue ingerido em pequenas concentrações, tais como, as encontradas em pequenos dípteros das famílias Ceratopogonidae e Psychodidae que ingerem, em média, 0,01 a 0,1 e 0,01 a 0,3mg de sangue, respectivamente, bem como evidenciar mais de um repasto efetuado em diferentes fontes alimentares20.

Quinnel e cols16, em estudos realizados no Estado do Pará, empregaram o teste imunoenzimático de captura20, para identificar o sangue ingerido em fêmeas de Lutzomyia longipalpis alimentadas em hospedeiros conhecidos, com o objetivo de verificar experimentalmente a preferência alimentar. Colmenares e cols4, também utilizando a mesma técnica, empregando o sistema peroxidase avidina-biotina, estudaram o comportamento alimentar de Phlebotomus perniciosus Newstead 1911, em quatro diferentes áreas geográficas na Espanha .

Neste estudo, a opção pelo teste imunoenzimático de captura utilizando o sistema fosfatase alcalina avidina-biotina justifica-se por: adicionar dados relativos à capacidade vetorial, devido a sua sensibilidade e especificidade, pois cada molécula de avidina apresenta quatro sítios de ligação com a biotina, sendo esta, uma vitamina que pode ser conjugada facilmente a moléculas de alto ou baixo peso molecular, sem que ocorra perda de sua atividade biológica e que, por sua vez, apresenta elevada interação com a avidina8; somente o sistema peroxidase avidina-biotina ter sido empregado na identificação de repasto sangüíneo de flebotomíneos4; permitir a identificação de sangue ingerido em amostras com diferentes períodos de pós-ingestão; - utilizar a enzima fosfatase alcalina, por ser mais estável em condições de armazenagem e em circunstâncias onde condições estéreis não possam ser mantidas25, permitir uma grande diluição15 e identificar a fonte alimentar não somente de flebotomíneos, como de outros vetores.

MATERIAL E MÉTODOS

Amostras. Para a padronização da técnica, foram utilizados sessenta exemplares de flebotomíneos da espécie Lu. longipalpis, procedentes de colônia do Instituto Evandro Chagas, Belém, Pará, criados no Laboratório de Entomologia do Departamento de Epidemiologia da Faculdade de Saúde Pública da Universidade de São Paulo (FSP/USP). As larvas foram mantidas em placas com fundo de gesso e receberam alimentação adequada ao ambiente laboratorial, constituída por macerado contendo fezes desidratadas de coelho, terra e alimento utilizado para peixes ornamentais (Alcon®, Brasil) até a fase de pupa. Após os adultos emergirem, foram separados trinta machos e trinta fêmeas, sendo estas, alimentadas em rato (Ratus ratus), e os machos em solução de H2O e açúcar a 10%. Os exemplares adultos foram mantidos em temperatura ambiente de 25°C ± 2°C.

Das fêmeas, foram retiradas a cabeça e genitália, sendo o tórax e abdome acondicionados em microtubos e conservados em freezer a -20°C, até o momento da dosagem, 5 a 6 meses após, tempo este semelhante ao utilizado por outros autores.

Preparo das amostras. O tórax e abdome dos exemplares foram macerados em 200µl de solução PBS-BSA (A7030, Sigma, USA) 0,1% e a seguir centrifugados a 12.000rpm, por 5 minutos e os sobrenadantes acondicionados a -20°C. Para o controle positivo do teste, foram coletados 10ml do sobrenadante de cada uma das trinta amostras de fêmeas ingurgitadas e a seguir acondicionados em freezer a -20°C.

Para o controle negativo do teste, foram coletados 10ml do sobrenadante de cada uma das trinta amostras de machos e acondicionados da mesma maneira que o controle positivo.

Padronização do teste. Microplacas de 96 cavidades (Nunc®, Maxisorp, Denmark) foram sensibilizadas com 50µl/cavidade de soro total anti-rato (R-5256, Sigma, USA) em duplicata, nas concentrações de 20µg/ml, 10µg/ml, 5µg/ml, 2,5µg/ml, 1,25µg/ml e 0,625µg/ml diluídas em PBS e incubadas a 4°C por 18 horas. Após este período, as placas foram lavadas com PBS-Tween20 (P-1379, Sigma, USA) por cinco vezes e os sítios livres, bloqueados com 200µl/cavidade de PBS-BSA 1%, por 3 horas à temperatura ambiente.

Após este período, e a cada etapa da reação, foram realizadas lavagens, como já mencionado, sendo a seguir adicionados 50µl/cavidade do tampão PBS-BSA 0,1% das trinta fêmeas ingurgitadas em duplicata nas diluições de 1:50, 1:100, 1:200, 1;400, 1:800, 1:1600 e 1:3200 e as microplacas incubadas a 4°C por 18 horas.

A seguir, acrescentou-se 50µl/cavidade de IgG anti-rato biotinilado (B7139, Sigma, USA) nas concentrações de 2µg/ml, 4µg/ml e 8µg/ml e as microplacas foram incubadas por uma hora à temperatura ambiente. Após a incubação e lavagem, foram adicionados 50µl/cavidade de avidina-fosfatase alcalina (A7294, Sigma, USA), nas diluições de 1:10.000, 1:30.000 e 1:40.000, permanecendo por mais uma hora à temperatura ambiente.

Como última etapa, foram adicionados 50µl/cavidade do substrato P-nitrophenil-phosphatase disodium (Sigma # 104-105) na concentração de 1µg/ml diluído em tampão dietanolamina (Merck) 10%. A reação foi interrompida após 20 minutos, com adição de 100µl de NaOH 3N/cavidade e a leitura realizada em leitor de ELISA (Multiskan® EX) em comprimento de onda 405nm.

Após a padronização da técnica, cada uma das trinta amostras foi processada em duplicata, para o estabelecimento do título de sangue ingerido por flebotomíneos, tendo sido adicionados em cada microplaca controles positivo e negativo, a fim de se evitar variações nos valores de absorbância, que podem interferir na significância do teste, quando as microplacas não são lidas logo após a adição do substrato. Para o cálculo das trinta amostras de Lu longipalpis, foram computados todos os valores de absorbância e os títulos de sangue ingerido foram expressos como log2 da recíproca da maior diluição das amostras apresentando reação positiva.

Capacidade da técnica em identificar a fonte de alimentação. Para este estudo, foram separadas outras trinta fêmeas ingurgitadas, processadas separadamente e subdivididas em grupos de 15 exemplares cada, sendo estabelecidos dois diferentes horários para a quantificação de sangue ingerido.

Os exemplares foram mantidos em insetário à temperatura ambiente e sacrificados em períodos de aproximadamente 12 e 24 horas pós-ingestão, sendo então, realizada a técnica imunoenzimática de captura com a adição a cada microplaca das amostras a serem testadas em duplicata os respectivos controles positivo e negativo.

Para o cálculo do índice de positividade das amostras foram determinadas as médias em log2, desvios padrão, variâncias e também para a titulação de sangue ingerido nos horários pré-estabelecidos pós-ingestão, os resultados foram analisados pelo teste t de Student®, ao nível de significância 1% (p< 0,001).

RESULTADOS

Para a identificação da concentração ideal do anti-soro de rato, para a sensibilização da microplaca, foi realizada uma titulação em bloco, variando-se as concentrações do anti-soro frente a diferentes diluições das amostras que compõem o controle positivo, em duplicata. A menor concentração do anti-soro a ser utilizada na reação foi determinada como sendo 0,625µg/ml (Figura 1).


A seguir, foi determinada a menor concentração do segundo anticorpo, sendo estabelecido 8µg/ml (Figura 2) e também foram testadas diferentes diluições de avidina-fosfatase alcalina, sendo a diluição de 1:40.000 considerada como a que mais se adequou à reação (Figura 3).



Das diferentes diluições das amostras testadas na razão 2, a menor diluição para exemplares de flebotomíneos, contendo em torno de dois a quatro quartos de sangue no conteúdo abdominal, foi de 1:256.

O ponto de corte da reação foi estipulado pelo emprego de três vezes o desvio padrão das amostras, sendo a absorbância específica igual ou maior que 0,261 considerada como valor positivo. A média do branco foi 0,082 com desvio padrão de 0,0065.

A média dos títulos de sangue ingerido para as trinta amostras foi 13,12 log2 com desvio padrão de 0,084 e as médias determinadas para os grupos controle positivo e negativo das amostras testadas foram 12,2 log2 e 1 log2 , respectivamente. Os resultados referentes às trinta amostras utilizadas no estabelecimento da técnica para a titulação de sangue ingerido encontram-se representados na Figura 4.


Os resultados da dispersão das amostras de 12 horas e 24 horas pós-ingestão estão representados nas Figuras 5 e 6 e as respectivas médias, desvios padrão e variâncias foram 11,3 log2; 0.09 e 0,0081 para amostras de 12 horas e 10 log2; 0,16 e 0,0256 para amostras de 24 horas.



Para os grupos com períodos de 12 e 24 horas pós-ingestão, verificou-se diferença significativa entre os títulos (t= 65; p< 0,001).

DISCUSSÃO

A atração de fêmeas de flebotomíneos em relação ao homem e animais domésticos tem sido alvo de vários estudos para a investigação da freqüência e especificidade do contato hospedeiro-vetor, que se reflete como fator de risco na transmissão das leishmanioses.

Embora o repasto sangüíneo para muitas espécies de flebotomíneos na Região Neotropical ocorra na população humana e de animais domésticos, torna-se de interesse, conhecer com que freqüência esta atividade se desenvolve em diferentes ecossistemas, para que se possa atribuir-lhes o papel de possíveis vetoras de Leishmania. Claro que, sendo os animais, hospedeiros essenciais das leishmanias, a multiplicidade destes com que o flebotomíneo se envolve, representa um importante determinante na epidemiologia das leishmanioses.

Com este enfoque, estudos valendo-se de iscas animais, têm fornecido dados essenciais, na resposta a questões das possíveis associações entre reservatórios e insetos transmissores, nos diferentes habitats3 6 7. O mesmo não se pode afirmar em relação aos estudos de caráter experimental, como justificativa de identificação de preferência alimentar, visto que a fonte ao permanecer em contato com o vetor, induziria os repastos que, não necessariamente, seriam da forma como ocorrem na natureza9.

Portanto, o emprego de técnicas imunológicas no estudo do hábito alimentar associado ao hematofagismo de insetos pode acrescentar novos conhecimentos ao quadro epidemiológico de parasitoses, com a identificação de possíveis hospedeiros nos quais os agentes circulam, visto que cada vez mais têm-se observado a tendência da urbanização das leishmanioses.

Diferentes técnicas, mais tradicionalmente a de precipitina têm sido empregadas para a identificação de repastos sangüíneos de mosquitos e outros artrópodes hematófagos11 14 23 e têm caracterizado o grupo hierárquico, tais como, ordens e classes de hospedeiros envolvidos no hematofagismo19.

O teste de precipitina é de utilização limitada para flebotomíneos, pois apenas cinco ou seis testes podem ser utilizados com sucesso, devido à pequena quantidade de sangue ingerido20. Embora sua execução seja relativamente simples, apresenta menor sensibilidade e especificidade e alto consumo de anti-soro.

Por outro lado, há algum tempo, diferentes modalidades da técnica imunoenzimática vêm sendo empregadas para a identificação de hábito alimentar de mosquitos2 com o objetivo de identificar a fonte sangüínea dos possíveis reservatórios. Esta técnica tem se mostrado eficiente, por apresentar maior sensibilidade e especificidade, bem como a sua automação permitir o processamento e investigação de um grande número de amostras, o que representa um aspecto de importância na investigação epidemiológica.

Considerando que a sensibilidade e especificidade podem ser aumentadas com a introdução da técnica imunoenzimática de captura, Service e cols20 aplicaram esta metodologia para a identificação de sangue ingerido por culicídeos e culicóides e ressaltaram vantagens, como alternativa ao teste de precipitina, em vista da possibilidade de reconhecer a fonte sangüínea em amostras contendo quantidades reduzidas de sangue recém-ingerido.

Neste estudo, em relação aos trinta exemplares que apresentaram em torno de 2/4 a 4/4 de sangue no conteúdo abdominal e cujas amostras foram diluídas inicialmente a 1:256, o teste proveu a execução de aproximadamente noventa provas em duplicata. Desta maneira, utilizando o sistema fosfatase alcalina avidina-biotina foi demonstrado que com mínimas concentrações de soro total anti-rato (0,625µg/ml), IgG conjugado à biotina (8µg/ml) e com a diluição de avidina (1:40.000), foi possível processar um grande número de amostras para a identificação de sangue ingerido, que numa pesquisa de campo é de extrema importância, quando não se dispõe de muitos recursos financeiros. Esta técnica também foi empregada com sucesso, no estudo dos possíveis mecanismos imunológicos envolvidos durante a infecção e imunização de camundongos geneticamente modificados, com diferentes amostras de coronavírus21.

Ainda considerando as trinta amostras utilizadas, cujo conteúdo abdominal compreendia em torno de 2/4 a 4/4 de sangue, a diluição inicial estabelecida foi de 5log2 (1:256) e a reatividade pôde ser constatada a olho nú. Conforme se observa na Figura 4, a diluição de 1:8.192 que corresponde ao título de 13log2 foi a mais freqüente na amostragem em estudo, mas foram encontrados exemplares com diluições até 1:16.384, 1:32.768, 1:65.536 que correspondem aos títulos de 14log2, 15log2 e 16log2 o que suscita a alta sensibilidade do teste empregado.

Com base em nossa vivência, na grande maioria das vezes, observa-se em flebotomíneos capturados na natureza, aproximadamente dois a quatro quartos de sangue recém ingeridos no conteúdo abdominal, quantidade esta semelhante a utilizada neste experimento. Assim, o teste padronizado poderá ser empregado com sucesso na identificação de fonte alimentar.

Embora diferentes técnicas tenham sido empregadas para o estudo do hábito alimentar, as reagentes apontam para um curto período de tempo, aproximadamente 24 horas pós-ingestão1 18 19 20.

Para o teste desenvolvido, a identificação de sangue ingerido foi viável para todos os exemplares de Lu longipalpis com até 12 e 24 horas pós-ingestão.

Considerando que a quantidade de sangue ingerido por culicídeos é sensivelmente superior à de flebotomíneos e culicóides, além das variáveis que podem influenciar nas taxas de digestão - quantidade de sangue ingerido, temperatura ambiente, diferença entre exemplares da mesma espécie e entre espécies, idade fisiológica e fonte alimentar - os resultados obtidos neste estudo representam uma amostra da população para a qual o teste vem corresponder de maneira satisfatória, corroborando com os resultados encontrados pelos demais autores. Agradecimentos: Os autores agradecem à Dra. Ana Maria Moura da Silva pelas sugestões, ao Instituto Evandro Chagas pela doação dos espécimes de Lu. Longipalpis e à Maria das Graças Silva pela confecção das figuras.

Recebido para publicação em 28/10/2003

Aceito em 4/8/2004

Apoio financeiro: Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) – projeto 00/06811-0.

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  • Endereço para correspondência
    Dra. Ana Maria Marassá
    Laboratório de Parasitoses Sistêmicas. Instituto Adolfo Lutz
    Av. Dr. Arnaldo 355
    01246-902 São Paulo, SP
    Tel: 11 3068-2891
  • Datas de Publicação

    • Publicação nesta coleção
      09 Dez 2004
    • Data do Fascículo
      Dez 2004

    Histórico

    • Aceito
      04 Ago 2004
    • Recebido
      28 Out 2003
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