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Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical

Print version ISSN 0037-8682On-line version ISSN 1678-9849

Rev. Soc. Bras. Med. Trop. vol.38 no.2 Uberaba Mar/Apr. 2005

http://dx.doi.org/10.1590/S0037-86822005000200002 

ARTIGO ARTICLE

 

Perfil de isotipos de imunoglobulinas e subclasses de IgG na leishmaniose tegumentar americana

 

Immunoglobulin isotype and IgG subclass profiles in american tegumentary leishmaniasis

 

 

Maria Aparecida de SouzaI; Adriano Gomes da SilvaI; Sandra Regina Afonso-CardosoI; Silvio Favoreto JuniorII; Marcelo Simão FerreiraIII

ILaboratório de Imunologia do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, MG
IICardiovascular Research Institute of University of California at San Francisco, San Francisco, California, USA
IIIServiço de Infectologia do Hospital de Clínicas da Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, MG, Brasil

Endereço para correspondência

 

 


RESUMO

O presente trabalho avaliou o perfil de anticorpos em amostras de soro de 37 pacientes com diagnóstico clínico confirmado ou compatível com leishmaniose tegumentar americana atendidos no Hospital de Clínicas da Universidade Federal de Uberlândia, MG. Os perfis das classes de imunoglobulinas e subclasses de IgG foram analisados pelo teste ELISA indireto, utilizando-se antígeno solúvel de Leishmania (Leishmania) amazonensis. A avidez dos anticorpos foi determinada pelo tratamento com uréia a 6 M, após incubação dos soros com o antígeno. Observou-se que 97%, 94,6%, 57,5 e 21,5% das amostras testadas apresentaram anticorpos anti-Leishmania das classes IgE, IgG, IgA e IgM, respectivamente e, os perfis das subclasses de IgG demonstraram, IgG1>IgG3>IgG2>IgG4. Os anticorpos IgE anti-Leishmania de alta avidez corresponderam a 44,4%. Por outro lado, IgG e IgA anti-Leishmania foram em sua maioria (62,8 e 47,8%, respectivamente), de média avidez. A variação do perfil de isotipos, bem como a avidez das imunoglobulinas refletiu a complexidade da resposta imune humoral contra a leishmaniose tegumentar americana.

Palavras-chaves: Leishmaniose tegumentar americana. Avidez. Imunoglobulinas. Subclasses de IgG.


ABSTRACT

The present work investigated the serum antibody profiles in 37 patients with American tegumentary leishmaniasis, who were attended at Hospital de Clinicas — Universidade Federal de Uberlandia, MG, Brazil. The immunoglobulin class and IgG subclass profiles were analyzed by indirect ELISA using Leishmania (Leishmania) amazonensis soluble antigen. The antibody avidity was determined by 6 M urea treatment after incubation with immunoenzymatic conjugate. It was observed that 97% of the serum samples presented anti-Leishmania antibodies for IgE class, 94.6% IgG, 57.5% IgA and 21.5% IgM class. For IgG subclasses the profiles were in the following order of frequency: IgG1>IgG3>IgG2>IgG4. High avidity of anti-Leishmania IgE antibodies was found in 44.4% of the samples. On the other hand, moderate avidity of specific IgG and IgA was observed in 62.8% and 47.8% of samples, respectively. These results indicate a very complex antibody response profile against American tegumentary leishmaniasis.

Key-words: American tegumentary leishmaniasis. Avidity. Immunoglobulin. IgG subclasses.


 

 

Parasitas do gênero Leishmania são protozoários intracelulares obrigatórios que causam um complexo de enfermidades no homem e animais denominadas leishmanioses. Essas infecções atingem cerca de 12 milhões de pessoas em todo o mundo e são consideradas uma das dez principais doenças tropicais pela Organização Mundial da Saúde27. De acordo com este órgão, a forma tegumentar dessa parasitose é a apresentação clínica mais comum, acometendo cerca de 75% dos casos e constituindo um grave problema de saúde pública. A importância dessa moléstia não se deve apenas à sua alta incidência e ampla distribuição geográfica, mas também à possibilidade de produzir lesões destrutivas e desfigurantes, com importante repercussão no quadro psicossocial do paciente3.

As principais espécies responsáveis pela forma tegumentar dessa enfermidade no Brasil são Leishmania (Viannia) braziliensis, Leishmania (Leishmania) amazonensis e Leishmania (Viannia) guyanensis. Dentre as espécies menos incidentes encontram-se Leishmania (V.) naiffi, Leishmania (V.) shawii e Leishmania (V.) lainsoni11.

Inicialmente, em Minas Gerais, a leishmaniose tegumentar americana (LTA) ocorria sob forma esporádica ou epidêmica em locais de desmatamento realizado para a construção de rodovias e abertura de áreas agrícolas15. Atualmente, esse perfil tem-se modificado, com aumento da incidência dessa enfermidade em áreas peri-urbanas, graças principalmente ao desequilíbrio ambiental16.

Testes sorológicos têm sido empregados, com considerável importância, no diagnóstico e em inquéritos epidemiológicos dessas enfermidades. Além disso, a análise de anticorpos anti-Leishmania permite avaliar o curso evolutivo da infecção, bem como fornecer dados sobre as características de sua resposta imune. Variados perfis e níveis de imunoglobulinas específicas a Leishmania têm sido detectados em pacientes com LTA, parecendo refletir não só a carga parasitária, mas também a espécie envolvida, o tempo de infecção e fatores intrínsecos do próprio hospedeiro8.

Como em outras doenças infecciosas e parasitárias, o monitoramento da resposta de anticorpos a antígenos envolvidos nos diferentes estágios da infecção pode fornecer informações valiosas que podem auxiliar na compreensão dos mecanismos de controle do sistema imune sobre os parasitas12 18 20. Em leishmaniose visceral (LV), tem sido bem caracterizado o padrão de resposta do tipo TH2, evidenciado pela forte depressão da imunidade celular, baixa produção de citocinas proinflamatórias, como interferon-gama (IFN-3) e interleucina-2 (IL-2) e, por outro lado, pelo aumento da produção das citocinas IL-4 e IL-5, ativação policlonal de células B e hipergamaglobulinemia6 9. Além disso, a detecção de anticorpos IgE específicos para Leishmania em LV tem sido correlacionada com a fase ativa da doença2. Em LTA, fica difícil de se estabelecer um padrão específico de resposta imune, pela complexidade da enfermidade. Em casos de leishmaniose cutânea (LC), foi observado um padrão misto TH1 e TH2 de resposta21 com a detecção de anticorpos IgE25. Contudo, o papel de anticorpos específicos na imunidade anti-Leishmania ainda não está completamente esclarecido26.

Desse modo, a análise da presença de marcadores sorológicos aplicáveis ao diagnóstico é de grande importância no estudo dessas doenças assim como no desenvolvimento de estratégias de controle epidemiológico. O presente trabalho analisou os perfis das classes de imunoglobulinas (Ig) e subclasses de IgG em pacientes com quadro clínico confirmado ou compatível com LTA atendidos no Hospital de Clínicas da Universidade Federal de Uberlândia.

 

MATERIAL E MÉTODOS

Amostras de soro. Para a utilização das amostras de soro de pacientes, houve aprovação do comitê de ética da Universidade Federal de Uberlândia, Uberlândia, MG, de acordo com o processo número 109/2002. Todas as amostras foram colhidas e manipuladas de acordo com as normas de biossegurança5.

As amostras de soro foram obtidas de 37 pacientes com diagnóstico clínico confirmado ou compatível com LTA, caracterizado pela presença de ulceras cutâneas simples ou múltiplas, atendidos no Hospital de Clínicas da Universidade Federal de Uberlândia. As amostras de soro controles (20) foram provenientes do Laboratório de Imunologia-UFU, obtidas de voluntários saudáveis, os quais não possuíam histórico clínico compatível de leishmaniose e foram sorologicamente não reagentes para doença de Chagas pelos testes ELISA e imunofluorescência indireta.

Preparação do antígeno de Leishmania. Formas promastigotas de Leishmania (Leishmania) amazonensis (IFLA/BR/67/PH8) foram cultivadas em meio BHI (Brain Heart Infusion, Oxoid LTD, Basingstoke, Hampshire, UK) suplementado com 10% de soro bovino fetal (Cultilab, Campinas, BR), 1% de antibiótico e 1% de L-glutamina (Gibco BRL-Life Technologies, New York, USA) a 25ºC até atingirem a fase estacionária. Os parasitas (109) foram colhidos, lavados por centrifugação em salina balanceada de Hanks (HBSS), ressuspensos em 1ml de salina tamponada com Tris (TBS a 0,02M, pH 7,2) contendo 1,6mM de fluoreto fenil-metil-sulfonil (PMSF) e mantidos em banho de gelo por 10 minutos. Em seguida, os parasitas foram submetidos a 3 ciclos de congelamento (N2 líquido)/ descongelamento (banho-maria, 37ºC) e rompidos por 3 ciclos de sonicação a 80 hertz. O lisado foi centrifugado a 20.000 x g por 1 hora a 4ºC. O sobrenadante foi colhido, filtrado em membrana de 0,22mm e, a concentração protéica determinada (Lowry, 1951) e estocado a -20ºC até o momento do uso.

Ensaio imunoenzimático. ELISA indireto: placas de poliestireno (Montegrotto Terme, Padova, Italy), com 96 poços foram sensibilizadas com 10mg/ml (50ml/poço) de antígeno em tampão carbonato/bicarbonato 0,06M, pH 9,6. As placas foram incubadas por 18 horas a 4ºC em câmara úmida e, em seguida lavadas com salina tamponada com fosfatos (PBS a 0,15M, pH 7,2) contendo 0,05% de Tween-20 (PBS-T). As amostras de soro foram adicionadas (50ml/poço, em duplicata) na diluição 1/50 (menor diluição de detecção de anticorpos específicos anti-Leishmania determinada por titulação das amostras de soros) em PBS-T contendo 10% de soro de cabra normal (PBS-T-SCN). Após incubação por 45 minutos a 37ºC, as placas foram novamente lavadas e o conjugado imunoenzimático (anticorpos policlonais anti-IgG, ou -IgM, ou -IgA, ou -IgE humana produzidos em cabra ou monoclonais anti-subclasses de IgG humana produzidos em camundongos, ligados à peroxidase, Zymed Laboratories, DNC. San Francisco, CA) diluído em PBS-T-SCN foi adicionado (50ml/poço) e posteriormente incubadas por 45 minutos a 37ºC. Em seguida, as placas foram lavadas novamente, sendo adicionado o substrato enzimático (peridrol em tampão citrato de sódio/acido cítrico, pH 5, contendo orto-fenilenodiamina (OPD), 50ml/poço). Após o desenvolvimento da cor por 15 minutos, a reação foi interrompida com H2SO4 2N e a leitura efetuada em leitor de microplaca a 492nm. Os resultados foram expressos por índice ELISA (IE) calculado pela fórmula EI = (S - B)/(N - B), onde S é a média dos valores da densidade óptica em cada amostra, B corresponde à média dos valores da densidade óptica do branco e N, a média dos valores de densidade óptica dos controles negativos. Os valores de cortes das reações foram estabelecidos pela somatória das densidades ópticas das amostras negativas mais três desvios padrões, amostras acima desses valores foram consideradas reativas.

Ensaio imunoenzimático. ELISA avidez: placas de poliestireno (Montegrotto Terme, Italy), com 96 poços, foram sensibilizadas com antígeno e incubadas com as amostras de soro, como descrito anteriormente. Previamente à adição do conjugado, as placas foram tratadas com uréia a 6M em PBS por cinco minutos. Em seguida, foram lavadas e o conjugado imunoenzimático (anti-isotipos) foi adicionado e a reação desenvolvida. Os resultados foram expressos em índice de avidez (IA), determinados pela razão entre os valores da densidade óptica das amostras tratadas com uréia (U+) e a densidade óptica das amostras não tratadas (U-) e expresso em porcentagem ([IA = U+/U- x 100]), sendo arbitrariamente definidos que: IA menor que 40% considerados de baixa avidez, entre 41 e 70%, de média avidez e maior que 70%, de alta avidez.

Análise estatística. Para comparação entre a mediana dos índices ELISA (IE), obtidos nas classes e subclasses de imunoglobulina, foi utilizado o teste não paramétrico de Mann-Whitney e teste t para comparação das proporções dos índices de avidez das classes de anticorpos. Valores de p<0,05 foram considerados estatisticamente significantes.

 

RESULTADOS

Aspectos clínicos dos pacientes. Na Tabela 1 estão apresentados os principais dados demográficos e as formas clínicas dos pacientes, podendo-se observar que o tempo de evolução da doença variou entre 1 mês e 10 anos, com acometimento principalmente de pacientes do sexo masculino (83,8%). A forma cutânea foi a manifestação clínica predominante (86,5%) dos casos.

 

 

Análise dos isotipos de imunoglobulinas. Foram analisadas 37 amostras de soro de pacientes pelo teste ELISA, os resultados estão expressos em Índice ELISA (IE) com seus respectivos pontos máximos e mínimos e, porcentagens de amostras reativas em cada classe de imunoglobulina (Figura 1). Das 37 amostras de soro analisadas foram detectados anticorpos das classes IgE e IgG anti-Leishmania em 97% e 94,6% respectivamente (Figura 1, p<0,05) cujos valores de cortes para cada classe de imunoglobulina foram 0,036 para IgE e 0,054 para IgG. Em 21,5% das amostras de soro dos pacientes foram detectados anticorpos da classe IgM (valor de corte 0,143) e 57,5% (valor de corte 0,038) da classe IgA (Figura 1). Os maiores níveis de reatividade foram observados para a classe IgG quando as medianas dos índices ELISA (IE) foram comparadas às medianas das demais classes de anticorpos (Figura 1, p<0,05). A IgE anti-Leishmania, apresentou baixa reatividade para a maioria das amostras de soro (Figura 1). No entanto, ao se analisar o índice de avidez dessa imunoglobulina, observou-se que em sua maioria (44,4%, p<0,05) apresentaram-se de alta avidez (Tabela 2). Por outro lado, IgG e IgA anti-Leishmania foram predominantemente de média avidez (62,8 e 47,8%, respectivamente, Tabela 2; p<0,05).

 

 

 

 

Subclasses de IgG. Foram analisadas 37 amostras de soro de pacientes pelo teste ELISA, os resultados estão expressos em Índice ELISA (IE), com suas respectivas porcentagens de amostras reativas em cada subclasse de IgG (figura 2). A análise dos perfis de subclasses de IgG das 37 amostras de soro, demonstrou o predomínio de IgG1 em 92,5% dos pacientes, seguido pela IgG3 com 85% (Figura 2, p<0,05). As subclasses que apresentaram menores níveis de detecção foram IgG2 (55%) e IgG4 (52,5%). Desse modo, o perfil de isotipos observado foi IgG1>IgG3>IgG2>IgG4 (Figura 2). O índice de reatividade entre as subclasses foi significantemente maior (p>0,05) para IgG1 e IgG3 quando comparados aos índices de detecção de IgG2 e IgG4, como demonstrado pelas medianas dos índices ELISA (IE) de cada subclasse de IgG (Figura 2).

 

 

DISCUSSÃO

A infecção por Leishmania normalmente, leva à indução de resposta imune complexa, caracterizada tanto por reações mediadas por células como pela produção de anticorpos. A natureza da resposta imune celular desempenha um papel fundamental na determinação da resposta imune humoral pela indução da produção de anticorpos de isotipos específicos de imunoglobulinas23. No presente estudo, foi avaliado o perfil dos isotipos das imunoglobulinas em 37 amostras de soro, no qual detectou-se que a classe IgE anti-Leishmania estava presente na maioria das amostras de soro de pacientes com LTA. Dados de literatura demonstram que existe uma correlação positiva entre altos índices de IgE e reação de Montenegro, sugerindo que estes anticorpos participam do processo de imunorregulação na leishmaniose cutânea25. No entanto, neste estudo não foi realizada esta prova nos pacientes, dificultando deste modo, estabelecer-se relação semelhante. Além disso, em pacientes nos estágios iniciais de LC, tem sido demonstrado maior produção de IL-10 em detrimento de IFN-g, ocorrendo troca deste perfil ao longo da evolução da doença, onde citocinas proinflamatórias passam a serem predominantes22. Sendo assim, os achados de IgE anti-Leishmania no presente estudo, podem estar associados aos processos iniciais da evolução da doença e consequentemente, ao perfil TH2 de resposta imune nesses pacientes. Por outro lado, em leishmaniose mucosa há uma mistura de perfil de resposta TH1 e TH2, antes e após tratamento1.

No estudo em apreço, em todos os pacientes com quadro clínico de leishmaniose mucosa foram detectados altos índices de IgA (57,5%). Esses dados estão de acordo com outros autores19, que também demonstraram elevação dos níveis de anticorpos IgA-Leishmania específicos em pacientes com comprometimento mucoso.

Embora muitos dos pacientes apresentassem pouco tempo de evolução das lesões, altos níveis de anticorpos da classe IgM não foram detectados. Esses dados diferem de outros da literatura em que os níveis de IgM se correlacionam com a fase inicial da infecção10. No entanto, este fato pode ser explicado tanto pelas limitações do teste sorológico (ELISA), como pela preparação antigênica empregada nesse estudo.

Em LTA, a forte imunidade mediada por células e a predominância de isotipos IgG1, IgG2 e IgG3 nas leishmanioses cutâneas e mucocutâneas tem sido associadas ao perfil TH1 de resposta3 4. Já, o isotipo IgG4 relaciona-se às manifestações da leishmaniose cutânea difusa, associado ao perfil TH2 da resposta imune23 25. Neste trabalho, as subclasses de IgG predominantemente detectadas também foram IgG1 e IgG3, em acordo com outros trabalhos23 26, que também demonstraram a predominância de anticorpos dessas subclasses na LC.

Em doenças infecciosas, tais como toxoplasmose e doença de Chagas, a avidez de anticorpos determina a fase da infecção, sendo considerada importante marcador sorológico13 14 17. Em leishmaniose, a associação entre o quadro clínico do paciente com o perfil de imunoglobulinas, bem como, com sua avidez, é muito complexo. No presente estudo, não foi possível estabelecer correlação entre o tempo de evolução da lesão dos pacientes e a avidez das imunoglobulinas, pois, nos casos de lesões recentes, entre 1 a 3 meses, foram observados anticorpos com altos índices de avidez. Além disso, em pacientes com até 10 anos de infecção foram detectados anticorpos de baixa avidez. Esses dados evidenciam a complexidade da resposta imune humoral em pacientes com LTA, mostrando que durante esse processo infeccioso, não há correlação entre maturação e mensuração de anticorpos, em termos de avidez, com a evolução da parasitose.

 

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Endereço para correspondência
Prof. Marcelo Simão Ferreira
R. Goiás 480/500 Centro
38400-064 Uberlândia MG, Brasil
Telefax: 34 3236-3151
e-mail: mferreira@nanet.com.br

Recebido para publicação em 26/02/2004
Aceito em 16/11/2004
Apoio Financeiro: CNPq e Sustainable Science Institute (SSI), California, USA.

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