Estudo quantitativo de metais presentes na hemolinfa de Biomphalaria glabrata (Gastropoda), infectadas e não infectadas com Schistosoma mansoni

Quantitative study of metal present in the hemolymph of Biomphalaria glabrata (Gastropoda), infected and uninfected with Schistosoma mansoni

ARTIGO ARTICLE

Estudo quantitativo de metais presentes na hemolinfa de Biomphalaria glabrata (Gastropoda), infectadas e não infectadas com Schistosoma mansoni

Quantitative study of metal present in the hemolymph of Biomphalaria glabrata (Gastropoda), infected and uninfected with Schistosoma mansoni

Marco Antonio Vasconcelos Santos^I; Edilson da Silva Brabo^II; Bruno Santana Carneiro^II; Kleber de Freitas Faial^II; Isabel Raimunda Carvalho Rodrigues^I

^ISeção de Parasitologia do Instituto Evandro Chagas, Belém, PA

^IISeção de Meio Ambiente do Instituto Evandro Chagas, Belém, PA

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

Inicialmente, desenvolveu-se um estudo para quantificar e comparar as concentrações de alguns metais presentes em duas amostras de hemolinfa do caramujo Biomphalaria glabrata (infectados e não-infectados com Schistosoma mansoni). A espectrometria de emissão óptica com fonte de plasma induzido (ICP-OES), foi utilizada para analisar os metais nas duas amostras. Os metais estudados foram: alumínio, cálcio, cádmio, cobalto, cromo, cobre, ferro, potássio, magnésio, manganês, chumbo e zinco. Os resultados mostram que, a princípio, os metais não são fatores determinantes no processo de defesa desses organismos contra este parasita, quando presente nos seus tecidos.

Palavras-chaves:Biomphalaria glabrata. Metais. Hemolinfa.

ABSTRACT

We conducted a preliminary study to quantify and compare two concentrations of the same metals present in the hemolymph of snail Biomphalaria glabrata. In this context, we used Induction Coupled Plasma Optical Emission Spectroscopy technique (ICP-OES), to analyze the metals in the two samples (snails infected and not infected with Schistosoma mansoni). The metals studied were: aluminum, calcium, cadmium, cobalt, chromium, copper, iron, potassium, magnesium, manganese, lead and zinc. Preliminary results showed that such metals are not involved in the defense of these organisms against the parasite, when present in their tissues.

Key-words:Biomphalaria glabrata. Metals. Hemolymph.

A defesa interna no molusco Biomphalaria glabrata contra a larva do Schistosoma mansoni, tem mostrado que o encapsulamento e posterior fagocitose realizada pelos hemócitos sobre o material não-próprio, representaria a resposta imune desenvolvida por estes organismos^{8 26 28}. Juntamente com as substâncias citotóxicas que atuam sobre as larvas, que são liberadas pelos hemócitos após o encapsulamento^{3 9 22}, os metais também estão presentes e integram-se à hemolinfa para compor o processo de defesa^{5 23}. O elemento alvo a ser pesquisado, é a hemolinfa, que funciona como o veículo na qual todos circulam.

Para esse fim, a espectrometria de emissão óptica com fonte de plasma induzido (ICP-OES), pode ser utilizada como boa opção analítica para análise multi-elementar em diversos tipos de amostras. Nesta técnica, uma fonte de alta energia é usada, para converter as espécies de interesse, presentes na amostra em átomos e íons, que sofrerão transições eletrônicas, gerando um espectro de emissão formado por fótons de luz, com freqüência e energia diferentes. Esse feixe de radiação é direcionado para um policromador, onde ocorre a separação em comprimentos de onda, que são focalizados no plano focal e quantificados por um sistema de detecção. Neste estudo, utilizou-se plasma de argônio como fonte de excitação. A vantagem para seu uso, é o fato de possuir energia suficiente para promover a excitação da maioria dos elementos químicos, proporcionando alta sensibilidade, com ampla faixa linear e estabilidade temporal satisfatória.

Diante dos poucos dados disponíveis na literatura, desenvolveu-se um estudo preliminar, onde buscou-se determinar diferenças quantitativas, sobre o maior número possível desses metais presentes na hemolinfa, coletada em caramujos B. glabrata, infectados com S. mansoni, para comparar com amostras da mesma espécie de moluscos não infectados. A determinação sobre os tipos de metais aqui estudados, foi feita de acordo com a nossa disponibilidade técnica para quantificá-los.

MATERIAL E MÉTODOS

Moluscos utilizados. Para o desenvolvimento deste estudo, foram usados um total de 300 caramujos B. glabrata, sendo 150 infectados e 150 não infectados, todos colonizados em laboratório, a partir de ovas de caramujos da mesma espécie, coletados na região Bragantina, a oeste do estado do Pará. Todos os espécimes apresentavam diâmetro de concha que variava entre 1,8 a 2,2cm, e foram infectados individualmente em laboratório com 5 miracídios de S. mansoni, obtidos de triturado hepático de camundongos infectados com cepa silvestre, isolada da mesma localidade, os quais (caramujo e miracídios) foram confinados em pequenos vidros contendo 3mL de água potável desclorada, sob luz por 90 minutos. Após esse tempo, os caramujos foram recolhidos em aquário de vidro contendo o mesmo tipo de água, permanecendo no laboratório em ambiente com pouca luz. A água do aquário foi trocada a cada 3 dias, e a alimentação foi realizada com alface fresca e ração de camundongo triturada servidas sempre que necessário. Para o experimento com caramujos não infectados, os moluscos tiveram a mesma procedência, o mesmo tratamento laboratorial, e foram puncionados com a mesma metodologia e livres de infecção.

Coleta da hemolinfa. A hemolinfa do caramujo foi obtida com a introdução de uma agulha (30 x 8 21G 1¼) na região cefalopodal, até atingir a cavidade do manto. Esse procedimento de punção foi realizado quebrando-se um pouco a concha na sua abertura, de forma a acompanhar a retração de defesa do animal para dentro da concha. Após a retração se estabilizar, introduzimos a agulha até a cavidade do manto e em seguida retiramos, esse movimento fez com que a hemolinfa saísse do caramujo pelo orifício deixado pela agulha, para depositar-se na curvatura da concha de onde foi aspirada com pipeta de vidro siliconizada. A hemolinfa foi transferida gradativamente para um tubo de vidro de 15ml siliconizado, e mantido em baixa temperatura no laboratório, até atingir o volume final de 10ml, o qual foi centrifugado por 10 minutos a 223g, para retirada dos hemócitos.

Determinação quantitativa dos metais nas amostras de hemolinfa. No procedimento de solubilização da amostra, um volume de 1mL de hemolinfa e 3mL de HNO₃ concentrado de alta pureza, foram adicionados em um tubo de ensaio de 23cm de altura e diâmetro 2,5cm, e levados ao bloco aquecedor de alumínio à temperatura de 90ºC por 60 min. Em seguida, a solução foi esfriada à temperatura ambiente, transferida para balões volumétricos com três lavagens nas paredes internas dos tubos, e completada com água deionizada ao volume final de 50mL. As soluções padrões (curva de calibração) para leitura no ICP-OES dos metais de interesse, foram preparadas a partir de soluções estoque de 100mg/L, após as diluições adequadas (Tabela 1), com água deionizada. Uma alíquota de 10mL da solução amostra foi transferida para tubos de ensaio 13x10cm no Sample Preparation System SPS 5 da VARIAN. Para determinação de metais nas amostras de hemolinfa foi utilizado um Espectrômetro de Emissão Óptica com Plasma Induzido (ICP-OES), modelo VISTA CCD simultâneo da VARIAN com configuração axial, equipado com detector MPX, cobertura de comprimento de onda entre 177 a 785nm, o que faz com que as interferência espectrais fossem facilmente eliminadas. Todas as condições operacionais do equipamento são controladas pelo software Vista-MPX. A Tabela 2 mostra as condições instrumentais utilizadas para determinação das dosagens dos metais encontrados na hemolinfa do molusco B. glabrata.

RESULTADOS

Os resultados mostram (Tabela 3) que não houve diferenças significativas, nas determinações dos metais estudados, entre os grupos de caramujos não infectados e infectados. Somente um metal, o chumbo, foi detectado no grupo de caramujos não infectados, mas não foi detectado entre os infectados. O cobalto e cromo não foram detectados em nenhum dos dois grupos.

DISCUSSÃO

Entre as substâncias integrantes da hemolinfa da B. glabrata, a hemoglobina constitui 97% das proteínas totais aí presentes¹², e na sua constituição foram identificados cerca de 19 aminoácidos¹. Observou-se também, que esta hemoglobina apresentou 0,315% de ferro. Outros estudos mostram que o ferro é, inicialmente, depositado no hepatopâncreas, mas é transferido logo em seguida para outros órgãos, onde o ovoteste recebe a maior parte¹⁵. Como o hepatopâncreas e ovoteste são anatomicamente contíguos¹⁶, pode-se imaginar que a passagem de ferro se faça diretamente. Em estudos anteriores, foi demonstrado que ocorre também captação dos metais: zinco, cádmio e cobre pelo hepatopâncreas desse molusco^{25 33}. Entretanto, mais estudos para quantificar alguns metais presentes na hemolinfa de B. glabrata necessitam ser realizados, para ajudar no entendimento de todo esse processo.

Estudos foram realizados para detalhar bioquimicamente a natureza da hemolinfa em Biomphalaria glabrata, como também em outras espécies de moluscos^{30 31}. A quantificação de aminoácidos e proteínas também foi realizada ^{1 10 19}. Vários trabalhos tem procurado estudar substâncias importantes presentes na hemolinfa e procurado determinar o seu papel na questão da interação parasito hospedeiro^{4 12 13 17 21 31}. Estudos sobre a participação dos metais em todo esse processo, têm despertado a realização de investigações que tem ajudado no entendimento dessa questão^{2 25}. Os efeitos do alumínio nos invertebrados, por exemplo, têm focalizado uma avaliação em crustáceos, alguns moluscos e também larvas de insetos^{11 29}. Para peixes e moluscos de água doce a toxicidade do alumínio depende da espécie, estágio de desenvolvimento, composição química da água⁷ e principalmente, o pH.

O meio ambiente contém metais pesados, resultantes do uso de métodos químicos em processos industriais, agrícolas e pecuárias¹⁴, aos quais os moluscos de uma maneira geral estão expostos. Alguns metais como arsênio, berílio, cádmio, cromo, chumbo, mercúrio e níquel são reconhecidamente imunotóxicos, enquanto outros mostram efeitos importantes para as funções celulares, e podem ser considerados como imunomoduladores essenciais para as funções imunológicas, como ferro, zinco, cobre e manganês²⁵. Alguns metais necessitam de uma ingestão adequada para não provocar disfunções no metabolismo dos outros⁶. Assim, uma dieta deficiente de níquel, tem sido associada a distúrbios da absorção de ferro e disfunções no metabolismo do cálcio e zinco^{24 32}. O cádmio, presente em pequenas quantidades no ar, água e solo, pode ser ingerido pelos moluscos e interferir na modulação da sua resposta imune¹⁸. Dessa forma, seu efeito poderá interferir sobre a função dos hemócitos, que em última análise exercem papel fagocitário. O aumento dos níveis de alumínio no ecossistema, resulta em efeitos tóxicos para peixes e plantas²⁷, sua ingestão em excesso provoca diminuição na absorção de cálcio e ferro, que para os moluscos, comprometeria a formação da concha e disfunção na hemolinfa respectivamente^{2 11}.

O ferro, cobre, zinco, selênio e manganês estão entre os elementos essenciais na manutenção da homeostase celular, incluindo o sistema imunológico^{24 27}. Várias enzimas precisam desses metais como co-fatores para suas funções, e, de modo geral, sabemos que esses metais são utilizados em pequenas quantidades e estão presentes nas dietas. Como são essenciais, a deficiência pode determinar disfunções imunológicas, enquanto a superdosagem pode estabelecer estados tóxicos, nem sempre claros quanto ao papel imunossupressor. Dessa forma, a carência de ferro, resulta em produção reduzida de anticorpos, enquanto o excesso provoca tanto deficiência como aumento da função humoral²⁰. A carência de cobre leva a uma deficiência humoral, mas as conseqüências da ingestão em excesso não está bem esclarecido. Quanto ao zinco, parece evidente e essencial a sua função para o sistema imunológico, enquanto a sua carência, está associada à imunodeficiência do sistema humoral, celular e fagocítico²⁴.

A importância dos metais na vida de muitos organismos é fato comprovado, e, dessa forma, os nossos resultados procuraram mostrar de forma quantitativa, possíveis elevações ou declínios nos níveis de alguns metais presentes na hemolinfa do caramujo Biomphalaria glabrata, comparando os resultados entre caramujos infectados e não-infectados.

Concluímos, que os metais parecem não ser determinantes, no processo de defesa desses organismos, no que se refere a uma maior ou menor quantidade dos mesmos, durante a presença do parasita S. mansoni nos tecidos do seu hospedeiro B. glabrata.

Recebido para publicação em 31/8/2004

Aceito em 15/12/2004

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  30 Mar 2005
• Data do Fascículo
  Abr 2005

Histórico

• Aceito
  15 Dez 2004
• Recebido
  31 Ago 2004