Caracterização molecular do HTLV-1 em pacientes com paraparesia espástica tropical/mielopatia associada ao HTLV-1 em Belém, Pará

Souza, Lucinda A.; Lopes, Ivina G.L.; Maia, Eduardo Leitão; Azevedo, Vânia N.; Machado, Luiz Fernando A.; Ishak, Marluísa O.G.; Ishak, Ricardo; Vallinoto, Antonio Carlos R.

doi:10.1590/S0037-86822006000500017

Resumos

O presente estudo avaliou a ocorrência da infecção pelo HTLV-1 e seus subtipos em amostras de sangue de pacientes com diagnóstico clínico de paraparesia espástica tropical/mielopatia associada ao Htlv-1. A detecção da infecção pelo HTLV realizou-se através de testes sorológico e molecular. Cinco amostras estavam infectadas pelo HTLV-1 do subtipo Cosmopolita, subgrupo Transcontinental. Os resultados obtidos confirmam a ocorrência de infecção pelo HTLV-1 em pacientes com diagnóstico clínico de paraparesia espástica tropical/mielopatia associada ao Htlv-1em Belém, Pará.

Paraparesia espástica tropical; Caracterização molecular

The present study evaluated the occurrence of HTLV-1 and its subtypes in blood samples of patients presenting symptoms of tropical spastic paraparesis/HTLV-1 associated myelopathy. The detection of HTLV infection was performed by serological and molecular assays. Five patients were infected by HTLV-1 of the Cosmopolitan subtype, subgroup Transcontinental. The results confirm the occurrence of HTLV-1 infection among patients with clinical diagnosis of tropical spastic paraparesis/HTLV-1 associated myelopathy in Belém, Pará.

Tropical spastic paraparesis; Molecular characterization

COMUNICAÇÃO COMMUNICATION

Caracterização molecular do Htlv-1 em pacientes com paraparesia espástica tropical/mielopatia associada ao Htlv-1 em Belém, Pará

Molecular characterization of HTLV-1 among patients with tropical spastic paraparesis/HTLV-1 associated myelopathy in Belém, Pará

Lucinda A. Souza^I; Ivina G.L. Lopes^I; Eduardo Leitão Maia^II; Vânia N. Azevedo^I; Luiz Fernando A. Machado^I; Marluísa O.G. Ishak^I; Ricardo Ishak^I; Antonio Carlos R. Vallinoto^I

^ILaboratório de Virologia, do Departamento de Patologia do Centro de Ciências Biológicas do Universidade Federal do Pará, Belém, PA

^IIHospital Universitário João de Barros Barreto da Universidade Federal do Pará, Belém, PA

^{Endereço para correspondência} Endereço para correspondência: Dr. Antonio Carlos R. Vallinoto Rua Oliveira Belo 238/1002, Umarizal 66050-380 Belém, PA Telefax: 55 91 3201-7587 e-mail: vallinoto@ufpa.br

RESUMO

O presente estudo avaliou a ocorrência da infecção pelo HTLV-1 e seus subtipos em amostras de sangue de pacientes com diagnóstico clínico de paraparesia espástica tropical/mielopatia associada ao Htlv-1. A detecção da infecção pelo HTLV realizou-se através de testes sorológico e molecular. Cinco amostras estavam infectadas pelo HTLV-1 do subtipo Cosmopolita, subgrupo Transcontinental. Os resultados obtidos confirmam a ocorrência de infecção pelo HTLV-1 em pacientes com diagnóstico clínico de paraparesia espástica tropical/mielopatia associada ao Htlv-1em Belém, Pará.

Palavras-chaves: Paraparesia espástica tropical/mielopatia associada ao Htlv-1. Caracterização molecular.

ABSTRACT

The present study evaluated the occurrence of HTLV-1 and its subtypes in blood samples of patients presenting symptoms of tropical spastic paraparesis/HTLV-1 associated myelopathy. The detection of HTLV infection was performed by serological and molecular assays. Five patients were infected by HTLV-1 of the Cosmopolitan subtype, subgroup Transcontinental. The results confirm the occurrence of HTLV-1 infection among patients with clinical diagnosis of tropical spastic paraparesis/HTLV-1 associated myelopathy in Belém, Pará.

Key-words: Tropical spastic paraparesis/HTLV-1 associated myelopathy. Molecular characterization.

O vírus linfotrópico de células T humanas 1 (HTLV-1) é um retrovírus associado a patologias humanas como leucemia/linfoma de células T do adulto (LLcTA) e paraparesia espástica tropical/mielopatia associada ao HTLV (PET/MAH)¹⁷. O HTLV-1 tem sido também associado a casos de polimiosite, poliartrite e uveíte^{12 13 14 15}.

A paraparesia espástica tropical/mielopatia associada ao HTLV (PET/MAH) é uma doença desmielinizante crônica e progressiva associada à infecção pelo HTLV-1 e que afeta predominantemente a coluna vertebral. Relata-se que esta doença afeta entre 0,2 e 5% dos indivíduos infectados na quarta década de vida^{7 25}.

Além disso, uma síndrome neurológica similar a PET/MAH tem sido descrita em raros pacientes portadores da co-infecção HIV-1/HTLV-2¹⁹ e pelo menos um paciente infectado com HTLV-2 já foi identificado com uma doença neurodegenerativa progressiva crônica clinicamente indistinguível de PET/MAH^{6 21}.

Embora a ocorrência de PET/MAH seja elevada em algumas áreas geográficas, até o presente momento são raras as informações acerca das características moleculares do HTLV-1 que possam justificar a ocorrência de apenas 1 a 5% dos indivíduos infectados apresentarem PET/MAH. Assim, o presente estudo teve como objetivo investigar o perfil molecular do HTLV-1 infectando pacientes apresentando sintomas de PET/MAH atendidos no Hospital Universitário João de Barros Barreto da Universidade Federal do Pará.

Dez pacientes apresentando distúrbios neurológicos, atendidos no Hospital Universitário João de Barros Barreto, foram submetidos a exames neurológicos. Cinco tiveram diagnóstico clínico de distúrbio neurodegenerativo típico de PET/MAH, de acordo com critérios clínicos estabelecidos pelo Programa Nacional de DST e Aids do Ministério da Saúde².

Após o diagnóstico clínico, os pacientes foram encaminhados ao Laboratório de Virologia do Centro de Ciências Biológicas da Universidade Federal do Pará, onde alíquotas de sangue foram coletadas em tubos contendo EDTA, com posterior separação de plasma e de leucócitos (células mononucleadas do sangue periférico - PBMC), que foram congelados a -20ºC até o momento do uso.

Os soros foram testados para a presença de anti-HTLV-1/2, usando-se um ensaio imunoenzimático, ELISA (HTLV-1/2 Ab-Capture ELISA Test System, Ortho Diagnostic Systems Inc., USA).

A extração de DNA foi realizada, a partir de PBMC das amostras sororreativas para anti-HTLV-1/2, usando-se o do método de extração de DNA total, de acordo com o protocolo da Puregene, Gentra Systems, Inc,USA.

A reação de amplificação gênica foi efetuada em duas etapas (nested PCR), para a amplificação de 159pb da região pX do DNA proviral do HTLV-1/2, seguida da digestão enzimática com TaqI para a caracterização do tipo viral²³. O subtipo viral foi determinado a partir das amostras caracterizadas como HTLV-1 utilizando-se uma nested PCR e o seqüenciamento 788pb do segmento 5'LTR como descrito previamente¹⁰.

Após a purificação do produto da região 5'LTR, o DNA foi submetido ao seqüenciamento automático usando-se o kit da ABI PRISM^TM Dye Terminator Cycle Sequencing (Perkin Elmer, USA) usando-se o equipamento ABI 373 DNA Sequencer (Perkin Elmer, USA).

O alinhamento das seqüências nucleotídicas da região 5'LTR, foi efetuada usando o programa Clustal X²². O grau de divergência genética, a partir das seqüências obtidas e o padrão do mapa de restrição foi determinado usando-se o programa BioEdit 5.09v⁴. O perfil filogenético das cepas foi realizado por meio do método de agrupamento de vizinhos (Neighbor-Joining - NJ) utilizando o modelo evolutivo de Kimura-2 parâmetros com o auxílio do programa MEGA  Molecular Evolutionary Genetics Analysis versão 3.1⁹. Para testar a confiabilidade da análise foram utilizadas 1.000 réplicas de bootstrap.

Das 10 amostras de pacientes investigadas, apenas cinco (50%) apresentaram sororeatividade para anti-HTLV-1/2. A análise de região pX identificou a infecção pelo HTLV-1. O seqüenciamento da região 5'LTR caracterizou as cepas como pertencentes ao subtipo Cosmopolita, subgrupo Transcontinental (Figura 1).

Com a análise das seqüências nucleotídicas foi possível verificar elevada similaridade entre as amostras e com amostras isoladas de pacientes assintomáticos, cujas seqüências estão descritas na literatura, não tendo sido determinado qualquer padrão molecular característico associado a PET/MAH. O mapa de restrição das amostras, obtido a partir da análise das seqüências nucleotídicas, demonstrou similaridade de 66,7% entre as mesmas.

Os resultados obtidos no presente trabalho confirmam, por métodos moleculares, a ocorrência de infecção pelo HTLV-1 em pacientes portadores de diagnóstico clínico de PET/MAH em Belém (Pará) e corroboram achados sorológicos anteriores que descreviam a associação da infecção pelo HTLV-1 com PET/MAH na região⁵e no Brasil^{1 3 20}.

A identificação de todas as amostras como pertencentes ao subtipo Cosmopolita, subgrupo Transcontinental, está de acordo com estudos anteriores que demonstram a maior freqüência deste subtipo viral em pacientes com PET/MAH no Brasil, o qual é predominante, também, em casos assintomáticos^{8 20}. Ademais, esse subgrupo tem sido o único encontrado, até então, infectando indivíduos da área urbana e rural do Estado do Pará^{10 16}, à exceção de imigrantes japoneses residentes em Tomé-Açú, onde o subgrupo Japonês também foi encontrado²⁴.

Este subgrupo viral foi, também, encontrado em pacientes chilenos com PET/MAH¹⁸, o que corrobora estudos anteriores que relatam que a maioria das cepas de HTLV-1 isoladas da América do Sul pertence ao subgrupo Transcontinental^{11 26}.

As comparações das seqüências nucleotídicas da região 5'LTR e do mapa de restrição entre as amostras com PET/MAH e entre estas com cepas isoladas de pacientes assintomáticos descritos na literatura, revelou elevada similaridade não havendo diferenças significativas que possam justificar a patogenicidade do vírus e, o fato de que apenas 0,2 a 5% dos indivíduos infectados desenvolvem a PET/MAH^{7 25}. Contudo, somente um estudo envolvendo um número maior de indivíduos com diagnóstico desta patologia poderá confirmar ou não essa hipótese.

Recebido para publicação em 31/01/2006

Aceito em 10/8/2006

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Endereço para correspondência:

Dr. Antonio Carlos R. Vallinoto

Rua Oliveira Belo 238/1002, Umarizal

66050-380 Belém, PA

Telefax: 55 91 3201-7587

e-mail:

vallinoto@ufpa.br

Datas de Publicação

Publicação nesta coleção
04 Dez 2006
Data do Fascículo
Out 2006

Histórico

Aceito
10 Ago 2006
Recebido
31 Jan 2006

This work is licensed under a Creative Commons Attribution-NonCommercial 4.0 International License.

[1] 1. Castro LHM, Chaves CJ, Callegaro D, Nóbrega JPS, Scaff M. HTLV-I associated myelopathy in Brazil, a preliminary report. Arquivos de Neuropsiquiatria 47: 501-502, 1989.

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