Comportamento de amostras ambientais e clínicas de Cryptococcus neoformans frente a fungicidas de uso agronômico e ao fluconazol

Behaviour azole fungicide and fluconazole in Cryptococcus neoformans clinical and environmental isolates

ARTIGO ARTICLE

Comportamento de amostras ambientais e clínicas de Cryptococcus neoformans frente a fungicidas de uso agronômico e ao fluconazol

Behaviour azole fungicide and fluconazole in Cryptococcus neoformans clinical and environmental isolates

Elislene Dias Drummond; Juliana Quero Reimão; Amanda Latercia Tranches Dias; Antônio Martins de Siqueira

Laboratório de Microbiologia, Departamento de Ciências Biológicas, Universidade Federal de Alfenas, Alfenas, MG

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

Avaliou-se a atividade de fungicidas azólicos de uso agronômico (epoxiconazol, difenoconazol e ciproconazol) em comparação ao antifúngico de uso terapêutico fluconazol sobre 23 amostras ambientais de Cryptococcus neoformans var neoformans isoladas de fezes de pombos, as quais foram coletadas em fazendas com práticas agrícolas empregando compostos azólicos e 11 amostras clínicas isoladas de pacientes portadores de criptococose. Os testes de sensibilidade foram realizados pela técnica de diluição em agar. A concentração inibitória mínima capaz de inibir 50% dos isolados ambientais (CIM 50) foi de 6,0µg/mL para epoxiconazol, 1,0µg/mL para difenoconazol, 2,0µg/mL para ciproconazol e 64,0µg/mL para fluconazol. Entre os isolados clínicos os valores de CIM 50 foram 2,0µg/mL, 0,38µg/mL, 1,0µg/mL e 16,0µg/mL para epoxiconazol, difenoconazol, ciproconazol e fluconazol, respectivamente. Os valores de CIM 50 em relação aos isolados de origem ambiental foram maiores do que os valores para os isolados de origem clínica. Em nosso estudo, frente ao mesmo antifúngico, as amostras ambientais apresentaram comportamento significativamente diferente em relação às amostras clínicas (p < 0,05). Diferenças (p<0,05) também foram observadas entre os valores de concentração inibitória apresentados pelo fluconazol e os outros antifúngicos de uso agronômico tanto no grupo dos isolados ambientais quanto clínicos.

Palavras-chaves:Cryptococcus neoformans. Fungicidas azólicos. Resistência. Isolados ambientais. Isolados clínicos.

ABSTRACT

The activity of azole fungicides for agronomical use (epoxiconazole, difenoconazole and cyproconazole) was evaluated in comparison with the therapeutic antifungal agent fluconazole, on 23 environmental samples of Cryptococcus neoformans var neoformans isolated from pigeon feces that were collected from farms with agricultural practices using azole compounds, and on 11 clinical samples isolated from patients with cryptococcosis. Sensitivity tests were performed using the agar dilution technique. The minimum inhibitory concentration capable of inhibiting 50% of the environmental isolates (MIC 50) was 6.00µg/ml to epoxiconazole, 1.00µg/ml for difenoconazole, 2.00µg/ml for cyproconazole and 64.00µg/ml for fluconazole. Among the clinical isolates the MIC 50 values were 2.00µg/ml, 0.38µg/ml, 1.00µg/ml and 16.00µg/ml for epoxiconazole, difenoconazole, cyproconazole and fluconazole, respectively. The MIC 50 values for environmental isolates were greater than the MIC 50 values for clinical isolates. In our study, in relation to the same antifungal agent, the environmental samples presented significantly different behaviour in relation to the clinical samples (p<0.05). Differences in the MIC values (p<0.05) presented by fluconazole and the other antifungal agents for agronomical use, both in the environmental isolates and in the clinical isolates, were also observed.

Key words:Cryptococcus neoformans. Azole fungicides. Resistance. Environmental isolates. Clinical isolates.

Cryptococcus neoformans é levedura capsulada, agente causador da criptococose, infecção grave que afeta principalmente pacientes imunocomprometidos. São descritas duas variedades e quatro sorotipos da levedura: C. neoformans var neoformans (sorotipos A e D), com distribuição mundial e responsável pela maioria das infecções associadas ao HIV; e Cryptococcus neoformans var gattii (sorotipos B e C) limitado à regiões tropicais e subtropicais, o qual freqüentemente causa infecção em indivíduos imucompetentes⁴. A morbidade e a mortalidade por C. neoformans tem aumentado com o advento da síndrome da imunodeficiência adquirida (AIDS).

Os compostos azólico são substâncias químicas usadas tanto na medicina quanto na agricultura; atuam inibindo a enzima lanosterol-14a-desmetilase, interrompendo assim a biossíntese do ergosterol, componente essencial à formação da membrana plasmática da célula fúngica¹¹. Até os anos 90, a resistência adquirida aos antifúngicos azólicos era incomum, porém, recentemente emergiram distintos padrões da mesma, provavelmente devido ao uso freqüente do fluconazol⁵.

Como C. neoformans é um fungo cosmopolita que pode ser encontrado em diferentes nichos em áreas ambientais, presume-se interferência direta da utilização de fungicidas azólicos nas lavouras com o aumento da resistência aos azóis de uso terapêutico. Diante disso, propõe-se verificar o comportamento de amostras ambientais e clínicas de C. neoformans em relação a fungicidas azólicos de uso agronômico e ao fluconazol.

MATERIAL E MÉTODOS

Nos ensaios, foram utilizadas 23 amostras de C. neoformans var. neoformans obtidas de isolados de fezes de pombos, coletadas de fazendas no município de Alfenas, MG com práticas agrícolas empregando fungicidas azólicos e 11 amostras clínicas de C. neoformans var. neoformans provenientes do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo (ICB/USP), as quais foram isoladas de pacientes portadores da micose. As amostras foram mantidas em agar Sabouraud a 25°C a partir de repiques a cada dois meses, na micoteca do laboratório de microbiologia da Universidade Federal de Alfenas.

Os fungicidas azólicos usados nas lavouras da região de Alfenas, MG, de origem comercial, e selecionados para o estudo foram: epoxiconazol (Opus®), difenoconazol (Score®) e ciproconazol (Alto 100®). O antifúngico de uso terapêutico usado foi o fluconazol, adquirido como droga pura (Pfizer®).

As amostras foram analisadas segundo a técnica de diluição em agar proposta por Alves e Cury¹, em que as substâncias foram diluídas em caldo Yeast Nitrogen Base Fosfate® (YNBP) e posteriormente em ágar YNBP, resultando em concentrações finais compreendidas entre 0,25µg/mL e 128 µg/mL. Os experimentos foram realizados em duplicatas e a concentração inibitória mínima (CIM) foi determinada a partir da observação da presença ou ausência de crescimento do microrganismo após 48 horas de incubação à temperatura ambiente. A concentração inibitória mínima considerada refere-se à média, entre as duplicatas, das menores concentrações que inibiram o crescimento da levedura. A análise estatística foi realizada empregando-se test T de Student com 95% de confiança e análise de variância.

RESULTADOS

Entre as amostras de leveduras de origem ambiental, o fungicida epoxiconazol apresentou CIM 50 de 6µg/mL. Para difenoconazol a CIM 50 foi de 1µg/mL e para ciproconazol, 2µg/mL. Na avaliação do fluconazol, a CIM 50 foi de 64µg/mL. Para os isolados clínicos, os valores de CIM 50 encontrados foram, respectivamente, 2µg/mL, 0,38µg/mL, 1µg/mL e 16µg/mL. A relação de tais dados encontra-se na Tabela 1.

Pela análise de variância entre as amostras ambientais, a concentração capaz de inibir o crescimento das leveduras não revelou diferença estatisticamente significativa (p>0,05) dentre os compostos de uso agronômico. A atividade antifúngica expressa pelo fluconazol apresentou diferença estatistica significante (p < 0,05) em relação aos compostos de uso agronômico, de acordo com teste T de Student e o método Kolmogorov e Smirnov, tanto sobre isolados clínicos quanto ambientais.

DISCUSSÃO

A sensibilidade in vitro de Cryptococcus neoformans em relação a diferentes antifúngicos tem sido estudada por diversos autores^2,6,8,9. Entretanto, há poucos dados comparativos de valores de CIM entre isolados clínicos e ambientais. Em nosso estudo, frente ao mesmo antifúngico, as amostras ambientais apresentaram comportamento significativamente diferente em relação às amostras clínicas (p < 0,05) conforme teste T de Student com 95% de intervalo de confiança. Valores mais elevados de CIM 50 foram observados para os isolados de origem ambiental.

A exposição freqüente aos fungicidas azólicos usados nas lavouras pode proporcionar a seleção de C. neoformans de modo a torná-lo menos sensível à ação de tais substâncias⁷. Nossos resultados não comprovaram o desenvolvimento de resistência de C. neoformans aos compostos azólicos e ao mesmo tempo, a diversidade observada em relação aos perfis de sensibilidade pode ser devido à diversidade genética dos isolados bem como à distância geográfica entre os locais de isolamento dos mesmos.

Considerando-se, isoladamente, a atividade do antifúngico fluconazol sobre os isolados clínicos e ambientais, nossos resultados apresentaram-se diferentes dos observados por outros autores^{3 10}. Porém, a comparação direta de valores de CIM entre estudos é dificultada devido à diversidade de métodos de avaliação da sensibilidade antifúngica (diluição em agar, difusão em disco ou diluição em caldo) e às suas variações individuais (inóculo, grau de aeração, temperatura, atmosfera e período de incubação).

Conforme apresentado na Tabela 1, a CIM 50 do fluconazol tanto em relação aos isolados clínicos quanto ambientais foi superior às apresentadas pelos compostos de uso agronômico. De modo geral, os antifúngicos utilizados na prática médica apresentam menor toxicidade ao paciente do que aqueles empregados no combate das doenças fúngicas das lavouras, aos quais o indivíduo pode se expor involuntariamente. Entretanto, a eficiência como antifúngico parece ser maior nos compostos azólicos de uso agronômico; de acordo com os resultados obtidos, tais compostos apresentaram grau de inibição mais elevado em comparação ao azólico de uso terapêutico fluconazol tanto sobre os isolados de origem clínica quanto ambiental.

Recebido para publicação em 12/6/2006

Aceito em 8/2/2007

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  01 Jun 2007
• Data do Fascículo
  Abr 2007

Histórico

• Aceito
  08 Fev 2007
• Recebido
  12 Jun 2006