Identificação da Leptospira interrogans sorovar pomona em camundongos geneticamente selecionados, para a alta e baixa produção de anticorpos, através da técnica de imunoperoxidase em tecido renal e isolamento bacteriano em meio de Fletcher

Identification of Leptospira interrogans serovar pomona in mice genetically selected for high and low antibody production, by means of the immunoperoxidase technique in renal tissue and bacterial isolation in Fletcher medium

ARTIGO ARTICLE

Identificação da Leptospira interrogans sorovar pomona em camundongos geneticamente selecionados, para a alta e baixa produção de anticorpos, através da técnica de imunoperoxidase em tecido renal e isolamento bacteriano em meio de Fletcher

Identification of Leptospira interrogans serovar pomona in mice genetically selected for high and low antibody production, by means of the immunoperoxidase technique in renal tissue and bacterial isolation in Fletcher medium

Maria Cristina Santos Haanwinckel^I,II,III; Juliana Semin Cavalheiro^I,II; Silvio Luis de Oliveira^I,II

^IDepartamento de Doenças Tropicais e Diagnóstico por Imagem, Faculdade de Medicina, Universidade Estadual Paulista, Botucatu-SP

^IIDepartamento de Microbiologia e Imunologia, Instituto de Biociências, Universidade Estadual Paulista, Botucatu-SP

^IIIBolsista CNPq

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

O presente trabalho teve por objetivo identificar a presença da Leptospira interrogans sorovar pomona em camundongos geneticamente selecionados para a alta e baixa resposta a anticorpos. Todos os animais foram submetidos ao isolamento bacteriano, imunohistoquímica (imunoperoxidase) em cortes de tecido renal e coloração através da hematoxilina-eosina. A técnica de imunoperoxidase apresentou-se pouco mais sensível em relação ao cultivo, entretanto, ambas foram bons parâmetros de identificação do agente. Presença de lesões renais mais intensas ocorreram em períodos em que houve maior número de bactérias isoladas em meio de cultivo. Camundongos da linhagem HIV-A conseguiram eliminar as leptospiras com maior eficiência e rapidez em relação as linhagem LIV-A, entretanto o estudo demonstrou que ambas linhagens da seleção IV-A foram eficientes em controlar o processo infeccioso.

Palavras-chaves:Leptospira sorovar pomona. Camundongos Biozzi. Imunoperoxidase. Aspectos imunológicos.

ABSTRACT

The present work had the objective of identifying the presence of Leptospira interrogans serovar pomona in mice that had been genetically selected for high and low response to antibodies. All the animals were subjected to bacterial isolation, immunohistochemical analysis (immunoperoxidase) in renal tissue sections and hematoxylin-eosin staining. The immunoperoxidase technique was little more sensitive than culturing, but both were good parameters for agent identification. More severe renal lesions were present at times when there were greater numbers of bacteria isolated in culture medium. Mice of the lineage HIV-A were able to eliminate the Leptospira more efficiently and faster than the lineage LIV-A could. However, the study demonstrated that both lineages of the IV-A selection were efficient in controlling the infectious process.

Key-words: Leptospira serovar pomona. Biozzi mice. Immunoperoxidase. Immunological characteristics.

A aglutinação microscópica com antígenos vivos é o procedimento mais utilizado na rotina diagnóstica²¹. Entretanto, técnicas baseadas em detecção histológica como a imunohistoquímica dentre elas, a imunoperoxidase, vêm sendo utilizadas principalmente em pesquisas epidemiológicas.

Alguns estudos¹⁴ comparando a imunoperoxidase e o cultivo na detecção de leptospiras em rins, verificaram 100% e 77,5% de positivos respectivamente, relacionando a menor eficiência do cultivo a reação inflamatória e presença de contaminantes.

Os hamsters e cobaias são animais mais utilizados em pesquisas sobre os diversos sorovares da leptospira, entretanto, outros modelos vêm sendo utilizados.

Algumas infecções têm sido estudadas utilizando modelos experimentais para a boa (high) e má (low) resposta a anticorpos, com ênfase na resistência das linhagens H em infecções extracelulares¹⁹, ou maior resistência das linhagens L contra patógenos intracelulares⁷.

Esse estudo teve por objetivo investigar o comportamento de linhagens de camundongos selecionados geneticamente para boa ou má resposta de anticorpos (seleção IV-A) quando infectados experimentalmente com a Leptospira sorovar pomona, identificando leptospiras em tecidos renais através da técnica de imunoperoxidase e isolamento em meio de cultivo.

MATERIAL E MÉTODOS

Amostra. Foram utilizados 60 camundongos machos das linhagens high e low da seleção IV-A com quatro a oito semanas de idade infectados experimentalmente com o sorovar pomona. Controles negativos não infectados foram constituídos por 24 animais pertencentes às mesmas linhagens.

Os sacrifícios foram realizados em períodos determinados e após a colheita do sangue, os rins, foram retirados e utilizados nas técnicas histológica de hematoxilina-eosina e imunoperoxidase O projeto foi aprovado pelo comitê de ética experimental da Faculdade de Medicina de Botucatu (Protocolo-383/2004).

Técnica de soroaglutinação. A pesquisa de anticorpos anti-Leptospira interrogans sorovar pomona foi realizada através da técnica de aglutinação microscópica em lâmina segundo técnica de Faine¹² em soros obtidos dos camundongos controle e infectados.

Isolamento. Fragmentos de rins dos animais necropsiados foram submetidos ao cultivo através de técnica de diluições seriadas^{20 22}.

Imunoperoxidase indireta. Os cortes renais foram submetidos à reação de imunoperoxidase segundo técnica modificada de Ellis e cols¹¹, para a pesquisa de antígenos leptospiricos do sorogrupo pomona.

A leitura das lâminas foi realizada em microscópio óptico (Leika) com ocular de 10X e objetiva de 40X e 100X (imersão) e condensador de campo claro.

Controle de especificidade. Objetivando a redução de possíveis reações inespecíficas o anticorpo foi mantido pré-incubado em suspensão de tecido renal de hamsters sadios, para que as imunoglobulinas fossem conjugadas de forma inespecífica aos determinantes antigênicos presentes no tecido renal, permanecendo livre o anticorpo antileptospira sorovar pomona para a reação antígeno-anticorpo. Em seguida, três áreas das lâminas destinadas aos cortes foram demarcadas com extensão aproximada de 0,5 centímetro quadrado com o auxílio de caneta para marcação imunohistoquímica Dakopen (DAKO Laboratories). Na primeira área demarcada foi adicionado o anticorpo primário¹¹, na segunda o anticorpo pré-absorvido com as leptospiras formalizadas^{3 11 24} e na terceira área omitiu-se o anticorpo primário^{11 26}.

Técnica histológica de hematoxilia-eosina. Os fragmentos renais também foram submetidos à técnica de hematoxilina-eosina, segundo Behmer cols⁶.

Para comparação das técnicas de cultivo e imunoperoxidase utilizou-se a análise de concordância Kappa e teste de proporções²⁸. Na análise sobre a produção de anticorpos foi utilizada a prova não paramétrica de Kruskal-Wallis para amostras independentes

RESULTADOS

A analise dos títulos sorológicos presentes na Figura 1 revela que não houve diferença estatística significativa entre as linhagens geneticamente selecionadas, embora aparentemente tenham sido detectados níveis de anticorpos mais elevados na linhagem H_IV-A quando comparada a linhagem L_IV-A, principalmente entre o sétimo e o vigésimo primeiro dias pós-inoculação. A partir do vigésimo oitavo dia houve uma acentuada elevação dos títulos.

Nos cortes histológicos corados pela imunoperoxidase, a leptospira foi detectada formando massas de aglomerados filiformes de coloração amarronzada destacados do fundo azul corado pela hematoxilina (Figura 2).

Houve variação na intensidade de coloração principalmente a partir do 14º dia pós-inoculação com menor intensidade de coloração em lâminas que apresentavam número reduzido de antígenos leptospíricos.

Comparando-se o cultivo com a imunoperoxidase houve maior número de amostras positivas nos animais da linhagem H_IV-A em relação à linhagem L_IV-A entre o 4° e 7° dias pós-inoculação (Tabela 1). Entretanto houve diferença estatística significativa (p< 0.05) apenas no 4º dia pós-inoculação.Nos períodos finais os animais da linhagem L_IV-A passaram a apresentar maior número de positivos em relação à linhagem H_IV-A.

Foi possível observar boa concordância entre as técnicas de identificação da leptospira na linhagem H_IV-A apenas no 14º dia pós-inoculação (Tabela 2) o mesmo ocorrendo com a linhagem L_IV-A no 7º dia (Tabela 3). Em outros períodos as concordâncias foram consideradas moderadas (Tabela 4 e 5), ou fracas (Tabela 6).

A intensidade e o grau de alterações celulares observadas nos tecidos dos camundongos infectados com o sorovar pomona através da coloração de hematoxilina e eosina, se caracterizaram por processo degenerativo a partir do quarto dia pós-inoculação, estendendo-se até o vigésimo oitavo dia de infecção, mesmo em presença de resultados negativos no isolamento em meio de cultivo, variando, entretanto, em diferenças de intensidade das lesões presentes. Entre o quarto e o sétimo dia pós-inoculação foram observadas algumas áreas de degeneração hidrópica em presença de infiltrados inflamatórios, sobretudo polimorfonucleares principalmente próximos a vasos sanguíneos. Entre o quarto e o décimo quarto dia, foi observada com mais intensidade nefrite intersticial caracterizada por acúmulo de células mononucleares e entre o quarto e o sétimo dia pós-inoculação as alterações inflamatórias aparentemente foram mais freqüentes nos animais das linhagens H_IV-A. Entretanto, nos animais maus respondedores a presença de lesões se estendeu até o vigésimo oitavo dia comparando-se aos animais bons respondedores. Nenhum camundongo controle negativo apresentou quaisquer alterações histopatológicas.

DISCUSSÃO

Linhagens de camundongos selecionadas quanto à diferenciação na resposta humoral podem apresentar variáveis graus de resposta antigênica frente a antígenos de multiplicação intracelular e/ou extracelular.

Quanto à produção de anticorpos contra o sorovar pomona nas linhagens H_IV-A e L_IV-A, não houve diferenças significativas, apesar dos animais H_IV-A produzirem mais anticorpos entre os períodos de 7 a 21 dias. Esses resultados são parcialmente discordantes de Marinho cols¹⁸. Estudando a resposta imune contra o sorovaricterohaemorrhagiae,no qual, a linhagem H_IV-A produziu resposta estatisticamente significante em relação à linhagem L_IV-A, mantendo o efeito multiespecífico normalmente observado nessas linhagens.

Entretanto, são concordantes com outros experimentos¹⁹ que não observaram diferenças significativas na produção de anticorpos entre as linhagens da seleção I, quando infectadas com a Klebsiella pneumoniae.

Durante o processo infeccioso a formação de células fagocitárias e anticorpos opsonizantes são importantes no controle da enfermidade, dificultando a permanência e adaptação das leptospiras no hospedeiro. No presente estudo, foi observado que a formação de anticorpos aglutinantes ocorreu de forma aparentemente semelhante entre as duas linhagens, embora tenham sido observados valores discretamente mais elevados entre os animais da linhagem high em relação a low, determinando resposta imune multiespecífica.

A presença de imunoglobulinas provavelmente reduziu a capacidade das leptospiras em permanecer de forma viável em tecidos e órgãos, visto por resultado presente nos cultivos, concordantes com trabalhos observando a produção de anticorpos homólogos IgG contra a Leptospira interrogans sorovar copenhageni e saprófita isola sacra 1⁵.

Camundongos da linhagem H_IV-A conseguiram eliminar as leptospiras com maior eficiência e rapidez em relação as linhagem L_IV-A, tal fato pode estar associado à presença de complexos imunes e posterior formação de anticorpos circulantes¹.

Com relação a imunoperoxidase, a menor intensidade de coloração em algumas amostras pode estar relacionada à distribuição ao acaso das leptospiras nos tecidos fixados, como também observado por Taylor²⁶ e Ellis cols¹¹, ou a mecanismos de resistência dessas linhagens.

O controle das reações inespecíficas foi eficiente em confirmar a especificidade do anticorpo primário. Resultados também verificados por outros estudos ^{3 11 25 27}.

Analisando os resultados obtidos parece ter havido maior eficiência da técnica imunohistoquímica fato que pode estar relacionado a dificuldades inerentes ao isolamento, como sensibilidade das leptospiras em meio de cultivo, ou quantidades ineficientes do agente fator que pôde ser observado em outros estudos⁸ analisando técnicas imunológicas e o cultivo na identificação da Leptospira sorovar hardjo, como também em trabalhos comparando a imunohistoquímica com o cultivo na identificação da leptospira em tecidos renais de suínos e hamsters respectivamente^{14 23}.

Menor número de amostras positivas em fragmentos de tecidos renais dos camundongos L_IV-A em relação à linhagem H_IV-A, pode pressupor que mecanismos relacionados ao metabolismo acelerado de macrófagos na linhagem L_IV-A tenha favorecido a eliminação inicial mais eficiente da leptospira, entretanto pode também indicar que o rápido metabolismo possa impedir que macrófagos exibam determinantes antigênicos de forma adequada, resultando em resposta imune humoral menos eficiente, pelo menos no início do processo infeccioso e são dados concordantes com outros estudos^{2 7 13 15}.

Em estudos utilizando o sorovar icterohaemorrhagiae, camundongos L_IV-A apresentaram-se mais resistentes à infecção com total eliminação do parasita a partir do 14° dia de infecção no fígado e rins, enquanto animais H_IV-A apresentaram recuperação nesses órgãos até o 35° dia¹⁷.

Alguns estudos sugerem que embora possam estar aparentemente saudáveis, os camundongos são susceptíveis a colonização de alguns tipos de leptospiras, sendo que a capacidade de provocar lesões em tecidos é dependente de fatores ligados à adaptação dos microrganismos aos tecidos do hospedeiro¹⁶.

As alterações degenerativas apresentadas pelos animais infectados foram concordantes com estudos^{4 10} que referem proliferação de células inflamatórias principalmente nos períodos inicias da infecção.

A intensidade de lesões inflamatórias presentes nos animais H_IV-A coincide com a dificuldade inicial desses animais em processar e eliminar o agente infeccioso mais rapidamente em relação as linhagens L_IV-A como foi observado na recuperação, pois a presença da leptospira e infiltrados inflamatórios no tecidos pode contribuir para o agravamento das lesões, fato também observado por Chen⁹.

O estudo demonstrou que as linhagens da seleção IV-A foram eficientes em controlar o processo infeccioso, e parecem se comportar de forma diferenciada quando expostas aos diversos sorovares da Leptospira.

Os resultados comparados a trabalhos com outros sorovares demonstraram restrições na modificação de um caráter imunológico geneticamente selecionado, por um agente externo e não específico.

Camundongos da linhagem para a boa (H_IV-A) ou má (L_IV-A) resposta a anticorpos, podem ser úteis na investigação à cerca de mecanismos adaptativos dos sorovares aos diferentes hospedeiros, sendo que o reconhecimento dos hospedeiros de manutenção ou acidentais em relação a um sorovar caracteriza importante pesquisa epidemiológica quanto ao potencial infectante de determinadas espécies animais e do homem.

AGRADECIMENTOS

À Profa. Jane Megid e ao Prof. Hélio Langoni, do Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Pública da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade Estadual Paulista, Botucatu, SP. Ao Prof. Silvio Arruda Vasconcellos e a Bióloga Zenaíde Maria de Moraes, do Laboratório de Zoonoses Bacterianas do Departamento de Higiene Veterinária e Saúde Animal da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade de São Paulo, São Paulo, SP.

Recebido para publicação em: 04/07/2007

Aceito em: 16/10/2007

Apoio financeiro: Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico (CNPq).

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  08 Jan 2008
• Data do Fascículo
  Dez 2007

Histórico

• Recebido
  04 Jul 2007
• Aceito
  16 Out 2007