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Revista da Sociedade Brasileira de Medicina Tropical

Print version ISSN 0037-8682

Rev. Soc. Bras. Med. Trop. vol.41 no.3 Uberaba May/June 2008

http://dx.doi.org/10.1590/S0037-86822008000300003 

ARTIGO ARTICLE

 

Alta prevalência do genótipo 1 em portadores de hepatite C crônica em Belo Horizonte, MG

 

High prevalence of genotype 1 in individuals with hepatitis C in Belo Horizonte, MG

 

 

Carlos PeroneI; Dora Mendez del CastilloI; Gilsimary Lessa PereiraI; Nara de Oliveira CarvalhoI; José Nélio JanuárioI, II; Rosângela TeixeiraII, III

IFaculdade de Medicina, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG
IIDepartamento de Clínica Médica, Faculdade de Medicina, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG.
IIIInstituto Alfa de Gastroenterologia, Hospital das Clínicas, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo Horizonte, MG

Endereço para correspondência

 

 


RESUMO

O vírus da hepatite C é caracterizado pela significativa heterogeneidade genética e é atualmente classificado em seis genótipos principais e diversos subtipos. A determinação do genótipo do vírus tem importância na prática clínica para orientar o tratamento dos pacientes portadores de hepatite C crônica. A prevalência dos diferentes genótipos e subtipos do vírus da hepatite C não tem sido amplamente estudada em algumas regiões do Brasil. Neste estudo foram analisadas 788 amostras de pacientes portadores de hepatite C crônica atendidos nos Centros de Referência em Hepatites Virais de Belo Horizonte, entre 2002 e 2006. A genotipagem do vírus foi realizada por seqüenciamento direto da região 5' UTR. Adicionalmente, foi realizada análise filogenética incluindo todas as variantes genotípicas obtidas. Observou-se alta prevalência do genótipo 1 (78,4%; 1b [40,4%], 1a [37,5%] e 1a/b [0,5 %]), seguida pelo genótipo 3a (17,9%) e pelo 2b (3,1%). Foram identificadas três amostras (0,4%) com o genótipo 2a/c e duas amostras (0,2%) com o genótipo 4. A análise filogenética mostrou a segregação esperada das seqüências obtidas junto às seqüências de referência para os genótipos 1, 2, 3 e 4, exceto em duas amostras do genótipo 1a. A alta prevalência do genótipo 1 (78,4%), encontrada na população de Belo Horizonte é semelhante à previamente descrita em outras cidades, como Rio de Janeiro, mas superior à encontrada em São Paulo e no Sul do país. A presença de raras seqüências atípicas da região 5'UTR sugere a presença de variantes do vírus da hepatite C nesta população.

Palavras-chaves: Vírus da hepatite C/genética. Genótipo. Genoma viral. Filogenia.


ABSTRACT

The hepatitis C virus is characterized by significant genetic heterogeneity. It is currently classified into six main genotypes and several subtypes. Determining the genotype of the virus is important in clinical practice for guiding the treatment for individuals with chronic hepatitis C. The prevalence of different genotypes and subtypes of the hepatitis C virus has not been fully studied in some regions of Brazil. In this study, 788 samples from patients with chronic hepatitis C who were attended at the Viral Hepatitis Reference Centers in Belo Horizonte were analyzed between 2002 and 2006. The genotyping of the virus was performed by direct sequencing of the 5' UTR region. Additionally, phylogenetic analysis was performed, including all of the genotypic variants obtained. High prevalence of genotype 1 (78.4%; 1b [40.4%], 1a [37.5%] and 1a/b [0.5%]) was observed, followed by genotypes 3a (17.9%) and 2b (3.1%). Three samples were identified as genotype 2a/c (0.4%) and two as genotype 4 (0.2%). The phylogenetic analysis showed the expected segregation of the sequences obtained, with regard to the reference sequences for genotypes 1, 2, 3 and 4, except for two samples of genotype 1a. The high prevalence of genotype 1 (78.4%) found in this population from Belo Horizonte was similar to previous reports from other cities such as Rio de Janeiro, but it was higher than what has been described in São Paulo and in the south of the country. The presence of rare atypical sequences from the 5' UTR region suggests that variants in the hepatitis C virus exist in this population.

Key-words: Hepatitis C virus/genetics. Genotype. Viral genome. Phylogeny.


 

 

O vírus da hepatite C (VHC), um membro da família Flaviviridae clonado por Choo e cols, em 19898, é constituído por uma fita simples de RNA e caracteriza-se pela alta freqüência de mutações e heterogeneidade genômica2 38. Algumas regiões do genoma, como E1 e E2, são altamente variáveis, enquanto outras, como a região 5' não traduzida (5'UTR) são mais estáveis30 41 42. Tem-se descrito variações de até 51% na seqüência de aminoácidos da proteína E1 em diferentes isolados do VHC3. Estas variações na seqüência genômica ou de fragmentos genômicos permitiram classificar o vírus C em seis grandes grupos ou genótipos40. As cepas mais relacionadas dentro de cada genótipo (similaridade da seqüência de nucleotídeos entre 75% e 80%) são denominadas subtipos e são indicadas por letras38 39. Estes, por sua vez, apresentam um complexo de variantes genéticas com heterogeneidade na seqüência de nucleotídeos que varia de 1% a 9,2%. É possível que estas variantes, conhecidas como quasispecies, sejam resultantes de mutações acumuladas durante a replicação viral no curso da infecção crônica2 12.

A genotipagem do VHC constitui ferramenta essencial na prática clinica em razão de sua importância nas decisões terapêuticas. Os estudos clínicos têm demonstrado respostas virologicas variáveis ao tratamento da hepatite C crônica com interferon peguilado mais ribavirina com base na infecção por distintos genótipos. Assim, pacientes infectados pelo genótipo 1 apresentam respostas virologicas próximas de 50%, enquanto os infectados pelos genótipos 2 ou 3 têm mais chances de erradicar a infecção, da ordem de 80%13 15 17 23 36. A investigação do genótipo do VHC tem, ainda, importância em investigações imunológicas que visam o desenvolvimento de vacinas.

Diversos pesquisadores têm relatado ampla variação geográfica mundial na distribuição dos genótipos. Assim, os genótipos 1, 2 e 3 são mais prevalentes na Europa, Japão e Estados Unidos, o genótipo 4 na África central, Egito e Oriente Médio, o genótipo 5 na África do Sul e o genótipo 6 na Ásia25 26 27 28. No Brasil, tem-se observado maior prevalência do genótipo 1, seguido do 34 6 32, a despeito da considerável variação na distribuição de genótipos e da insuficiência de informações em algumas regiões brasileiras1 21 24 33 37. Genótipos incomuns, como o 4 e o 5, também foram relatados esporadicamente no Brasil22. Em Minas Gerais, maior prevalência do genótipo 1 foi observada em portadores de hemofilia (84,1%)31, quando comparados aos portadores de insuficiência renal crônica em hemodiálise (66,3%)5.

O método de referência para a classificação genotípica do VHC é o seqüenciamento direto de uma região do genoma do vírus, seguido da análise filogenética da seqüência obtida39 45. As metodologias mais utilizadas para a identificação do genótipo para fins de diagnóstico baseiam-se na análise de um fragmento amplificado do genoma viral, geralmente da região não codificante 5' (5'UTR)14 16 18. Esta região, a despeito de seu alto grau de conservação, apresenta diversos polimorfismos característicos de cada grupo genético do VHC3 29 41 44.

 

MATERIAL E MÉTODOS

Entre 2002 e 2006, 788 portadores de hepatite C crônica, atendidos nos Centros de Referência em Hepatites Virais do Município de Belo Horizonte foram referenciados ao NUPAD (Núcleo de Ações e Pesquisa em Apoio Diagnóstico) da Faculdade de Medicina da Universidade Federal de Minas Gerais, para caracterização molecular do vírus C com finalidade terapêutica. As amostras foram coletadas em tubos estéreis contendo EDTA. Os plasmas foram imediatamente separados e reservados em alíquotas de 100 microlitros congeladas a -70ºC até a utilização. Em todas as amostras foi confirmada a presença do RNA do VHC através de reação em cadeia da polimerase (PCR) qualitativa (AMPLICOR®, Roche Molecular Systems), conforme especificações do fabricante.

Seqüenciamento direto. Do volume total de produto da PCR obtido no teste qualitativo, 150 microlitros foram purificados utilizando-se o sistema Wizard SV® (Promega Corp.) e, posteriormente, ressuspendidos em 50 microlitros de água deionizada livre de nucleases.

Em seguida, foram aplicados 4 microlitros do produto purificado em gel de agarose a 2% juntamente com padrão de peso molecular (Low DNA Mass Ladder, Invitrogen Corp.) Após eletroforese, os géis foram revelados com brometo de etídio (Figura 1). As densidades ópticas das bandas produzidas pelas amostras foram comparadas à do padrão de massa com a finalidade de quantificar o DNA purificado obtido e calcular a quantidade de amostra a ser adicionada na reação de seqüenciamento.

 

 

As reações de seqüenciamento cíclico foram efetuadas com o sistema BigDye Terminator® (Applied Biosystems), utilizando-se na reação 4 picomoles do primer 5' AGT ACC ACA AGG CCT TTC 3'14 e a quantidade de DNA necessária de acordo com a quantificação descrita. Em seguida, as amostras foram processadas no seqüenciador ABI 3100-Avant® (Applied Biosystems).

Genotipagem. A identificação dos genótipos foi realizada através da análise comparativa da seqüência obtida de 172 nucleotídeos (nt: 92 a 263) com seqüências de referência dos genótipos do VHC (1a, 1b, 2a, 2b, 2c, 3a, 4a, 5a e 6a). Em seguida, efetuaram-se análises complementares das seqüências obtidas através do BLAST (Nacional Center for Biotechnology Information (NCBI) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST).

Análise filogenética. Após o agrupamento das seqüências obtidas em seis grupos (1a, 1b, 2a/c, 2b, 3a e 4), foram selecionadas 34 espécies representativas das diversas variantes presentes em cada grupo. Incluiram-se, nesta seleção, todas as seqüências que apresentaram substituições em relação às de referência nos grupos 1a, 1b, 2b e 3a, e todas as seqüências dos genótipos 2a/c e 4. Estas seqüências, juntamente com as seqüências de referência obtidas do GenBank, foram submetidas a alinhamento múltiplo. Em seguida, procedeu-se à análise filogenética por matriz de distâncias com correção de Jukes-Cantor19. A árvore filogenética foi obtida pelo método de Neighbor Joining. O método de bootstrap11 foi utilizado para testar a significância estatística para cada ramo da árvore gerada. Os valores de bootstrap foram obtidos por re-amostragem dos dados com 500 replicatas. Valores de bootstrap menores que 50% não foram mostrados na árvore. A análise filogenética das seqüências foi executada utilizando-se o programa MEGA versão 3.120.

Empregaram-se as seguintes seqüências de referência para a identificação genotípica e a análise filogenética: 1a: M62321 e M67463, 1b: D90208 e M58335, 2a: D00944 e AB047639, 2b: D10988 e AB030907, 2c: D50409, 3a: D17763 e D28917, 4a: Y11604, 5a: Y13184 e 6a: Y12083. As seqüências dos genótipos 5a e 6a foram incluídas com a finalidade de investigar a sua ocorrência na população brasileira.

 

RESULTADOS

De 788 amostras examinadas, 777 (98,6%) foram seqüenciadas e tiveram os genótipos determinados. Onze (1,4%) amostras apresentaram quantidade de RNA viral insuficiente para a obtenção de seqüências para análise. Os seguintes genótipos foram identificados: genótipo 1 em 609/777 (78,4%) amostras, sendo 291 (37,5%) do subtipo 1a e 314 (40,4%) do subtipo 1b, genótipo 3a em 139/777 (17,9%) amostras, 2b em 24/777 (3,1%) amostras, 4 em 2/777 (0,2%) amostras e genótipo 2 com indefinição do subtipo a ou c em 3/777 (0,4%) amostras. Quatro (0,5%) amostras classificadas como genótipo 1 apresentaram subtipagem indefinida em razão de superposição de picos (G/A) na posição 243 (Tabela 1).

 

 

A análise filogenética mostrou o agrupamento esperado das seqüências selecionadas junto às seqüências de referência para os genótipos 1, 2, 3 e 4, sendo que os valores de bootstrap mostraram significância estatística para os nós principais correspondentes a estes genótipos na árvore obtida (> 50% das replicatas produzidas no bootstrap).

As seqüências 162p e 163p, identificadas inicialmente como subtipo 1a, segregaram de forma independente no filograma, sendo estatisticamente significativa a ramificação obtida (valor de bootstrap de 91%). Coincidentemente, foram as duas espécies que apresentaram maior número de substituições dentro do grupo de 291 seqüências do genótipo 1a. As duas seqüências correspondentes ao genótipo 4 se agruparam conforme esperado junto ao genótipo 4a (Figura 2).

 

 

DISCUSSÃO

Os resultados deste trabalho demonstraram alta prevalência da infecção pelo genótipo 1 nos pacientes portadores de hepatite C crônica atendidos nos Centros de Referência em Hepatites Virais no Município de Belo Horizonte. Assim, o genótipo 1 foi identificado em 78,4% das amostras dos pacientes incluídos nesta casuística.

Em investigações prévias conduzidas no Brasil, os autores demonstraram que a prevalência do genótipo 1 nas amostras testadas variou de 52,6% no Estado do Paraná6 a 85% em Tocantins43. Na região Sudeste, alta prevalência do genótipo 1 foi relatada no Rio de Janeiro (79,1%), embora prevalência menor (62,5%) tenha sido descrita em São Paulo6. Em Belo Horizonte, estudos realizados em grupos específicos de portadores de infecção crônica pelo VHC reportaram prevalência do genótipo 1 com variações de 84,1% em hemofílicos31 a 66,3% em portadores de insuficiência renal crônica em tratamento hemodialítico4.

Observou-se, ainda, nesta investigação, tendência ao predomínio do subtipo 1b (40,4%) comparado ao subtipo 1a (37,5%). Não obstante, este resultado deve ser analisado com cautela uma vez que a diferenciação do subtipo 1a do 1b na região 5' UTR baseia-se em um único polimorfismo (G>A) na posição 243. Este fato contribui, de acordo com alguns autores, para caracterizar erroneamente amostras do subtipo 1a como 1b7 35 42. Para verificar a ocorrência de equívoco na subtipagem para o genótipo 1 e comprovar a proporção em que este ocorre na nossa população, seria recomendado a análise de amostras de ambos os subtipos por seqüenciamento de outra região subgenômica do vírus, o que não constituiu objetivo desta investigação.

Em amostras classificadas como genótipo 1, foram observadas quatro seqüências que apresentavam superposição A/G na posição 243 e, por esta razão, foram caracterizadas como 1a/b. É possível que a superposição observada nesta posição seja devida a co-infecção por ambos subtipos. Outra possibilidade é a presença de diferentes quasispécies originadas a partir do mesmo subtipo infectante7 12.

O genótipo 4, muito freqüente em alguns países da África e no Oriente Médio25 28 foi identificado em duas amostras. Esta baixa prevalência da infecção pelo genótipo 4 também tem sido reportada em outros países das Américas e da Europa26 27. De forma semelhante, não foram identificados os genótipos 5 e 6. De fato, a despeito da alta prevalência descrita dos genótipos 5 na África do Sul e 6 no Sudeste Asiático, ambos são genótipos raros e pouco descritos, tanto nas Américas como no Brasil5 6 e na Europa28.

O resultado da análise filogenética das 34 variantes selecionadas mostrou agrupamentos bem definidos e com significância estatística para todos os genótipos. A falta de suporte estatístico para os agrupamentos dos subtipos dentro do genótipo 1 era esperada7 14 42 em função da existência de apenas uma substituição filogeneticamente informativa na região 5'UTR. As amostras 162p e 163p constituíram um grupo monofilético distinto dos seis genótipos principais; no entanto, a caracterização destas duas amostras como genótipo 1a foi concordante com os resultados obtidos no BLAST e com a maior distância apresentada em relação aos outros grupos genéticos. No Brasil, Oliveira e cols. também reportaram diferenças significativas na região 5'UTR em relação aos isolados de referência em amostras do genótipo 331. Finalmente, as duas amostras caracterizadas como genótipo 4 se agruparam, como esperado, junto à seqüência de referência utilizada, confirmando a designação correta do genótipo para as mesmas.

Considerando que as 34 seqüências selecionadas foram representativas de todas as amostras analisadas, pode-se inferir que a análise filogenética confirmou o resultado da genotipagem em 775/777 (99,7%) amostras. Este resultado confirma que a metodologia empregada foi adequada para distinguir, com acurácia, os genótipos 1, 2, 3 e 4 do vírus C. Assim, este estudo corrobora relatos prévios de diversos autores que qualificam a região viral 5'UTR como confiável para a genotipagem do VHC9 10 14 29 34 44.

Em síntese, este estudo contribuiu para o maior conhecimento da distribuição da freqüência dos genótipos do VHC no nosso meio e reitera a confiabilidade e o bom desempenho da análise da região 5'UTR para a genotipagem do VHC. A ocorrência de seqüências atípicas em duas amostras caracterizadas como genótipo 1a sugere a presença de variantes do VHC ainda não descritas no nosso meio. Mais investigações são necessárias para ampliar o conhecimento a respeito da diversidade genômica do VHC no Brasil.

 

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Endereço para correspondência:
Dr. Carlos Perone
R. Xavier de Gouvéia 88
30430-710 Belo Horizonte, MG
e-mail: carlos@nupad.ufmg.br

Recebido para publicação em: 05/03/2008
Aceito em: 05/06/2008