Identificação por PCR e sensibilidade a antifúngicos de isolados clínicos vaginais de Candida sp

Identification by PCR and antifungal susceptibility of vaginal clinical Candida sp isolates

ARTIGO ARTICLE

Identificação por PCR e sensibilidade a antifúngicos de isolados clínicos vaginais de Candida sp

Identification by PCR and antifungal susceptibility of vaginal clinical Candida sp isolates

Izabel Almeida Alves; Fernanda Pês de Camargo; Letícia Silveira Goulart

Curso de Farmácia Bioquímica Clínica, Universidade Regional Integrada do Alto Uruguai e das Missões, Santo Ângelo, RS

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

INTRODUÇÃO: A candidíase vaginal é uma condição que afeta um grande número de mulheres em idade fértil. Candida albicans é a espécie mais frequentemente isolada de secreção vaginal, entretanto, outras espécies mais resistentes às drogas antifúngicas podem ser isoladas de amostras clínicas vaginais.

MÉTODOS: Foram identificadas as espécies de 30 isolados vaginais de Candida sp por PCR utilizando o primer universal ITS4 e primers espécie-específicos para C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis e C. krusei. A sensibilidade destes isolados frente à anfotericina B, fluconazol e voriconazol foi determinada pelo método de macrodiluição M27-A2 do CLSI.

RESULTADOS: Através dos ensaios de PCR, 28 isolados foram caracterizados como C. albicans e 2 isolados apresentaram amplificação para os primers específicos de C. albicans e C. glabrata. A concentração inibitória mínima para anfotericina B variou de 0,03µg/mL a 0,25µg/mL, para o fluconazol de 0,125µg/mL a 16µg/mL e para o voriconazol de 0,03µg/mL a 0,25µg/mL.

CONCLUSÕES: A identificação de Candida ao nível de espécie através de ensaios de PCR deve ser relevante para o gerenciamento clínico destas infecções.

Palavras-chaves:Candida sp. Antifúngicos. PCR.

ABSTRACT

INTRODUCTION: Vaginal candidiasis is a condition that affects innumerous fertile women. Candida albicans is the most frequently isolated species from vaginal discharge; however, other different species that are more resistant to antifungal drugs can be identified in vaginal clinical samples.

METHODS: The species of 30 vaginal Candida isolates was identified by PCR using the universal ITS4 primer and species-specific primers for C. albicans, C. glabrata, C. tropicalis and C. krusei. The sensitivity pattern to amphotericin B, fluconazole and voriconazole was assessed using the CLSI M27-A2 macrodilution method.

RESULTS: The PCR assay revealed 28 C. albicans and 2 samples showed amplification for C. albicans and C. glabrata primers. The minimum inhibitory concentration for amphotericin B ranged from 0.03µg/mL to 0.25µg/mL, for fluconazole from 0.125µg/ml to 16µg/mL and for voriconazole from 0.03µg/mL to 0.25µg/m.

CONCLUSIONS: Identification at Candida species level by PCR assay could be relevant for clinical management of these infections.

Key-words:Candida sp. Antifungal. PCR.

INTRODUÇÃO

A candidíase vaginal afeta uma elevada proporção de mulheres em idade adulta, estima-se que aproximadamente 75% destas apresentem pelo menos um episódio de vulvovaginite fúngica em sua vida, onde 40 a 50% vivenciam novos surtos e 5% tornam-se recorrentes. A espécie isolada mais frequente de secreções vaginais continua sendo Candida albicans, entretanto, outras espécies também estão envolvidas neste tipo de infecção^1,2.

O método convencional para identificação de espécies de Candida é baseado em teste de assimilação e fermentação de açúcares, análise morfológia da colônia, uso de meios cromogênicos, painéis enzimáticos e sistemas automatizados^3-5. A fim de minimizar as limitações da fenotipagem, métodos de biologia molecular foram adaptados para serem utilizados na identificação de espécies de Candida^6,7. Goebel⁸ padronizou um PCR espécie-específico para determinar espécie de Candida. Este PCR espécie-específico consiste na amplificação das regiões transcritas internas 1 e 2 do gene do rRNA das espécies de Candida. Nesta técnica, foram utilizados 7 primers espécie-específicos e 1 primer universal, o qual anela em uma região do gene rRNA 28S. Estes primers identificam espécies de C. lusitanie, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. albicans, C. krusei, C. glabrata e C. guilliermondii.

A resistência aos antifúngicos, tem representado um grande desafio para a clínica, frente às dificuldades observadas no tratamento da candidíase. Este aumento pode ser decorrente do uso de terapias seletivas com doses inadequadas ou devido ao uso crescente desses fármacos na profilaxia de infecções fúngicas o que pode condicionar a seleção da resistência clínica⁹. Devido ao aumento das infecções fúngicas oportunistas, o National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) atual Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) estabeleceu um subcomitê para padronizar a metodologia capaz de avaliar a suscetibilidade in vitro das leveduras¹⁰. A determinação da atividade dos antifúngicos possibilita realizar uma correlação entre atividade in vitro e resposta clínica, sendo possível desta forma, monitorar a resistência aos antifúngicos no curso do tratamento clínico¹¹. O objetivo do presente trabalho foi identificar as espécies de Candida sp isoladas da mucosa vaginal por PCR e avaliar o perfil de suscetibilidade frente a anfotericina B, ao fluconazol e ao voriconazol.

MÉTODOS

Microrganismos estudados e condições de cultivo

Foram utilizados neste estudo trinta isolados vaginais de Candida sp e as cepas padrões Candida albicans ATCC 18804 e Candida glabrata ATCC 2001. Os isolados clínicos foram obtidos de swabs coletados da mucosa vaginal de pacientes com sintomas de candidíase vulvovaginal, atendidas em um serviço de ginecologia do Município de Santo Ângelo, Rio Grande do Sul, no período de fevereiro a maio de 2007. A amostragem não foi populacional e, sim, proveniente do serviço de ginecologia, isto é, por demanda espontânea. As coletas foram realizadas por um médico ginecologista e os critérios empregados para caracterizar infecção foram prurido, edema, eritema na vulva e vagina e presença de fluxo vaginal grumoso aderente às paredes vaginais. As pacientes que participaram da pesquisa apresentaram adesão voluntária, seguida de autorização documentada através da assinatura do termo de consentimento livre esclarecido.

Os swabs da mucosa vaginal foram semeados ágar Sabouraud (Himedia, Mumbai, India) e incubados a 37ºC por 48 horas. Colônias isoladas das leveduras foram identificadas de acordo com características macromorfológicas e micromorfológicas pela técnica de microcultivo em ágar Fubá (Oxoid, Basingstok, UK).

Determinação das espécies por PCR

Extração de DNA: o DNA genômico foi extraído conforme o método descrito por Crestani¹². Os isolados foram semeados em ágar Saboraud por 24-48 horas a 37ºC . As colônias foram recolhidas e adicionados a um microtubo contendo 500µL de tampão de lise celular (NaCl 0,15M; Tris - HCl 50M; EDTA 10mM; SDS - 2%; pH 8 ) e este foi incubado a 65ºC por uma hora. Após, foram adicionados 500µL de fenol/clorofórmio (1:1) e misturado em vórtex por 15 minutos. Este foi centrifugado por 15 minutos a 13000rpm e logo retirado a suspensão aquosa e adicionado a um novo microtubo. A suspensão que continha DNA foi adicionado 400µl de fenol, misturado em vórtex por 5 minutos e centrifugados por 15 minutos a 13000rpm, a fase aquosa formada, foi submetida a outro processo de extração com 400µl de fenol. Ao sobrenadante foi adicionado 1mL de etanol absoluto e este foi armazenado uma hora a -20ºC. Após uma centrifugação por 15 minutos a 13000rpm, o sedimento foi lavado com etanol 70% gelado, seco a temperatura ambiente e ressuspendido em 80µL de Tris -EDTA. Ao material foi tratado com 3µl de RNAse (Invitrogen, Carlsbad, CA) na concentração de 50µg/mL 30 minutos a 37ºC. A qualidade do DNA foi verificada visualmente sob luz UV após eletroforese em gel de agarose 0,8% corado com 0,5µg/mL de brometo de etídio. Os microtubos contendo o DNA foram armazenados a -20ºC.

PCR espécie-específico

O método de PCR utilizado para a identificação das espécies de Candida foi baseado no protocolo descrito por Goebel⁸. A reação de amplificação foi realizada em um volume final de 50µL contendo 10 a 20ng de DNA, 10mM Tris HCl pH 8,3/50mM KCl, 1,5mM MgCl₂, 0,8mM de desoxirribonucleotídeo, 0,8µL de cada primer (20pmol/µL) e 1U de Taq platinum DNA polimerase (Invitrogen, Carlsbad, CA). As condições para a realização deste PCR foram: desnaturação inicial de 94ºC por 3 minutos, 35 ciclos de desnaturação de 94ºC por um minuto, anelamento de 63ºC por um minuto, extensão de 72ºC por um minuto e extensão final de 72ºC por 5 minutos. Os produtos de amplificação foram analisados em gel de agarose 1% corado com 0,5µg/mL de brometo de etídio e visualizados sob luz UV.

Os primers utilizados foram construídos por Li et al¹³ com base nas sequências disponíveis no GenBank do espaçador transcrito interno (ITS) 1 e 2. São eles: CT (C. tropicalis, 5'-AAG AAT TTA ACG TGG AAA CTT A-3'), CA (C. albicans, 5'- TCA ACT TGT CAC AGA TTA TT-3'), CK (C. krusei, 5'-GAT TTA GTA CTA CAC TGC GTC A-3'), CGLA (C. glabrata, 5'-CAC GAC TCG ACA CTT TCT AAT T-3') e o primer universal ITS4 (5'- TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3'). Os ensaios de PCR geram produtos de amplificação de 402pb para C. albicans, 632pb para C. glabrata, 475pb para C. krusei e de 149pb para C. tropicalis.

Testes de suscetibilidade a antifúngicos

Os testes de suscetibilidade a antifúngicos foram realizados conforme o protocolo M-27A2 do CLSI¹¹, sendo realizada a técnica de macrodiluição frente aos antifúngicos anfotericina B (Wyeth), fluconazol (Biolab Saws) e voriconazol (Pfizer). O meio de cultura utilizado foi o RPMI 1640 (Sigma-Aldrich) tamponado com ácido morfopropileno sulfônico (MOPS) 1,65M pH 7,2. Os fármacos foram conservados sob refrigeração e ao abrigo da luz até o momento do uso. As diluições dos antifúngicos foram realizadas com o meio RPMI 1640 a fim de se obter nos tubos testes concentrações que variam de 16 a 0,03µg/mL para anfotericina B e de 64 a 0,125µg/mL para o fluconazol. Os inóculos foram preparados a partir de colônias com crescimento de 24h em meio de ágar Saboraud as quais foram ressuspendidas em solução salina estéril, a fim de se obter uma turbidez correspondente a 1x10⁶ a 5x10⁶ células por mL. Esta suspensão foi diluída 1:100, seguida de uma nova diluição 1:20 em meio líquido RPMI 1640. Volumes de 0,1mL de cada uma das diferentes concentrações de agente antifúngico foram dispensados em tubos de ensaio de 12x75mm, após foram acrescentados 0,9mL do inóculo padronizado. Os tubos foram incubados a 37ºC por 48h, para posterior determinação da concentração inibitória mínima (CIM). O critério de leitura considerou que a CIM seria a menor concentração capaz de inibir 80% do crescimento para os azólicos e 100% para anfotericina B.

Ética

O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Regional Integrada do Alto Uruguai das Missões, sob protocolo nº 032-4/THC/06.

RESULTADOS

Os ensaios de PCR permitiram identificar as espécies das amostras como 28 (93,3%) C. albicans e 2 (6,7%) foram caracterizadas como C. albicans e C. glabrata, ou seja, apresentaram amplificação tanto para o primer CA, quanto para o primer CGLA. As Figuras 1 e 2 apresentam os produtos de amplificação obtidos com o PCR espécieespecífico. Nenhum dos isolados apresentou amplificação com os primers CT e CK, os quais permitem identificar C. tropicalis e C. krusei, respectivamente. Os ensaios foram realizados em duplicata, a fim de garantir maior confiabilidade dos resultados.

Para os testes de suscetibilidade foram utilizados apenas 28 isolados, uma vez que foram excluídos destes ensaios as duas amostras que apresentaram duas espécies (C. albicans e C. glabrata) concomitantes. Após a realização dos testes de suscetibilidade frente à anfotericina B, determinou-se que todos os isolados foram sensíveis a este poliênico. As CIMs para este antifúngico variaram de 0,03 a 0,25µg/mL sendo que a CIM₅₀ (concentração inibitória mínima para 50% das amostras testadas) foi de 0,06µg/mL e a CIM₉₀ (concentração inibitória mínima para 90% das amostras testadas) foi de 0,25µg/mL (Tabela 1). Os testes de suscetibilidade ao fluconazol, também caracterizaram todos os isolados como sensíveis a este azólico. As CIMs variaram de 0,125 a 16µg/mL, a CIM₅₀ para as amostras foi 0,5µg/mL e a CIM₉₀ foi 4,0µg/mL (Tabela 1). Todas as amostras estudadas mostraram-se sensíveis ao voriconazol, e as CIMs tiveram variação de 0,03 a 0,25µg/mL, com CIM₅₀ de 0,03µg/mL e CIM₉₀ de 0,125µg/mL (Tabela1).

DISCUSSÃO

Neste trabalho, observamos que C. albicans foi a espécie isolada com maior frequência (93,3%) em amostras clínicas de pacientes com candidíase vaginal. Vários estudos têm evidenciado o predomínio da espécie albicans em infecções vaginais. Entretanto, com uma proporção inferior. Estes relatos incluem os estudos de Holland cols¹⁴ na Austrália (89%), Paulisch cols¹⁵ na Áustria (87,9%), Correa cols¹⁶ no Brasil (87%) e Arechavala cols¹⁷ na Argentina (86%).

Em nosso estudo, para dois isolados vaginais, identificamos duas espécies de Candida (C. albicans e C. glabrata) na mesma amostra. Estes resultados indicam uma falha no processo de seleção das colônias utilizadas na extração do material genômico. Este fato pode ser justificado pelo cultivo dos swabs vaginais ter sido realizado somente em ágar Sabouraud, onde, estas espécies apresentam colônias com características morfológicas semelhantes. Para minimizar esta interferência as amostras deveriam ter sido semeadas em um meio cromogênico, o que não ocorreu. De qualquer modo, o resultado aponta para uma possível colonização concomitante por C. albicans e C. glabrata. A maioria das vaginites é causada por uma única espécie de Candida, entretanto, duas ou mais espécies podem estar envolvidas simultaneamente neste tipo de processo infeccioso^17-19.

Abordagens moleculares estão sendo desenvolvidas para estabelecer uma identificação mais rápida e segura de espécies fúngicas, devido à imprecisão e demora dos testes fenotípicos tradicionais. Estas técnicas, como o PCR, o PCR multiplex e o nested-PCR, têm permitido identificar espécies de Candida através da amplificação principalmente das regiões ITS1 e ITS2, que estão presentes em fungos patogênicos^20,8,9.

Em nosso trabalho foi possível identificar as espécies de isolados de Candida utilizando um primer universal ITS4 o qual anela em uma região do gene rRNA 28S e quatro primers espécie específicos, baseados nas regiões dos espaçadores transcritos internos 1 e 2. Wahyuningsih cols²¹ caracterizaram C. albicans utilizando os primers ITS3 e ITS4. Fujita cols²² identificaram espécies de Candida através de um PCR multiplex, utilizando os primers universais ITS1, ITS3 e ITS4. Chang cols²³ utilizaram o PCR multiplex para identificação de Candida e suas espécies. A técnica foi baseada na amplificação das regiões ITS1 do gênero Candida e de um fragmento da região ITS2, específica para C. albicans. Leaw cols²⁴ determinaram as espécies de fungos patogênicos utilizando sequências das regiões ITS. As regiões ITS1 e ITS2 são apropriadas para o diagnóstico, identificação, taxonomina e filogenia de fungos de importância médica. Além disto, a utilização de primers universais podem beneficiar as técnicas de diagnóstico clínico microbiológico ^25-27.

A anfotericina B é considerada a droga de referência para o tratamento da maioria das infecções fúngicas, porém apresenta alta toxicidade e sua indicação deveria ser restrita às infecções sistêmicas^1,28. Em nosso estudo, todos os isolados testados foram sensíveis a anfotericina B, apresentando valores de CIMs que variam de 0,03 a 0,25µg/mL. Outros autores também têm observado uma elevada sensibilidade a anfotericina B em amostras clínicas de espécies de Candida. Galle & Gianini⁹, Ferraza cols¹ e Ribeiro cols²⁹ ao avaliarem a sensibilidade de isolados vaginais de Candida observaram valores de CIMs que variaram entre 0,25 a 1µg/mL e 0,12 e 1µg/mL respectivamente, caracterizando suas amostras como sensíveis a anfotericina B.

Os triazólicos são fármacos bastante utilizados no tratamento e profilaxia das infecções fúngicas. Entretanto, existe uma tendência para se evitar o uso profilático do fluconazol em doses baixas, a fim de se prevenir o surgimento de isolados resistentes e surgimento de infecções causadas por espécies naturalmente resistentes a este antifúngico como C. grablata e C. Krusei^9,28. Os valores de CIM ao fluconazol encontrados em nosso trabalho são semelhantes aos valores reportados por Galle & Gianini⁹, Ferraza cols¹ e Gross cols³⁰.

Um isolado em estudo foi caracterizado como sensível dose-dependente ao fluconazol (CIM de 16µg/mL). Outros autores têm relatado o crescente número de amostras sensíveis doses dependentes a este antifúngico. Richter cols³¹ ao analisarem amostras de pacientes com vulvovaginites recorrentes, encontraram CIMs para fluconazol elevados (CIM >16 µg/mL) em 15% das amostras. Mohanty cols³² observaram que 30% dos isolados de Candida da mucosa vaginal estudados foram dose-dependentes.

O voriconazol é um antifúngico triazólico de amplo espectro, reservado para tratamento de micoses sistêmicas, em nosso estudo os testes de sensibilidade apresentaram um CIM de 0,03 a 0,25µg/mL, revelando sensibilidade elevada dos isolados a este antifúngico. Pfaller cols³³ ao testar a sensibilidade de isolados vaginais de Candida com testes de disco difusão encontraram em espécies de C. albicans um percentual de sensibilidade elevado, de 98,4%. Swinne cols³⁴ em seu estudo demonstraram uma atividade elevada do voriconazol contra C. albicans, representado por 94% de sensibilidade.

Pacientes que apresentam sintomas de vulvovaginite fúngica diagnosticadas através de cultura positiva para Candida, são tratadas com terapia empírica, portanto é importante destacar que na decisão da terapêutica adequada para cada paciente, se considere não somente a patogenia, mas também as características intrínsecas desse paciente³⁵. Os testes de suscetibilidade a antifúngicos são úteis na escolha do agente antifúngico mais apropriado para o tratamento das formas de candidíases. Entretanto, o uso destes testes na rotina laboratorial não é comum, pois estas técnicas apresentam custo elevado o que limita sua realização. Uma alternativa seria a utilização dos testes de disco difusão e o E-teste para rastreamento, sendo os métodos de diluição em caldo reservados para confirmação de resistência³⁶.

Outro fato importante a ser destacado é o crescente aumento do número de isolados de espécies não-albicans, e a dificuldade e imprecisão dos testes fenotípicos na determinação destas espécies, assim abordagens moleculares estão sendo desenvolvidas para estabelecer uma identificação mais rápida e segura de espécies de fungos¹³. Futuramente, métodos moleculares baseados em técnicas de polimorfismos deverão ser aplicados para entender a dinâmica dos microorganismos infecciosos em populações humanas, interpretar o relacionamento entre comensalismo e infecção, identificar a origem de uma infecção ou monitorar a emergência de linhagens resistentes a drogas³⁷.

CONFLITO DE INTERESSE

Os autores declaram não haver nenhum tipo de conflito de interesse no desenvolvimento do estudo.

Recebido para publicação em 14/11/2009

Aceito em 14/05/2010

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  05 Nov 2010
• Data do Fascículo
  Out 2010

Histórico

• Aceito
  14 Maio 2010
• Recebido
  14 Nov 2009