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Caracterização do vírus da hepatite C em pacientes com hepatite crônica: genótipos no Estado do Amazonas, Brasil

Characterization of hepatitis C virus in chronic hepatitis patients: genotypes in the State of Amazonas, Brazil

Resumos

INTRODUÇÃO: No Estado do Amazonas, os dados sobre a prevalência dos genótipos do vírus da hepatite C ainda são escassos. MÉTODOS: Os genótipos do VHC foram determinados em 69 pacientes da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas - FMT-AM. O RNA do VHC foi detectado pela técnica de RT-PCR, utilizando-se iniciadores HC11/HC18 para a região 5'não traduzida. RESULTADOS: Dos 69 pacientes, 65,2% era do sexo masculino e 34,8% do feminino. O genótipo 1 foi o mais prevalente, seguidos dos 3 e 2. CONCLUSÕES: Estes dados sugerem que Manaus é uma porta de entrada do vírus VHC no Estado do Amazonas.

Vírus da hepatite C; Genotipagem; Hepatites


INTRODUCTION: In the State of Amazonas, data regarding the prevalence of different genotypes of hepatitis C virus remains scarce. METHODS: The genotype of 69 HCV positive patients was determined. An in-house standardized nested-PCR was used to detect HCV RNA. Genotype assignment was based on type-specific motifs on the sequenced amplicons delimited by primers HC11/HC18 from the 5' untranslated region. RESULTS: Of the 69 patients studied, 65.2% were male and 34.8% were female. Genotype 1 showed the greatest prevalence, followed by 3 and 2. CONCLUSIONS: These data suggesting that Manaus is the point of arrival of HCV in the State of Amazonas.

Hepatitis C virus; Genotyping; Hepatitis


COMUNICAÇÃO COMMUNICATION

Caracterização do vírus da hepatite C em pacientes com hepatite crônica: genótipos no Estado do Amazonas, Brasil

Characterization of hepatitis C virus in chronic hepatitis patients: genotypes in the State of Amazonas, Brazil

Ana Ruth AraújoI, II; Carlos Mauríco de AlmeidaI; Liziara FraportiII, III; Nadja GarciaII, III; Tatiane Amábili de LimaI, III, Laura Patrícia Viana MaiaII, III; Kátia Luz TorresIII; Andréa Monteiro TarragôIII; Flamir VictóriaI; Marilu VictóriaI; Adriana TatenoIV; José Eduardo LeviIV; Sinésio TalhariI; Adriana MalheiroI, II

IGerência de Virologia, Ambulatório de Virologia, Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, Manaus, AM

IIInstituto de Ciências Biológicas, Departamento de Parasitologia, Universidade Federal do Amazonas, Manaus, AM

IIIDiretoria de Ensino e Pesquisa, Laboratório de Imunologia, Fundação de Hematologia e Hemoterapia do Amazonas, Manaus, AM

IVGerência de Virologia, Laboratório de Virologia, Instituto de Medicina Tropical de São Paulo, São Paulo, SP

Endereço para correspondência Endereço para correspondência: Dra. Adriana Malheiro. HEMOAM. Av. Constantino Nery 4397 69050-002 Manaus, AM Tel: 55 92 3655-0113 e-mail: malheiroadriana@yahoo.com.br

RESUMO

INTRODUÇÃO: No Estado do Amazonas, os dados sobre a prevalência dos genótipos do vírus da hepatite C ainda são escassos.

MÉTODOS: Os genótipos do VHC foram determinados em 69 pacientes da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas - FMT-AM. O RNA do VHC foi detectado pela técnica de RT-PCR, utilizando-se iniciadores HC11/HC18 para a região 5'não traduzida.

RESULTADOS: Dos 69 pacientes, 65,2% era do sexo masculino e 34,8% do feminino. O genótipo 1 foi o mais prevalente, seguidos dos 3 e 2.

CONCLUSÕES: Estes dados sugerem que Manaus é uma porta de entrada do vírus VHC no Estado do Amazonas.

Palavras-chaves: Vírus da hepatite C. Genotipagem. Hepatites.

ABSTRACT

INTRODUCTION: In the State of Amazonas, data regarding the prevalence of different genotypes of hepatitis C virus remains scarce.

METHODS: The genotype of 69 HCV positive patients was determined. An in-house standardized nested-PCR was used to detect HCV RNA. Genotype assignment was based on type-specific motifs on the sequenced amplicons delimited by primers HC11/HC18 from the 5' untranslated region.

RESULTS: Of the 69 patients studied, 65.2% were male and 34.8% were female. Genotype 1 showed the greatest prevalence, followed by 3 and 2.

CONCLUSIONS: These data suggesting that Manaus is the point of arrival of HCV in the State of Amazonas.

Keywords: Hepatitis C virus. Genotyping. Hepatitis.

A infecção pelo vírus da hepatite C (VHC) está estimada em mais de 200 milhões de pessoas em todo o mundo, correspondendo a mais de 3% de toda a população mundial1. O VHC é o único representante do gênero Hepacivirus incluído na família Flaviviridae. É um pequeno vírus com cerca de 30 a 60nm de diâmetro e apresenta um genoma de RNA linear com hélice única e positiva, cuja organização assemelha-se a outros flavivírus, como o vírus do dengue2.

Seu genoma contém 9.400 nucleotídeos, possuindo uma única fase de leitura aberta (open reading frame), que codifica uma poliproteína de pouco mais de 3.000 aminoácidos, contendo uma região estrutural e uma não-estrutural3. Estas regiões são clivadas por proteases, liberando as proteínas estruturais e não estruturais do vírus. A região estrutural localiza-se na porção aminoterminal, codificando a proteína core do nucleocapsídeo viral (proteína C, com cerca de 19kD) e as glicoproteínas E1 (gp33) e E2 (gp72), constituintes do envelope viral2. Esta região do genoma representa a sequência mais altamente conservada, sugerindo um papel regulador durante a replicação viral2. As proteínas não estruturais NS2, NS3, NS4A, NSB, NS5A e NS5B representam a extremidade carboxiterminal do genoma viral4.

Os genótipos do VHC são determinados pelo sequenciamento de nucleotídeos do genoma inteiro seguido por uma composição da árvore filogenética. Este é, atualmente, o padrão-ouro para a detecção e identificação dos diferentes genótipos do VHC. Outros métodos de genotipagem são baseados em técnicas sorológicas e moleculares. A reação em cadeia da polimerase (PCR) com métodos de genotipagem incluem o uso de primers para amplificação, análise de hibridização reversa, usando sondas específicas para uma região do VHC e por análises da técnica de restriction fragment length polymorphism (RFLP)5.

Até o momento, foram identificados seis genótipos do VHC, distintos mas relacionados, além de múltiplos subtipos, por meio de correlações moleculares3: 1a, 1b, 2a, 2b, 3, 4, 5 e 6. A determinação do genótipo relacionado a cada indivíduo é importante por apresentar valor preditivo em termos de resposta à terapia antiviral, com melhor resposta associada aos genótipos 2 e 3 do que ao genótipo 13.

Basicamente, o tratamento da hepatite C visa deter a progressão da doença hepática pela inibição da replicação viral6. O protocolo terapêutico preconizado atualmente pelo Ministério da Saúde do Brasil7 inclui a administração de interferon alfa em associação com o antiviral ribavirina, que potencializa o efeito do primeiro.

O impacto do VHC na saúde pública abrange desde a alta prevalência na população em geral, cujos dados ainda são pontuais e escassos, até o alto custo do tratamento das comorbidades observadas no decorrer do curso clínico. Observa-se, ainda, alta mortalidade na fase terminal da doença, com frequentes hospitalizações e intercorrências de difícil manejo, especialmente em locais de poucos recursos para assistência à saúde. Sobre esta infecção, ainda vários aspectos não são conhecidos, especialmente na região amazônica, onde faltam estudos epidemiológicos e moleculares na área. Este trabalho visou caracterizar os genótipos do vírus da hepatite C, em pacientes atendidos na Fundação de Medicina Tropical do Amazonas.

Foram incluídos no estudo 69 pacientes, moradores da Cidade de Manaus, portadores de hepatite C crônica, cadastrados no Ambulatório da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, hospital de referência em doenças tropicais na Cidade de Manaus, Estado do Amazonas. As técnicas de biologia molecular foram realizadas no Laboratório de Virologia do Instituto de Medicina Tropical de São Paulo (IMT-SP) sob responsabilidade do Dr. José Eduardo Levi. A extração do RNA das amostras foi realizada a partir de 140µL de soro utilizando-se o Kit QIAamp® Viral RNA (Qiagen, Uniscience do Brasil-SP), de acordo com as especificações do fabricante. Para a síntese de DNA complementar (cDNA) foi realizada a reação de transcrição reversa (RT), utilizando-se a enzima transcriptase reversa Moloney Murine Leukemia Virus (M-MLV) (Invitrogen ®Brasil) que utiliza moléculas de RNA fita simples, na presença de Random Hexamers N6 (Random primers) para sintetizar fitas de DNA e a reação foi submetida as condições de termociclagem. Após a obtenção do cDNA, o mesmo foi amplificado pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR), utilizando-se a enzima Platinum Taq DNA Polimerase (Invitrogen® TM Life Technologies, Carlsbad, CA, USA). Os primers foram desenhados a partir da região conservada 5'NCR do genoma do VHC. O produto amplificado foi identificado por eletroforese em gel de agarose 1,5% (Agarose UltrapureTM -Invitrogen Life Technologies). As amostras dos pacientes que continham RNA do VHC no plasma foram submetidas à nova PCR que gerou um produto amplificado de 308pb ideal para análise dos genótipos do VHC. Os genótipos foram determinados utilizando-se iniciadores genótipos específicos nas sequências delimitadas pelos iniciadores HC11/HC18 para a região 5'não traduzida. O sequenciamento do VHC foi realizado no sequenciador ABI PRISM TM 377 (Applied Biosystems Incorporation, Foster City, California, EUA). O alinhamento das sequências foi realizado utilizando-se o software ABI 377-96 collection v. 2.6. A genotipagem foi feita através da edição e alinhamento das sequências das regiões 5'NCR, utilizando o programa Sequence Navigator v.3.4 (Applied Biosystems), em conjunto com as sequências padrão obtidas do GenBank, (acesso on-line) no banco de dados do Los Alamos National Laboratory, nos Estados Unidos.

As análises estatísticas foram feitas no programa GraphPad Prism versão 4.0. Foram incluídos no estudo 69 pacientes, sendo a maior prevalência do sexo masculino (65,2%) em comparação ao feminino (34,8%), sendo que a média de idade para o sexo feminino foide45±15,31 e para o masculino de 46±11,92, não apresentando diferença estatística significativa entre ambos os sexos. Não foram observadas alterações significativas em relação à aspartato amino-transferase, (48,54±36,98) e (54,64±33,86), para o sexo feminino e masculino, respectivamente. No entanto, foram observadas alterações nas concentrações de alanina amino-transferase, entre ambos os sexos, quando comparado aos valores de referência.

Todos os pacientes foram reativos no teste sorológico anti-VHC e as amostras foram submetidas à técnica de PCR para confirmação do diagnóstico e posteriormente a determinação do genótipo viral como preconizado pelo Ministério da Saúde. Como mostra a Tabela 1, foram detectados os genótipos 1 (54,2%), 2 (20,8%) e 3 (25%) das mulheres. Para o sexo masculino, observamos, assim, como para o feminino, a maior prevalência do genótipo 1 (76,1%) e 3 (19,6%). No entanto, o genótipo 2 (4,3%) apresentou-se menos prevalente nesta população, quando comparado com a do sexo feminino (Tabela 1).

A detecção do VHC é de crucial importância para o controle da doença a nível global, sendo que mesmo em países desenvolvidos o número de mortes deve continuar aumentando devido à inadequada detecção, o que posterga o tratamento8. Esta detecção é baseada em 2 tipos de testes: os ensaios sorológicos para detecção de anticorpos específicos (cuja sensibilidade tem aumentado progressivamente) e os testes moleculares para detecção de partículas virais3. Especialmente, em relação aos testes moleculares, a determinação da carga viral permite avaliar a evolução da resposta terapêutica, enquanto a genotipagem prediz a resposta e influencia no regime de tratamento escolhido3.

O vírus da hepatite C é notadamente bem sucedido, produzindo uma infecção persistente que continuará por toda a vida do indivíduo, com vastas oportunidades de transmissão dentro da população humana, a menos que interrompida por uma terapia baseada no uso do interferon (IFN)9. Neste estudo, amostras de 69 pacientes com diagnóstico de hepatite C foram analisadas. Nesta população de estudo, a maioria dos indivíduos infectados era do sexo masculino, e encontrava-se na faixa etária acima dos 40 anos. Estes dados estão de acordo aos encontrados por Torres cols10 em doadores de sangue. Naquele estudo, os autores relataram uma relação estatística entre a viremia do VHC e a faixa de 45-55 anos. Estes dados sugerem que estes indivíduos foram infectados pelo VHC, antes da inclusão de exames sorológicos obrigatórios no Brasil e, por se tratar de uma infecção latente e muitas vezes silenciosa, passaram a apresentar alterações do quadro clínico mais tardiamente.

O protocolo terapêutico preconizado atualmente pelo Ministério da Saúde do Brasil7, inclui a administração de interferon alfa em associação com o antiviral ribavirina, de acordo com o genótipo viral. Desta forma, é obrigatório a genotipagem de amostras de pacientes soropositivos antes do início do tratamento. Apesar desta obrigatoriedade, dados relacionados à prevalência do HCV no Estado do Amazonas, ainda são escassos. Em 2005, Campiotto cols11, em um estudo multicêntrico, descreveram que o genótipo 1 era o mais prevalente no Estado do Amazonas. No entanto, poucos indivíduos foram analisados naquela época.

No presente estudo, foi observado uma maior prevalência do genótipo 1, seguido do 3 e 2. O Genótipo 1 é predominante em todo o mundo e é composto de dois subtipos principais, 1a e 1b. Além disso, tem sido demonstrado que as taxas de crescimento destes subtipos são maiores do que os genótipos 4 e 6. Na população de Alagoas, a prevalência do subtipo 1b (65,2%) foi maior do que a observada em Salvador, Bahia, onde este subtipo só ocorreu em 38,6% das amostras positivas para o anti-VHC. No entanto, foi muito semelhante aos resultados obtidos a partir de amostras de VHC positivas de outros Estados brasileiros, como Acre, Amazonas e Pará (região norte), bem como Pernambuco, com frequências de 60% e 71% para cada região, respectivamente12.

Ainda, Campiotto cols11 demonstraram que a frequência do genótipo 3 variou entre as diferentes regiões brasileiras, com maior prevalência em Santa Catarina (50%) e Paraná (41,7%), região sul, bem como Goiás, região centro-oeste (37,1%), e Pernambuco (36,9%).

Dados semelhantes foram publicados por Torres cols, em 2009. Estes autores demonstraram a maior prevalência do genótipo 1, seguido do 3, na população de doadores de sangue do Estado do Amazonas10. Estes dados corroboram aos encontrados para a população de pacientes da Fundação de Medicina Tropical, onde observamos maior prevalência do genótipo 1, seguido do 3. No entanto, naquele estudo os autores não detectaram o genótipo 2 na população de doadores de sangue. Segundo estes autores, a distribuição geográfica demonstra genótipos os 1 e 3 em Manaus, e somente o 1, em amostras obtidas em doadores de sangue do interior. Esta distribuição dos genótipos é semelhante à que é encontrada por muitas cidades brasileiras e países do Oriente e pode refletir na via de introdução do VHC na Amazônia. O vírus foi, provavelmente, introduzido na região amazônica por imigrantes Europeus e medicamentos importados derivados do sangue para o Brasil. Esta hipótese é corroborada pela identificação do genótipo 3, exclusivamente, em Manaus, sugerindo que esta cidade é o ponto de chegada do VHC e que novas cepas foram disseminadas a partir de Manaus para o interior11, revisto por Torres cols10. Em nosso estudo, foi também detectado o genótipo 2 do VHC em pacientes moradores de Manaus, reforçando a hipótese de que esta cidade é a porta de entrada de diferentes genótipos do VHC e distribuição do mesmo para outras localidades, como descrito anteriormente.

Considerações éticas

Aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas.

AGRADECIMENTOS

Os autores agradecem ao serviço de atendimento aos pacientes da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas, Manaus, Amazonas, Brasil. Nós também agradecemos ao Edson da Fonseca Lira pela análise estatística e aos pacientes pelo consentimento em participar do estudo.

CONFLITO DE INTERESSE

Os autores declaram não haver nenhum tipo de conflito de interesse no desenvolvimento do estudo.

SUPORTE FINANCEIRO

Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas (FAPEAM) e Conselho Nacional de Pesquisa (CNPq).

Recebido para publicação em 12/08/2010

Aceito em 16/11/2010

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  • Endereço para correspondência:

    Dra. Adriana Malheiro.
    HEMOAM.
    Av. Constantino Nery 4397
    69050-002 Manaus, AM
    Tel: 55 92 3655-0113
    e-mail:
  • Datas de Publicação

    • Publicação nesta coleção
      25 Out 2011
    • Data do Fascículo
      Out 2011

    Histórico

    • Aceito
      16 Nov 2010
    • Recebido
      12 Ago 2010
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