Constituintes químicos do caule de Protium hebetatuml (Burseraceae)

Chemical constituents from the stem of Protium hebetatuml (Burseraceae)

Constituintes químicos do caule de Protium hebetatuml (Burseraceae)

Chemical constituents from the stem of Protium hebetatuml (Burseraceae)

Túlio de Orleans Gadelha Costa^I; Richardson Alves de Almeida^I; Hector Henrique Ferreira Koolen^I; Felipe Moura Araujo da Silva^I; Angelo Cunha Pinto^II

^IDepartamento de Química, Universidade Federal do Amazonas, 69077-000 Manaus - AM, Brasil Email : [e-mail] , [e-mail], [e-mail], [e-mail]

^IIInstituto de Química da Universidade Federal do Rio de Janeiro, Ilha do Fundão - RJ, Brasil - [e-mail]

RESUMO

Protium é um gênero que se destaca na família Burceraceae, compreende cerca de 146 espécies, das quais um pequeno número tem sido estudada do ponto de vista fitoquímico. Neste trabalho, foram isolados os terpenoides α- e β-amirina, os esteroides campesterol, estigmasterol e sitosterol e a cumarina escopoletina, a partir do tronco de Protium hebetatuml. As estruturas destas substâncias foram identificadas por RMN, MS, IV e por comparação com dados espectrais obtidos naa literatura e com amostras autênticas.

ABSTRACT

Protium is the largest genus in the Burceraceae family, which comprises about 146 species, of which a small number has been studied from the phytochemical point of view. In this work the terpenoids α- and β-amyrin, the steroids campesterol, stigmasterol and sitosterol and the coumarin scopoletin were isolated from the stem of Protium hebetatuml. The structures of these substances were identified by NMR, MS, IV and comparison with spectral data from the literature and with authentic samples.

Keywords:Protium, α-amyrin, β-amyrin, campesterol, stigmasterol, sitosterol, scopoletin.

INTRODUÇÃO

Espécies de Burseraceae são endêmicas na região amazônica e possuem enormes possibilidades econômicas, destacando-se seus óleos essenciais, um dos mais importantes grupos de matérias primas para várias indústrias, notadamente as de perfumaria, alimentícia e farmacêutica (Andrade e Higuchi 2009; Marques et all. 2010). Protium é o gênero que mais se destaca dessa família com 146 espécies, ocorrendo predominantemente na Amazônia Legal e apesar desse número de espécies, poucas foram estudadas sob o ponto de vista químico (Melo et all. 2007). Desse gênero foram identificados terpenóides, esteróides, cumarinas, flavonóides e lignanas (Rüdiger et all. 2007).

As cumarinas possuem diversas propriedades farmacológicas como antiinflamatória, espasmolítica, broncodilatadora, e atua também contra o desenvolvimento de tumores, entre outras (Ito et all. 2005; Osório et all. 2004). A escopoletina, uma cumarina com atividade farmacológica comprovada, atua na regulação da pressão arterial e possui atividade bactericida contra várias espécies, incluindo <i>Escherichia coli</i> (Arisawa et all. 1983). A literatura registra somente duas cumarinas de Protium, sendo essas, escopoletina e propapicina (Bandeira et all. 2002; Zoghbi et all. 1981).

Este trabalho relata o estudo do caule de Protium hebetatum, de onde se obtiveram extratos para proceder com o isolamento e identificação de substâncias, por cromatografia em coluna (CC), espectros de RMN H¹ e C¹³, UV e IV.

Nas separações por CC utilizou-se sílica gel 60 (0,063 - 0,200 mm, Merck). Para cromatografias em camada delgada (CD) utilizou-se cromatofolhas Merck PL de sílica gel 60 (20X20 cm, 0,2 mm espessura). As revelações foram efetuadas em ultravioleta (UV, 254 - 336 mm) em equipamento HP8452A-Diode Array Spectrophotometer, com sulfato cérico e em cubas de vidro saturadas com iodo. Os solventes de corrida empregados foram das marcas Merck e grupo Química. Os pontos de fusão foram determinados em aparelhos munidos com microscópio e base Kofler. Os espectros na região do infra-vermelho (IV) foram realizados em espectrofotômetros Perkin-Elmer, Mod. 467, utilizando pastilhas de KBr e filmes de NaCl. Os espectros de RMN H¹ e C¹³ foram registrados em espectrômetro BRUKER mod. C200 F, utilizando CDCl₃ como solvente, e referencial interno tetrametilsilano (TMS). A cromatografia em fase gasosa acoplada a espectrometria de massas (CG-MS) foi realizada em equipamento HP 5971 com sistema de dados e biblioteca Wiley/NBS.

O material botânico de Protium hebetatuml (caule) foi coletado no bosque da Vivenda Verde, em zona periférica, a noroeste da cidade de Manaus - AM. Após identificado, o material foi depositado no Herbário do Instituto Nacional de Pesquisa da Amazônia (INPA), em Manaus - AM, registrado sob o número 161.420.

Após a coleta, o caule de P. hebetatum foi seco a sombra e temperatura ambiente, em seguida pulverizado em um moinho, resultando em 5.800 g de material botânico, que foi extraído a frio em éter etílico, e álcool etílico obtendo-se 31 e 180 g de extrato, respectivamente.

Os extratos foram submetidos a marchas analíticas qualitativas usuais para a avaliação de seus constituintes principais, observando-se a presença de substâncias fenólicas e terpenoídicas.

O extrato etérico (28.0 g) foi submetido à análise em uma coluna de sílica gel, utilizando como fase móvel hexano, benzeno e acetato de etila. Após evaporação do solvente, resultaram, respectivamente, as frações: EE-1 (1,3 g), EE-2 (9,4 g) e EE-3 (11,8 g).

De modo similar, o extrato alcoólico (170 g) foi submetido à análise em uma coluna de sílica gel, usando como eluentes: hexano, hexano/benzeno (1:1), benzeno, benzeno/ acetato de etila (1:1), acetato de etila e metanol. Após evaporação dos solventes, resultaram respectivamente as frações: EA-1 (1,3 g); EA-2 (2,5 g); EA-3 (2,5 g); EA-4 (7,8 g); EA-5 (28,4 g) e EA-6 (71,0 g).

As frações provenientes dos extratos etérico e alcoólico foram comparadas por cromatografia em CD, observando-se que as frações EE-2 e EA-4 apresentaram semelhança em sua composição, e então, foram reunidas e codificadas como EEA-6, correspondendo a 17,2 g.

A fração de EEA-6 (16,0 g) foi cromatografada em coluna de sílica gel usando-se como fase móvel: hexano, hexano/benzeno (7:3), benzeno, benzeno/acetato (9:1, 8:2 e 1:1), acetato, acetato/metanol (8:2), metanol. As frações coletadas foram comparadas por cromatografia de CD e reunidas segundo a semelhança apresentada, obtendo-se 17 novas frações.

A fração EEA-6-8-13 (110 mg) apresentou-se como um sólido amarelo, que após lavado com hexano a frio, forneceu um sólido branco, codificado como amostra 01 (14,0 mg)

A fração EEA-6-16-18 (550 mg) foi analisada através de cromatografia em CD apresentando uma mistura complexa, na qual destacou-se uma mancha de coloração lilás ao reagente sulfato cérico. Em seguida, esta fração foi cromatografada em coluna de sílica gel, utilizando como fase móvel: hexano, hexano/benzeno (9:1, 8:2 e 1:1). As frações provenientes da eluição com hexano/benzeno (9:1 e 8:2) foram reunidas e após evaporação do solvente apresentaram um material esbranquiçado que lavado com hexano a quente, forneceu um sólido branco de ponto de fusão 136º-138º, codificado como amostra 02.

A fração EEA-6-6-10 depois de lavada com hexano aquecido, forneceu um sólido amarelado (18 mg), que foi codificado como amostra 03.

Após a analise desses resultados, foi possível identificar uma mistura de dois triterpenos: α-amirina e β-amirina (Mahato et all. 1994), de três esteróides: campesterol, estigmasterol e β-sitosterol (Costa et all. 2008) e uma cumarina: escopoletina (Arisawa et all. 1983). As estruturas das substâncias isoladas foram elucidadas por métodos espectroscópicos (CG-EM, CCD, RMN ¹H e ¹³C), identificadas por comparações na literatura e amostras autênticas.

A amostra 01 foi isolada como sólido branco com p. f. 181-184 ºC. A análise por CG/EM, apresentou dois picos com íon molecular m/z 218 Da, o que foi fundamental para diagnosticar que seus dois constituintes fazem parte da ampla classe dos triterpenos, das séries ∆¹² oleanenos e ursenos. As duas séries possuem o mesmo esqueleto carbônico diferindo somente na posição de um grupo metila. Os espectros de massas desses dois isômeros são similares, com diferença apenas na intensidade dos picos. Estas observações, aliadas a comparações cromatográficas, dados na literatura e de amostra autêntica permitiram identificar que o amostra 01 se tratava de uma mistura constituída de α-amirina e β-amirina (Mahato et all. 1994).

A amostra 02 foi obtida como sólido branco com p. f. 181-184 ºC. Seu espectro obtido por IV revelou absorções típicas de estiramento OH e C-H, respectivamente, em 3440 cm-1 e 2960 cm-1 e fraca absorção em 1665 cm^-1, característica de estiramento C=C. Um acoplamento em 835 cm^-1 , correspondente à deformação angular =C-H, indicou tratar-se de substância alifática, confirmando a natureza esteroidal, evidenciada através de reação de Liebermann-Burchard. Contudo, o cromatograma desta amostra obtido por CG/EM revelou 3 picos com tempos de retenção próximos, cujos espectros de massas apresentaram íons moleculares em m/z 400, 412 e 414 Da. Por análise comparativa desses espectros, verificaram-se fragmentações semelhantes, características do esqueleto esteroidal, indicando a perda da cadeia alquílica (R) lateral, com m/z 273 (C₁₉H₂₉O; M-R), m/z 255 (C₁₉H₂₇; (M-R-H₂O), m/z 213 (C_¹⁶H₂₁; M-R-H₂O-C₃H₆), cada constituinte diferindo apenas em intensidade. Com base nestas observações, inferiram-se as respectivas cadeias laterais C₉H₁₉, C₁₀H₁₉, C₁₀H₂₁, com o que se chegou às formulas moleculares, C₂₈H₄₈O, C₂₉H₄₈O, C₂₉H₅₀O. Comparações cromatográficas com amostra autêntica e com dados obtidos na literatura, permitiram concluir que a amostra 02 se tratava de uma mistura constituída de campesterol, estigmasterol e β-sitosterol (Costa et all. 2008).

A amostra 03, após tratamento com hexano a quente foi isolado como sólido amarelo com p. f. 203-250 ºC, seu espectro no IV indicou uma banda larga em 3.350 cm-1 característica de deformação axial do grupo O-H. Observou-se também uma absorção intensa em 1690 cm^-1 , em 1285 a 1140 cm^-1 ,sugerindo a presença de uma carbonila de éster ou lactona α-β insaturada, que foi confirmada no espectro de RMN ¹³C em 161,40 ppm. A ocorrência de 3 bandas (1650, 1560 e 1510 cm^-1 ), próprias de deformação axial C=C indicaram a natureza aromática do composto, enquanto a observação de uma intensa fluorescência azul celeste em 336 nm, aliada ao registro de observações (λ_max, CHCl₃ [log є]) em 242 (2,73), 252 (2,72), 296 ( 2,76), 342 (3,08) nm no espectro de UV, revelou um sistema altamente conjugado, compatível com cromóforos olefinicos, assinalados em δ 6,25 (d, J= 9,5 Hz) e δ 7,58 ( d, J= 9,5 Hz) no espectro de RMN ¹H indicativos da presença de sistema AB, característico dos prótons, H-3 e H-4, da ligação dupla de isomeria cis do anel pirânico. O espectro de RMN 1H apresentou ainda um singleto (3H) em δ 3,96 configurando a presença de uma metoxila e três singletos, δ 6,84 (1H), 6,91 (1H) e δ 6,17 (1H), correspondendo, respectivamente, a 2 hidrogênios do anel benzênico e ao hidrogênio da hidroxila observada no IV. Estes dados estão de acordo com o espectro de RMN ¹³C, confirmando a presença da metoxila em 56,49 ppm e de 8 carbonos sp² em 150,37, 149,81, 144,10, 143,26, 113,48, 111,56, 107,68 e 103,28 ppm. Adicionalmente, o espectro de massas registrou o íon molecular em m/z 192, verificando-se uma diferença de 46 Da em relação à cumarina (C₉H₆O₂), o que levou à confirmação da presença dos grupos OH e CH₃O no anel aromático e definiu a formula molecular C₁₀H₈O₄ para o composto. Um fragmento intenso de m/z 177, correspondendo a M-CH₃ conduziu a localização da metoxila e hidroxila em posições vizinhas (6 e 7) da estrutura cumarínica, compatível com as estruturas quinônicas e justificando os fragmentos em m/z 149 e 121 Da. Assim como os dois singletos aromáticos do espectro de RMN ¹H. Os fragmentos de m/z 149 (M-C=O), 121 (M-2x C=O), também são coerentes com a estrutura de uma cumarina oxigenada em 6 e 7. Esses dados, comparados com os registrados na literatura e de mostra autêntica, levaram a identificação da cumarina escopoletina (Arisawa et all. 1983).

Neste trabalho, foi possível identificar e isolar uma mistura de dois terpenóides (α e β-amirina), de três esteróides (campestrol, estigmasterol e sitosterol) e uma cumarina (escopoletina). Com exceção da escopoletina, todas as substâncias foram identificadas nessa espécie (Silva et all. 2009).

Sendo poucos os grupos de angiospermas realmente ricos em cumarinas, não é de se espantar que a família Burseraceae apresente um potencial de produção de cumarinas reduzido. Ainda sim, observa-se que indivíduos da ordem Sapindales ocupam uma posição de destaque na produção dessas substâncias, sendo a segunda ordem em número de ocorrências, com mais de 1700 cumarinas descritas na literatura. Com o estudo realizado, pode-se sugerir que o gênero Protium é constituído por espécies com potencial na produção de cumarinas.

AGRADECIMENTOS

Aos órgãos financiadores CNPq, CAPES, FAPEAM, pelo suporte financeiro às pesquisas.

BIBLIOGRAFIA CITADA

Recebido em: 24/08/2011

Aceito em: 25/11/2011

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  27 Ago 2012
• Data do Fascículo
  2012

Histórico

• Recebido
  24 Ago 2011
• Aceito
  25 Nov 2011