INTRODUÇÃO
A espécie Parahancornia amapa (Huber) Ducke (Apocynaceae) é uma planta frutífera endêmica do Estado do Amapá distribuída no planalto e florestas inundadas da Região Amazônica. Árvore de grande porte, com 40 a 50 metros de altura, seus frutos são grandes e comestíveis servindo de alimentos aos macacos que vivem nas copas das árvores (Morais et al. 1995). Parahancornia amapa é conhecida popularmente como "amapa", "amapazeiro" ou "mapá", possui um látex denominado de "leite de amapa" empregado pelas comunidades locais para o tratamento de feridas e hematomas na forma de emplastro (cataplasma ou compressa), consumido também como bebida misturada ao mel de abelha em partes iguais, para o tratamento da asma, bronquites e fraqueza física. Tanto suas cascas como seu látex são conhecidos ainda pelos nativos como tônico e anti-sífilis (Berg 1982). O Parahancornia amapa, também, possui propriedade analgésica e anti-inflamatória, potencial cicatrizante além de ser utilizado em afecções do trato digestório (Monteles e Pinheiro 2007).
Estudos fitoquímicos desta espécie relatam a presença de vários compostos nas raízes, látex, cascas. Sendo que, das raízes de P. amapa foram isolados e identificados ésteres 3-β-O-acil lupeóis, os esteróides β-sitosterol, stigmasterol e β-sitosterona e os triterpenos β-amirina, α-amirina, lupeol e seus derivados acetilados (Carvalho et al. 2001). Do látex de P. amapa as frações obtidas com hexano e diclorometano forneceram misturas de 3-O-acillupeol e triterpenos, confirmando resultados de estudos já realizados. No extrato metanólico identificou-se grande quantidade de carboidratos, metilmioinositol e derivados de feniletanóides tendo como principal constituinte o cornosídeo (Carvalho et al. 2008). Dos extratos diclorometano da casca e do látex de um espécime de P.amapa foram isoladas e identificadas substâncias como os triterpenos pentacíclicos lupeol, β-amirina e α-amirina, seus derivados acetilados, ácidos alifáticos e outros ésteres 3-O-acil-lupeol (Sobrinho et al. 1991).
Além dos estudos fitoquímicos relatados anteriormente, verifica-se que do extrato diclorometânico dos galhos foram isolados o β -sitosterol, estigmasterol, além de triterpenóides pentacíclicos, α-amirina, β-amirina, lupeol e friedelina e do extrato metanólico das cascas foi isolado o alcaloide indólico isositsiriquina (Henrique et al. 2014). É importante destacar, também, que o P. amapa apresentou bioatividade da fração metanólica do látex sobre o desenvolvimento de Rhodnius nasutus (Hemiptera, Reduviidae, Triatominae) em condições de laboratório, sendo tais efeitos, na sua maioria tóxicos (Lopes et al. 2014).
Diante do exposto e visando garantir a segurança do uso da espécie, esse estudo objetiva avaliar o efeito toxicológico agudo do extrato bruto metanólico do Parahancornia amapa (EMPA) em modelo animal.
MATERIAL E MÉTODOS
O estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Experimentação Animal da Universidade Federal do Amapá (CEP/UNIFAP), com o número 006A/2011 de acordo com o que preconiza a Resolução de nº 196/96 do Conselho Nacional de Saúde e suas complementares.
Coleta do material botânico
As cascas do caule de Parahancornia amapa (Huber) Ducke (Apocynaceae), conhecida como "amapazeiro", foram coletadas no município de Macapá, Estado do Amapá, Brasil, em novembro de 2011, durante o período de estiagem. Uma exsicata foi depositada no herbário do Instituto de Pesquisa do Estado do Amapá para fins de referência sob o número de registro HAMAB-18350.
Preparação do extrato metanólico das cascas do caule de P. amapa (EMPA)
Para a obtenção do EMPA as cascas do caule foram desidratadas em estufa de ar circulante (Mod. 330, FANEM, Carandiru, SP, BR) a uma temperatura de 45 °C e posteriormente trituradas em moinho de facas (tipo WILLEY) até a pulverização (1000 g). Em seguida, foi realizada a maceração do pó em metanol por um período de 10 dias. A solução extrativa foi filtrada sob vácuo e o concentrado foi obtido em rotavapor (Vinatoru 2001; Ferri 1996) sob pressão reduzida a 78 rpm a uma temperatura máxima de 60 °C, obtendo-se 190 g (19% de rendimento) de uma pasta de coloração marrom-avermelhada.
Animais
No ensaio preliminar de toxicidade, foram utilizadas larvas de Artemia salina L., um microcrustáceo da classe Anostracea, (Brine Shrimp Test), na forma de metanáuplio, utilizando-se a Concentração Letal Média (CL50) como parâmetro de avaliação da atividade biológica (Lopeset al. 2002). Para o ensaio de toxidade aguda pré-clínica foram utilizados ratos machos e fêmeas Wistar (Rattus norvegicus), pesando entre 150 e 250 g, todos provenientes do Biotério do Laboratório de Central de Saúde Pública do Estado do Amapá (LACEN-AP). Os animais foram aclimatados às condições do biotério local por sete dias antes dos ensaios experimentais, sob temperatura de 23±2 °C e ciclos de claro e escuro de 12 horas, sendo alimentados com ração para animais de laboratório (Purina-Nuvilab CR-1 autoclavável; Nuvital, SP, Brasil) e com água ad libitum.
Bioensaio com Artemia salina L. (Brine Shrimp Test)
Para este teste, cerca 25 mg de cistos de A. salinaL. foram incubados em um recipiente que possui dois compartimentos separados por uma parede vazada, contendo água do mar artificial (NaCl 23 g L-1, MgCl2.6H2O 11 g L-1, Na2.SO4 4 g L-1, CaCl2.2H2O 1,3 g L-1, KCl 0,7 g L-1) à temperatura de 20 a 30 oC, sendo utilizado Na2CO3 para ajustar o pH e evitar a morte das larvas. A incidência de luz de uma lâmpada de 40 watt em apenas um dos compartimentos do recipiente estimulava a migração dos metanáuplios (fototropismo), os quais eram obtidos após a eclosão dos cistos, com auxilio de uma pipeta Pasteur, após 24 horas de incubação (Mclaughlin et al. 1998; Meyer et al. 1982). Os ensaios foram realizados em triplicata, buscando-se a determinação da relação dose-resposta. Havia um grupo controle, apenas com a água do mar artificial, e os grupos teste, água do mar artificial com EMPA nas concentrações de 1000, 750, 500, 300, 100, 30, 10, 3 e 1 µg mL-1. Em cada tubo foram colocadas 10 larvas de A. salina L., incluindo o controle, sendo completado até o volume final de 1 mL com água do mar artificial. Após 24 horas, foram contabilizadas larvas mortas e vivas e assim calculada a CL50, determinada pelo método estatístico de Probits (Parra et al. 2001; Mclaughlin et al. 1998). A classificação do extrato seguiu os critérios estabelecidos por Meyer et al. (1982), da seguinte forma: "tóxico" se CL50 < 1000 μg mL-1 e "não tóxicos" se CL50 > 1000 μg mL-1.
Ensaio Toxicológico pré-clínico agudo (dose fixa)
O EMPA foi dissolvido com etanol e diluído em solução fisiológica (SF) a 0,9% e administrado, por gavagem, em um grupo de 12 animais (6 machos e 6 fêmeas) submetidas a jejum de 12 horas; na dose de 2 g kg-1, num volume de 10 mL kg-1. O grupo controle (6 machos e 6 fêmeas) recebeu o mesmo volume de SF a 0,9% (salina). Após a administração da droga na dose citada anteriormente por via oral, realizava-se a observação cuidadosa para se detectar sinais tóxicos de caráter geral nos intervalos: 15, 30, 60, 120 e 240 minutos, a cada 4 horas, até completar 24 horas e diariamente durante 14 dias, sendo avaliadas as seguintes variáveis no "Screening" hipocrático: atividade geral, frêmito vocal, irritabilidade, resposta ao toque, aperto de cauda, contorção trem posterior, endireitamento e retirada (cauda), tônus muscular, força de agarrar, ataxia, reflexo auricular, reflexo corneal, tremores, convulsões, estimulações, Straub, hipnose, anestesia, lacrimação, ptose palpebral, micção, defecação, piloereção, hipotermia, respiração, cianose, alteração na cor da urina e diarréia.
Os resultados foram avaliados através de escalas analógicas unipolares variando de 0 a 4 (Testes com anotação normal .0., a intensidade do efeito varia na escala de 1 a 4; Teste com anotação normal .4., a intensidade do efeito poderá variar de 0 a 3 quando ocorrer diminuição, 4 quando igual ao controle e de 5 a 8 quando ocorrer aumento). Diariamente, foram observados o consumo de água (mL), a ingestão de alimento (g) e a evolução ponderal (g). No 14o dia, os animais que não foram a óbito, e os animais dos grupos controle foram submetidos à retirada de material biológico (sangue), eutanasiados e necropsiados.
Exames Laboratoriais
No 14° dia foram retiradas amostras de sangue através de punção intracardiáca para análise laboratorial de variáveis hematológicas e bioquímicas. Em seguida, os órgãos foram retirados, analisados macroscopicamente, buscando-se possíveis alterações na estrutura, rigidez ou coloração das superfícies e, posteriormente, pesados. Como não foram identificadas alterações macroscópicas, 30% dos órgãos foram encaminhados para o exame histopatológico para avaliação da integridade tecidual dos seguintes órgãos extirpados: fígado, pulmões, coração e rins. As principais variáveis investigadas foram: lesões celulares reversíveis (degenerações) e irreversíveis (necrose e apoptose), infiltração de leucócitos, congestão, extravasamento de sangue e fibrose; de acordo com o protocolo da RES/ANVISA n° 90 (Brasil 2004).
Análise estatística
No bioensaio frente A. salina, para obtenção dos valores de CL50 foi utilizada a análise PROBIT, através do software Microcal Origin, adotando-se um Intervalo de Confiança (IC) de 95%. No estudo de toxicidade aguda os resultados numéricos foram expressos na forma de média ± desvio padrão da média. Os valores obtidos e as diferenças estatísticas entre os grupos experimentais foram detectadas quando submetidos à análise de variância de uma via (one-way ANOVA) seguida do teste de Tukey-Kramer quando o número de grupos era maior que 2. No caso da análise entre grupos de ratos (machos e fêmeas) tratados e não tradados com o EMPA, recorreu-se ao teste "t" de Student não pareado (unpaired t test). Para tal, considerou-se, a princípio, a hipótese nula de que todas as amostras seriam estatisticamente semelhantes, adotando-se IC de 95%, com nível de significância estatística (p) menor que 5% (p <0,05) para rejeitar a hipótese nula.
RESULTADOS
No bioensaio com Artemia salina, para averiguar provável toxicidade preliminar, o EMPA apresentou CL50 de 7647,62 μg mL-1, com 95% de confiança e p<0,05, o que, segundo critérios estabelecidos por Meyer et al. (1982), indica que o extrato é "não tóxico". Sendo assim, o ensaio de letalidade permite a avaliação da toxicidade aguda e, portanto, é considerado essencial como bioensaio preliminar no estudo de compostos com potencial atividade biológica, sendo atualmente aceito pela comunidade científica (Cavalcante et al. 2001).
No ensaio toxicológico pré-clínico agudo (dose fixa) a administração da dose de 2 g kg-1 do EMPA em Ratos Wistar machos e fêmeas não provocou nenhuma alteração aparente fora dos parâmetros comportamentais analisados, nos intervalos estabelecidos, quando comparados aos obtidos com o grupo controle (salina). Não ocorreu morte seguida à administração, também não ocorreu morte durante o período de análise (14 dias). Portanto, as observações não mostraram sinais de toxicidade como perda de massa corporal, inibição do crescimento, alterações comportamentais e clínicas graves quando comparado aos grupos controle. Sendo assim, não houve cálculo da DL50.
Em relação à evolução ponderal, a análise não mostrou diferença significativa entre os grupos controle (salina) e EMPA (p>0,05, ANOVA seguido do teste de Tukey-Kramer), sendo que os dois ganharam peso relativo ao longo das duas semanas de observação. Percebeu-se ligeira redução de ganho de massa na primeira semana nos animais que receberam EMPA, quando comparadas ao grupo controle (salina). No entanto, essa redução foi revertida ao término do experimento (14 dias). Após esse período, houve ganho de massa em todos os grupos e não houve diferenças significativas entre as massas médias finais.
Realizou-se a ANOVA de única via seguido do teste de Tukey-Kramer entre a diferença de peso dos animais no início da avaliação, no 8° e no 14° dias. Observou-se que não houve diferença significativa entre os grupos controle (solução salina) e o teste (EMPA); tanto do grupo de machos como de fêmeas. Confirmando assim, que após 14 dias de avaliação, os pesos médios dos ratos do grupo controle e teste apresentaram-se estatisticamente semelhantes.
Quando analisados o consumo de água (mL) e alimento (g), nenhuma alteração significativa foi detectada entre os grupos controle e teste, tanto na primeira como na segunda semana no grupo de ratos machos (ANOVA de única via seguido do teste de Tukey-Kramer). Porém, avaliando-se o consumo de água entre os grupos controle e teste de animais fêmeas foi registrada uma diferença significativa (p<0,05) (Tabela 1).
TABELA 1 Consumo de água no período de 14 dias (média ± desvio padrão) de ratos Wistar machos (M) e fêmeas (F) grupos tratados agudamente com EMPA (Extrato Metanólico de P. amapa) (2 g kg-1) e grupos teste tratados com salina (controle) (ANOVA de única via seguido do teste de Tukey-Kramer, p<0,05). *p<0,05.

Não foram detectadas alterações na estrutura, rigidez ou coloração das superfícies dos órgãos avaliados macroscopicamente, bem como, não foram detectadas diferenças significativas entre as massas do fígado, rins, pulmões e coração dos grupos de ratos Wistar macho e fêmea tratados com EMPA quando comparados ao grupo controle (Tabela 2). Na análise histopatológica não foi observada nenhuma alteração que comprometesse a integridade tecidual dos órgãos extirpados.
TABELA 2 Avaliação da massa relativa (média ± desvio padrão) do coração, pulmões, fígado e rins de ratos (M) e ratas (F) após catorze dias, no teste de toxicidade aguda. Os grupos teste EMPA (Extrato Metanólico do P. amapa) (2 g kg-1) e o grupos controle (salina) foram comparados para obtenção do nível de significância (teste "t" de Student, p<0,05).

Quanto às variáveis bioquímicas analisadas não foram observadas alterações estatisticamente significativas (Tabela 3). Nos resultados hematológicos relacionados com a série eritrocitária, leucocitária e megacariocitária, observou-se um aumento significativo (p<0,05) na contagem de plaquetas do grupo teste, tanto de machos quanto de fêmeas, quando comparados com o grupo controle (Tabela 4).
TABELA 3 Níveis séricos de parâmetros bioquímicos em ratos machos (M) e fêmeas (F) tratados com EMPA (Extrato Metanólico de P. amapa) (2 g kg-1) e o grupo controle tratado com salina. Dados expressos pela média± desvio padrão e nível de significância p (teste "t" de Student, p<0,05).

DISCUSSÃO
De acordo com os resultados do bioensaio com A. salina, o EMPAnas concentrações testadas, no período de exposição de 24 h, apresentou CL50 de 7647, 62 µL mL-1, considerando IC de 95% e, de acordo a classificação adotada, sugere-se que o extrato, a partir desse ensaio preliminar, não apresenta toxicidade, porém, possui provável bioatividade. Verificou-se, através do ensaio toxicológico pré-clínico agudo (dose fixa), que o EMPA não apresentou efeito tóxico aparente, após a administração de 2 g kg-1 em ratos Wistar machos e fêmeas, indicando que o extrato administrado agudamente é pouco tóxico, uma vez que não foram observados sintomas adversos nem mortalidade. Estes resultados convergem com a ausência de relatos de efeitos tóxicos decorrentes do uso empírico do P. amapa.
O EMPA não provocou nenhuma alteração na atividade geral e consciência dos animais, tampouco influenciou na coordenação motora ou nos reflexos, além de não influenciar outras atividades fisiológicas relacionadas com Sistema Nervoso Central (como tremores, convulsões, straub, hipnose, anestesia) ou Autônomo (como lacrimação, respiração, cianose, ptose, salivação, micção, defecação, piloereção, hipotermia); podendo-se dizer que o extrato em questão, a partir das variáveis analisadas, corroborando com o resultado de baixa toxicidade.
Na toxicidade aguda pré-clínica, os sinais de toxicidade sistêmica são definidos considerando a redução na massa corporal, além da redução do desenvolvimento ponderal dos animais experimentais (Tofovic e Jackson 1999; Raza et al. 2002; Teo et al. 2002). Outros sinais de toxicidade podem se expressar pela alteração da massa relativa dos órgãos, alterações hematológicas e bioquímicas sanguíneas (Gonzalez e Silva 2003).
Levando-se em consideração os resultados registrados neste teste, houve diferença significativa (*p<0,05) entre os grupos controle e teste de ratas (F) quando avaliado o consumo de água. Porém, como nos grupos de ratos machos não foi observada nenhuma alteração significativa quanto a este critério, não é possível estabelecer, a princípio, uma relação entre a alteração no consumo de água e a administração aguda do EMPA.
Além disso, observou-se um aumento significativo (p<0,05) na contagem de plaquetas do grupo de ratos tratado com EMPA, machos e fêmeas, quando comparados com o grupo tratado com salina e, apesar das alterações na série megacariócitária (plaquetas), não foram observadas outras alterações significativas nas séries eritrocitária e leucocitária que permitissem correlacionar com o número de plaquetas.
A elevação de plaquetas circulantes vem sendo observada em uma variedade de condições fisiológicas e patológicas. As doenças mieloproliferativas são frequentemente acompanhadas por um persistente aumento da contagem de plaquetas, assim como o stress por exercícios acompanhados por um transitório e moderado aumento de plaquetas, e durante o tratamento de algumas anemias (Ogston e Dawson 1969).
A trombocitose associada à anemia ferropriva, sempre foi relatada em adultos e crianças, além de trombocitopenia ocorrentes em estados mais severos da anemia, sendo que, em ambas as condições os valores retornam ao normal após o tratamento com ferro. Estudos em ratos para investigar a relação do ferro com as plaquetas demonstraram que a homeostasia das plaquetas sofre influência com a intensidade e duração da anemia (Choi e Simone 1973). O aumento na contagem de plaquetas promovido pela administração aguda de EMPA pode sugerir que a espécie possua constituintes estimuladores da liberação de trombopoietina, que é o principal regulador fisiológico da produção de plaquetas.
Considerando-se tal estudo e levando em consideração que não foram observadas alterações de outras variáveis hematológicas, tampouco o registro de quadros anêmicos, não é possível correlacionar tais eventos com o aumento significativo do número de plaquetas registrado nesta pesquisa. Além disso, na busca de pesquisas que revelassem a atividade biológica dos compostos farmacologicamente ativos descritos para P. amapa, não foram encontrados relatos que descrevam qualquer ligação entre a presença de tais compostos e a indução de trombocitose em modelos experimentais. Assim, fica a expectativa de novos estudos que possam elucidar tal achado hematológico.
A regulação de água e eletrólitos e a eliminação dos resíduos metabólicos são essenciais à manutenção da homeostase. O sistema renal exerce papel de extrema importância na realização dessas funções. No presente estudo não foram observadas alterações na estrutura e função renais, bem como não foram observadas alterações significativas nos valores de eletrólitos pesquisados.
Outro aspecto importante é a avaliação laboratorial das dislipidemias determinadas pelas dosagens de lipídeos como colesterol total (CT) e triglicerídeos. As alterações dessas moléculas são primordiais para avaliar, juntamente com outras variáveis, doenças do sistema cardiovascular e doenças pancreáticas. Neste trabalho, não foram observadas alterações significativas que permitissem indicar um possível evento tóxico relacionado com a administração aguda do EMPA. Sabe-se, também, que o sistema hepatobiliar apresenta centenas de funções conhecidas, entre as quais as metabólicas, excretoras e secretoras, armazenamento, protetoras, circulatórias e coagulação sanguínea e, segundo os dados obtidos, não houve registro de evento hepatotóxico em decorrência da administração do EMPA.
Deve-se considerar, também, que o músculo cardíaco e o músculo esquelético possuem atividade ou concentração elevada de enzimas e proteínas envolvidas na geração de enzimas e na contração muscular, portanto a dosagem de índices como a creatina-fosfoquinase (CK-NAC) é importante quando se busca analisar a função cardíaca e músculo esquelético e, com base em nossos achados, o uso P. amapa, da forma como foi realizado, a princípio, não representa risco a estrutura e função dos músculos cardíaco e esquelético. Não houve também alterações significativas e indicativas de intoxicação provocada pela administração do EMPA no exame anatomopatológico.
Considerando-se tais resultados e levando-se em consideração que muitos destes processos patológicos se apresentam na forma de quadro crônico, estimulando o uso tradicional de plantas medicinais em regime de uso constante e duradouro, observa-se que a avaliação da toxicidade do P. amapa é de fundamental importância para a saúde pública, levando-se em conta que tal espécie é comumente usada por populações tradicionais como antiinflamatória, antiulcerogênica, antinociceptiva, entre outros atividades.
CONCLUSÃO
O uso das cascas do caule do P. amapa como fonte medicinal pode ser considerado aparentemente seguro, quando administrado por via oral. Para tal fim, fazem-se necessários estudos mais prolongados (toxicidade sub-crônica e crônica) para averiguar o desenvolvimento de prováveis danos nos sistemas fisiológicos decorrentes da administração crônica do P. amapa.