Efeitos da lipoproteína LDL-oxidada sobre a proliferação e a motilidade espontânea in vitro de células endoteliais de artérias coronárias humanas

Resumos

OBJECTIVE: To investigate the effects of low concentrations of oxidized LDL (oxLDL) on the proliferation and spontaneous motility of human coronary artery endothelial cells (HCAEC) in culture. METHODS: Cultures of HCAEC were treated with low concentrations of native LDL (nLDL) isolated from human plasma and with LDL minimally oxidized through different chemical methods; the effects were compared. RESULTS: Native LDL had no deleterious effects on in vitro proliferation and motility of HCAEC; however, at its highest concentration and for a longer exposure, nLDL inhibited cell proliferation. The LDL chemically oxidized by spermine nonoate (SNO) and 3-morpholinylsydnonimine (SYN-1) had significant inhibiting effects on in vitro proliferation and motility of HCAEC, which were proportional to the greatest concentrations and degrees of oxidation of LDL. CONCLUSION: OxLDL has a cytotoxic effect, inhibiting the proliferation and spontaneous motility of HCAEC in culture. This effect is proportional to the concentration and degree of oxidation of LDL; native LDL is relatively innocuous.

oxidized LDL; coronary artery endothelial cells; cardiovascular atherosclerotic disease

ARTIGO ORIGINAL

Efeitos da lipoproteína LDL-oxidada sobre a proliferação e a motilidade espontânea in vitro de células endoteliais de artérias coronárias humanas

Hermes Toros Xavier; Dulcinéia Saes Parra Abdalla; Tania Leme da Rocha Martinez; José Antonio Franchini Ramires; Antonio Ricardo de Toledo Gagliardi

São Paulo, SP

Instituto do Coração da Faculdade de Medicina da USP e Faculdade de Ciências Farmacêuticas da USP

^{Endereço para correspondência}

RESUMO

OBJETIVO: Investigar os efeitos de baixas concentrações de LDL oxidada (LDL-ox) sobre a proliferação e a motilidade espontânea de células endoteliais de artérias coronárias humanas (CEACH) em cultura.

MÉTODOS: Culturas de CEACH foram tratadas com baixas concentrações de LDL nativa (LDLn), isolada de plasma humano, e com LDL minimamente oxidada por diferentes métodos químicos, e os efeitos, comparados entre si.

RESULTADOS: LDLn não apresentou efeitos deletérios sobre o endotélio em proliferação e na motilidade in vitro de CEACH, porém na mais alta concentração e por tempo mais prolongado inibiu a proliferação celular. As LDL-ox, quimicamente, pela espermina nonoato (ENO) e 3-morfolinosidnonimina (SIN-1) expressaram efeitos inibitórios significativos sobre a proliferação e a motilidade in vitro de CEACH proporcionais às maiores concentrações e graus de oxidação das LDL.

CONCLUSÃO: LDL-ox apresenta efeito citotóxico, inibindo a proliferação e a motilidade espontânea de células endoteliais de artérias coronárias humanas em cultura, proporcionalmente à concentração e ao grau de oxidação da LDL, enquanto, LDL nativa é relativamente inócua.

Palavras-chave: LDL-oxidada, células endoteliais de artérias coronárias humanas, doença aterosclerótica cardiovascular.

Níveis plasmáticos elevados de lipoproteína de baixa densidade (LDL) são considerados um dos principais fatores de risco para o desenvolvimento de doença aterosclerótica cardiovascular. A hipótese da resposta à injúria da aterosclerose propõe que o primeiro passo na aterogênese é a disfunção endotelial induzida pela ação dos fatores de risco, em especial, pela exposição do endotélio vascular à LDL oxidada (LDL-ox)¹.

Estudos preliminares revelaram que preparações de LDL humana isolada exercem efeitos tóxicos sobre células endoteliais em cultura^2-4. As LDL nativas (LDLn) sofrem alterações químicas relacionadas com a peroxidação de ácidos graxos polinsaturados, constituintes da lipoproteína, que resultam em um grande aumento na sua susceptibilidade à fagocitose e à degradação por macrófagos⁵.

Foi demonstrado in vitro que os principais tipos de células da parede vascular, as células endoteliais, as células musculares lisas e os macrófagos são capazes de oxidar a LDL nativa⁶. A LDL oxidada inibi a migração das células endoteliais, mecanismo essencial nos processos de restabelecimento da integridade vascular após dano na angiogênese, de forma proporcional à concentração e ao grau de oxidação da LDL, mediado pela formação dos hidroperóxidos lipídicos⁷.

Estudos recentes demonstraram que os componentes lipídicos da LDL-ox^8,9 causariam um aumento parodoxal na produção do fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF) por células endoteliais em cultura, um provável mecanismo protetor frente à agressão celular. Foi observado um duplo efeito da LDL-ox, induzindo proliferação celular em baixas concentrações (5 a 10 mg/mL) e apoptose em concentrações acima de 50 mg/mL¹⁰.

As células endoteliais constituem uma população heterogênea. Células endoteliais oriundas de diversos leitos vasculares expressam antígenos de superfície característicos, transportadores intracelulares específicos e regulação de enzimas intracelulares diferentes ¹¹.

Considerando a importância da heterogeneidade da célula endotelial, os dados contraditórios da literatura e visando contribuir para um melhor entendimento dos processos básicos que envolvem a interação LDL-ox e célula endotelial, realizamos o primeiro estudo sistematizado utilizando células endoteliais de artérias coronárias humanas (CEACH) em cultura, cujo papel na aterogênese coronária é primordial.

Investigamos e descrevemos os efeitos de baixas concentrações das lipoproteínas LDLn e LDL-ox quimicamente por diferentes métodos e tempos de oxidação sobre a proliferação celular e a motilidade espontânea in vitro.

Métodos

Utilizamos a linhagem celular de células endoteliais de artérias coronárias humanas obtidas através da CLONETICS (BioWhittaker Inc., Walkersville, MD/USA). O meio de cultura utilizado foi MCDB-131 (GIBCO) adicionado de 10 ng/ml EGF (INTERGEN), 1,0 mg/mL hidrocortisona (SIGMA), 50 mg/mL de anfotericina B (GIBCO), 100 U/mL de penicilina e de estreptomicina (GIBCO) e 10% de soro fetal bovino (SFB) (GIBCO) adicionado de L-glutamina 1 mM (GIBCO). Os experimentos foram realizados em meio contendo 5% de SFB.

A contagem de células para a avaliação da proliferação e migração celular foi feita sob microscopia direta (Nikon-TMS) com aumento de 100 vezes e realizada em três campos microscópicos distintos representativos para cada placa e calculada a média de células visualizadas.

O ensaio de migração celular foi realizado de acordo com o modelo de cicatrização in vitro, estabelecido por Burk¹². Em resumo, as células endoteliais foram cultivadas em placas de cultura de 60 mm (FALCON) em 5 ml de meio de cultura e 10% SFB. Dois dias após a cultura se tornar totalmente confluente, realizamos uma lesão na camada confluente unicelular com o auxílio de uma lâmina de barbear rígida, pressionada contra o assoalho da placa de cultura, cortando a camada de células e marcando a placa. A lâmina foi então movida cuidadosamente para um lado removendo parte da camada unicelular. As células foram lavadas por duas vezes com PBS para a remoção de material celular deslocado, adicionado meio de cultura experimental (5% SFB) suplementado de concentrações variáveis de LDLn e LDL-ox. Quatro placas foram utilizadas como controle ou experimentais, para cada ponto do experimento.

Após 24h de incubação, contamos o número de núcleos celulares que cruzaram a linha demarcada na placa, em três campos microscópicos distintos representativos para cada placa e calculamos a média de células que ultrapassaram a linha demarcada.

A purificação da LDLn foi feita a partir do plasma humano utilizando-se o método descrito por Sevanian e cols¹³. A LDLn foi armazenada em temperatura inferior a -70ºC até o momento da sua utilização.

As amostras de LDL (0,5 mg/ml de proteína) foram submetidas à oxidação com 1,0 mM de 3-morfolinosidnonimina (SIN-1) ou 1,0 mM de esperminanonoato (ENO) (SIGMA). As amostras foram incubadas em banho-maria (37ºC) sob agitação constante nos tempos 1, 5, 10, 15, 30, e 60min. A reação foi bloqueada com 100 mM de ácido dietileno tetraminopentacético, 100 mM de butilhidroxitolueno, 125 unidades/ml de superóxido dismutase e 125 unidades/ml de catalase. Todas as amostras foram mantidas em freezer a -20ºC até o momento dos experimentos¹⁴.

Na análise estatística, para a comparação das concentrações foi utilizado o teste não-paramétrico de Kruskal-Wallis, considerado o mais eficiente para amostras independentes e para as comparações múltiplas foi utilizado o teste de Dunn¹⁵. Foram utilizados testes não-paramétricos porque a suposição de normalidade dos dados foi rejeitada. O nível de significância utilizado para os testes foi de 5%.

Resultados

A figura 1 mostra o efeito das preparações de LDLn sobre a proliferação celular em culturas parcialmente confluentes (60%) de células endoteliais de artérias coronárias humanas. Após exposição por 72h à concentrações variáveis de lipoproteínas, as culturas foram lavadas por 2 vezes com PBS (GIBCO) e coradas pelo método de GIEMSA. A contagem de células foi feita sob microscopia (NIKON-TMS) com aumento de 100 vezes e realizada em três campos microscópicos distintos representativos para cada placa e calculada a média do número de células.

Observamos um efeito inibitório da LDLn sobre a proliferação celular na concentração máxima utilizada, o que pode ser explicado pelo maior tempo de exposição e à oxidação da LDL pelas próprias células endoteliais em cultura.

Nas figuras 2 e 3 mostramos os efeitos da LDL-ox pelo sistema da ENO por 1 e 10min, respectivamente, sobre a proliferação celular, observando em ambos um efeito inibitório proporcional ao tempo de oxidação.

As figuras 4 e 5 mostram os importantes efeitos inibitórios da LDL-ox pelo sistema SIN-1 por tempos de oxidação de 1 e 10min, sobre a proliferação celular.

Em resumo, os resultados do tratamento de culturas endoteliais parcialmente confluentes, por 72h, com LDLn e LDL-ox pelos sistemas químicos da ENO e SIN-1 sobre a proliferação celular, mostraram que: a LDL oxidada pela ENO e pela SIN-1 exerceram efeito inibitório na proliferação celular proporcional ao tempo de oxidação e à concentração de LDL-ox; a LDL oxidada pela SIN-1 apresentou efeito tóxico mais intenso que os outros tratamentos; a LDLn apresentou efeito inibitório somente na maior concentração estudada.

A figura 6 mostra o efeito das preparações de LDLn sobre a motilidade espontânea de células endoteliais de artérias coronárias humanas pelo ensaio de migração celular realizado pela técnica de Burk. Observamos que a LDLn não apresentou nenhum efeito inibitório sobre a migração celular.

As figuras 7 e 8 mostram os efeitos da LDL oxidada pela SIN-1 para os tempos de oxidação de 1 e 10min, onde observamos efeitos diretamente relacionados à concentração e ao tempo de oxidação da LDL.

A figura 9 mostra microfotografia representativa do experimento de motilidade celular. Observa-se nitidamente um número muito menor de núcleos celulares que atravessaram a linha demarcada no campo tratado (B) em comparação ao controle (A), demonstrando a migração celular inibida.

Em resumo, os resultados do tratamento de culturas endoteliais com LDLn e LDL-ox pelo sistema SIN-1, por 24 horas, na avaliação da motilidade celular, pela técnica de Burk, mostraram que: a LDLn não apresentou efeito inibitório na migração celular; a LDL-ox pela SIN-1 inibiu a migração celular; e o efeito observado foi proporcional ao tempo de oxidação e à concentração de LDL- ox.

Discussão

Recentemente, estudos têm demonstrado que os produtos de oxidação do colesterol, gerados pela modificação oxidativa da LDL, os hidroperóxidos de colesterol, conferem citotoxicidade à partícula e são relevantes para a patogênese e progressão da aterosclerose tendo sido identificados em placas de ateroma e em plasma humano^16,17.

Os mecanismos moleculares que iniciam a oxidação da LDL in vivo ainda são desconhecidos, no entanto, sabemos que algumas substâncias, como o peroxinitrito, participam efetivamente do processo de modificação da LDL, a peroxidação lipídica¹⁸. Utilizamos o método de oxidação química da LDL por dois sistemas, SIN-1 e ENO. A SIN-1 é reconhecida como geradora de peroxinitrito e sua utilização nos experimentos pode ser justificada porque esse processo ocorre em fluxo lento e de forma constante, o que seria mais semelhante à via de formação do peroxinitrito em situações fisiológicas. A SIN-1 tem alto grau de oxidação, pois oxida tanto a porção protéica quanto a lipídica da LDL^19,20. A ENO, geradora de óxido nítrico, atua promovendo oxidação apenas do conteúdo lipídico da LDL, com baixo grau de oxidação. Assim, a geração de produtos de oxidação pelos dois sistemas produz uma LDL com diferentes graus de oxidação e em diferentes sítios da molécula¹⁴.

As concentrações de LDL-ox comumente utilizadas em experimentos (25 a 100 mg/mL) são consideravelmente mais elevadas do que os níveis de LDL-ox encontrados no plasma humano (0,1 mg/mL)^21,22. Devemos considerar, porém, que nas lesões ateroscleróticas a LDL-ox está localizada e concentrada no espaço subendotelial, porque é retida na matriz extracelular durante a formação da placa de ateroma. Assim, grandes quantidades de LDL-ox, em concentrações muito maiores que as plasmáticas, estão acumuladas nessa região. A LDL retida nesse microambiente, ideal para oxidação, é mais intensamente oxidada apresentando características similares às LDL oxidadas pelos diversos sistemas utilizados nos estudos experimentais²³.

Neste estudo, optamos por utilizar baixas concentrações (1 a 8 mg/mL) de LDL procurando agregar maior relevância aos nossos resultados em função das concentrações estudadas encontrarem-se mais próximas da situação fisiológica real e assim, investigarmos os seus efeitos biológicos sobre as culturas celulares.

Dados de experimentação obtidos com células endoteliais provenientes de um determinado órgão, não devem ser extrapolados automaticamente para outros sistemas, em decorrência da heterogeneidade dessa linhagem celular. Parte considerável das informações existentes na literatura sobre os complexos mecanismos envolvidos na aterosclerose e na angiogênese humana foi obtida com células endoteliais de cordão umbilical, o que mereceria, portanto, uma certa cautela na interpretação dos resultados: o endotélio do cordão umbilical convive com altíssimas concentrações de hormônios esteróides e baixo regime pressórico, diferentemente do leito endotelial que participa do processo aterosclerótico coronariano¹¹. Por esse motivo, optamos pela utilização em nosso trabalho da linhagem de células endoteliais de artérias coronárias humanas.

Culturas de células endoteliais totalmente confluentes podem servir de modelo para estudos in vitro do endotélio vascular, já que as propriedades básicas da célula endotelial são preservadas. As células em cultura parcialmente confluente (60%) estão em proliferação e nessa fase são muito mais sensíveis a agentes agressores do que no estado de plena integridade da confluência total.

Em nossos experimentos, observamos que LDL-ox inibiu a proliferação e a motilidade in vitro de células endoteliais de artérias coronárias humanas, efeitos estes, diretamente relacionados à concentração e ao grau de oxidação da lipoproteína. Nossos resultados podem sugerir a ocorrência de efeitos similares das LDL-ox presentes nas paredes vasculares, nas placas ateroscleróticas e mesmo circulantes no plasma, reforçando dados da literatura que indicam a participação da LDL-ox em eventos cardiovasculares^24,25.

Recentemente, foi demonstrado pela primeira vez que níveis plasmáticos elevados de LDL-ox se relacionam diretamente com a instabilidade da placa em lesões ateroscleróticas de artérias coronárias humanas. Os níveis de LDL-ox foram dosados em pacientes com infarto agudo do miocárdio, angina instável, angina estável e controles, revelando uma correlação positiva com a gravidade da síndrome coronariana aguda. Os níveis séricos de LDL-ox eram quatro vezes mais elevados nos pacientes com infarto agudo do miocárdio quando comparados aos controles, sugerindo que LDL-ox circulante pode se constituir em um marcador de gravidade em eventos cardiovasculares²⁶.

Considerando os nossos resultados, com a demonstração de que LDL-ox, em concentrações semelhantes às encontradas na fase aguda de síndromes coronarianas, inibe a proliferação e a motilidade de células endoteliais de artérias coronárias humanas in vitro, podemos sugerir que níveis elevados de LDL-ox, por sua citotoxidade, possam interferir negativamente não somente na instabilização da placa aterosclerótica bem como no restabelecimento da integridade vascular pós-injúria, piorando o prognóstico dos pacientes.

Concluímos, então, que os efeitos da LDL-ox sobre o endotélio coronariano em cultura, inibindo a proliferação e a motilidade celular, mecanismos capitais na reendotelização de áreas lesadas da parede e no processo de angiogênese vascular, são proporcionais à concentração e ao grau de oxidação da LDL e poderíamos ainda, inferir que intervenções clínicas que controlem e preservem a integridade dessas variáveis devam ser perseguidas para minimizar os efeitos deletérios e mudar a história natural da doença arterial coronariana.

A interpretação de nossos dados, porém deve ser feita à luz das limitações inerentes da experimentação in vitro que é muito valiosa no esclarecimento de mecanismos fisiopatológicos, porém não devem ser diretamente extrapolados para a situação in vivo onde atuam um sem número de outros fatores não controlados.

Recebido para publicação em: 11/06/2003

Aceito em: 14/04/2004

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  07 Jan 2005
• Data do Fascículo
  Dez 2004

Histórico

• Aceito
  14 Abr 2004
• Recebido
  11 Jun 2003