O polimorfismo VNTR no gene codificador do antagonista do receptor da interleucina-1 está associado com a doença arterial coronariana

Resumos

BACKGROUND: Coronary Artery Disease (CAD) is the atherosclerosis of coronary arteries that carry blood to the heart muscle. Atherosclerosis is an inflammatory disease. Cytokine gene variations such as those associated with the IL1 family are involved in the pathogenesis of atherosclerosis. OBJECTIVE: The purpose of this study was to determine the relationship between IL1 family polymorphisms (IL1RN VNTR, IL1B positions -511 and +3953) and CAD in Turkish population. METHODS: 427 individuals were submitted to coronary angiography and were grouped as 170 control subjects and 257 CAD patients. The CAD subjects were divided into two subgroups: 91 Single Vessel Disease (SVD) and 166 Multiple Vessel Disease (MVD) subjects. The genotypes of IL1RN and of IL1B (-511, +3953) were determined by polymerase chain reaction (PCR) followed by restriction digestion analysis. RESULTS: No significant difference was found in IL1RN and IL1B (-511 and +3953) genotype distributions between CAD and control subjects or MVD and control subjects. However, significant association was seen in IL1RN 2/2 genotype between SVD and control subjects (P= 0.016, x2: 10.289, OR: 2.94, 95% CI: 1.183-7.229). Similarly, no statistically significant difference was found in IL1RN and IL1B (-511 and +3953) allele frequencies between CAD and control subjects, MVD and control subjects or SVD and control subjects. CONCLUSION: No association was found in either allele frequency or genotype distribution of IL1RN and IL1B polymorphisms between CAD and the control groups. However; IL1RN 2/2 genotype may be a risk factor for SVD in the Turkish population.

Interleukin 1; mini-satellite repeats; coronary arteriosclerosis; population; Turkey

ARTIGO ORIGINAL

BIOLOGIA MOLECULAR

O polimorfismo VNTR no gene codificador do antagonista do receptor da interleucina-1 está associado com a doença arterial coronariana

Ahmet Arman; Ozer Soylu; Ahmet Yildirim; Andrzej Furman; Nesrin Ercelen; Hakki Aydogan; Ajda Coker; Tuna Tezel

Departamento de Cardiologia da Faculdade de Engenharia da Universidade Marmara, Hospital Dr. Siyami Ersek; Instituto de Ciências Ambientais, Universidade Bogazici; Departamento de Genética Médica, Hospital Americano; Departamento de Biologia, Artes e Ciências da Universidade Marmara, Istambul, Turquia

^{Correspondência}

RESUMO

FUNDAMENTO: A Doença Arterial Coronariana (DAC) é a aterosclerose das artérias coronárias que transportam o sangue para o coração. A aterosclerose é uma doença inflamatória. As variações gênicas das citocinas – como as associadas à família IL1 – fazem parte da patogênese da aterosclerose.

OBJETIVO: O objetivo deste estudo foi determinar a relação entre os polimorfismos da família IL1 (VNTR do IL1RN, posições -511 e +3953 do IL1B) e a DAC na população turca.

MÉTODOS: Um total de 427 indivíduos foram submetidos à angiografia coronariana e em seguida divididos da seguinte forma: 170 no grupo controle e 257 no grupo de pacientes com DAC. Os sujeitos com DAC foram divididos em dois subgrupos: 91 no grupo de Doença Coronariana em um único vaso (Single Vessel Disease - SVD) e 166 no grupo Doença Coronariana em múltiplos vasos (Multiple Vessel Disease - MVD). Os genótipos de IL1RN e IL1B (-511, +3953) foram determinados por reação em cadeia da polimerase (RCP), seguida de análise da digestão por enzima de restrição.

RESULTADOS: Não foram observadas diferenças significantes nas distribuições de genótipos de IL1RN e IL1B (-511 e +3953) entre os sujeitos com DAC e os controles, ou entre sujeitos com MVD e controles. No entanto, observou-se uma relação significante no genótipo IL1RN 2/2 entre sujeitos portadores de SVD e controles (P= 0,016, x2: 10,289, OR: 2,94IC 95% 1,183 - 7,229). Tampouco foi observada diferença estatisticamente significante nas freqüências dos alelos de IL1RN e IL1B (-511 e +3953) entre os sujeitos com DAC e controles, os sujeitos com MVD e controles, ou ainda os sujeitos SVD e controles.

CONCLUSÃO: Não foi observada nenhuma relação na freqüência alélica e nem na distribuição genotípica dos polimorfismos de IL1RN e IL1B entre sujeitos com DAC e grupos controle. No entanto, o genótipo IL1RN 2/2 pode representar um fator de risco para sujeitos com SVD na população turca.

Palavras-chave: Interleucina 1, repetições mini-satélites, aterosclerose coronariana, população, Turquia / epidemiologia.

Introdução

A aterosclerose é uma doença inflamatória que afeta as artérias grandes ou médias e causa gangrena, acidente vascular cerebral e doença coronariana. A doença arterial coronariana (DAC) é uma doença cardíaca causada pela aterosclerose das artérias coronárias¹. Fatores como crescimento e coagulação, citocinas, moléculas de adesão e seus efeitos nas células endoteliais (CE) e células de músculos lisos (SMC- Smooth Muscle Cells) foram estudados para maior compreensão dos processos da aterosclerose². A inflamação das paredes da artéria desencadeia a produção de citocinas pró-inflamatórias primárias como a Interleucina-1β (IL-1β), o Fator de Necrose Tumoral α (TNFα), que pode induzir a citocina pró-inflamatória secundária (IL-6), a quimiocina (IL-8) e a produção da molécula de adesão (E-selectina)³.

A família IL-1 tem três membros muito bem estudados, dois agonistas - IL-1α e IL-1β - e o antagonista IL-1Ra. A IL-1Ra inibe a ação inflamatória induzida pela IL-1 ao bloquear a ligação de IL-1 ao receptor tipo I da IL-1 (IL-1RI)⁴. IL-1Ra se expressa pelo gene IL1RN, que apresenta uma variação de comprimento dentro do intron 2⁵ causada por número variável de repetições em tandem (Variable Number of Tandem Repeats - VNTR) com 86 pares de bases (bp).⁶ De acordo com o número de repetições de 86 bp há seis alelos correspondentes às repetições 1, 2, 3, 4, 5, 6^6-7. Os polimorfismos de nucleotídio único (Single Nucleotide Polymorphisms - SNPs) foram determinados na posição promotora -511 C/T⁸ e no exon 5 na posição +3953 C/T do gene IL1B⁹. Considera-se que estes polimorfismos dos genes IL1RN e IL1B exerçam influência sobre a expressão gênica^8-9.

Há vários relatos demonstrando a relação entre VNTR e SNPs nos genes da família IL1 e as doenças. Foi demonstrado que o genótipo 2/2 da IL1RN é significantemente associado com a doença coronariana em um único vaso (SVD) na população de Sheffield, na Inglaterra¹⁰. Foi observada grande importância entre o alelo 2 do IL1RN e a DAC em pacientes com diabetes tipo 2¹¹. O alelo 2 do IL1RN tem também um efeito protetor sobre a reestenose após angioplastia transluminal percutânea coronariana (PTCA)¹². Porém, nenhuma relação foi demonstrada entre os SNPs da IL1B e a DAC^10,13.

O objetivo deste estudo foi investigar a existência de relação entre polimorfismos nos genes IL1RN (VNTR) e IL1B (-511, +3953) e DAC na Turquia. Nossos resultados demonstraram que nem a distribuição genotípica dos SNP de IL1B (+3953) e nem de IL1B (-511), assim como a freqüência de seus alelos, são suscetíveis à DAC. Porém, os portadores do genótipo IL1RN 2/2 podem ser suscetíveis à SVD na população turca.

Métodos

Sujeitos

A população do estudo foi selecionada entre pacientes que se submeteram à angiografia coronariana no Hospital Dr. Siyami Ersek entre 2003 e 2006. As indicações para arteriografia coronariana em nossa clínica seguem as indicações para angiografia coronariana¹⁴. De acordo com os resultados da angiografia coronariana,^12,15 os participantes que apresentassem estenose > 70 % em pelo menos uma das grandes artérias coronárias eram considerados pacientes com DAC (n= 257); os demais que apresentassem estenose < 30 % seriam aceitos como grupo normal (n= 170). O grupo DAC foi dividido em dois subgrupos: Doença coronariana em vaso único (SVD - n= 91) e Doença coronariana em múltiplos vasos (MVD - n= 166).

Avaliação do fator de risco

Dados sobre idade, sexo, história familiar de DAC, tabagismo, e história de hipertensão foram obtidos pelo preenchimento de um questionário. Peso, altura, pressão arterial sistólica (PAS) e diastólica (PAD) foram medidos. O índice de massa corpórea (IMC) foi calculado pelas medidas de peso e altura. A presença de Diabetes Melito (DM) foi definida por níveis glicêmicos repetidos em jejum > 126 mg/dl, pelo uso de medicação antidiabetes ou ambos. Os níveis de colesterol total (TC), lipoproteínas de alta densidade (HDL) e lipoproteínas de baixa densidade (LDL) foram determinados por métodos enzimáticos, e também medidos por métodos enzimáticos após precipitação com sulfato de dextrano¹⁶. Todos os pacientes–inclusive o grupo controle – foram informados sobre o estudo, e todos assinaram o termo de consentimento livre e esclarecido.

Genotipagem

Amostras de sangue foram colhidas de 427 participantes e mantidas em tubos com EDTA. O isolamento genômico de DNA foi feito usando-se o kit GENTRA DNA. Amplificamos a região VNTR no íntron 2 do gene IL1RN, do IL1B (-511) e do IL1B (nas regiões +3953 do exon 5 conforme descrito anteriormente)¹⁷. Os genótipos do gene IL1RN foram determinados pelo tamanho das unidades de repetição dos produtos da PCR. O genótipo de IL1B (-511) foi determinado com base no tamanho dos produtos de digestão da PCR com Aval, e o genótipo de IL1B (+3953) nos produtos de digestão com Taq I.

Análise estatística

Os testes x² e U de Mann-Whitney foram utilizados para a comparação de dois grupos de sujeitos segundo os fatores de risco para DAC. As freqüências dos alelos e dos genótipos entre casos e controles foram comparadas pelo modelo de Hardy-Weinberg usando a análise x². A análise de regressão logística multivariada foi utilizada para a avaliação da distribuição dos genótipos de IL1RN e IL1B nos grupos controle e de casos. Os resultados foram expressos por OR (odds ratio) e intervalo de confiança (IC) 95%. O modelo final foi ajustado para idade, sexo, história familiar de DAC, tabagismo e história de hipertensão. As freqüências dos alelos e a distribuição dos genótipos entre os casos e os controles foram comparadas e os valores calculados pelo teste x². A probabilidade para valores de p<0,05 (bicaudal) foi considerada estatisticamente significante. O software SPSS 11.5 foi utilizado para a análise estatística.

Aprovação pelo comitê de ética

Esta pesquisa foi aprovada pelo Comitê de Ética da Universidade de Marmara na Turquia, e preserva todos os direitos dos participantes. Todas as aprovações foram emitidas pelo Comitê de Ética.

Resultados

As características de referência para os grupos controle e DAC estão demonstrados na Tabela I. Diferenças significantes entre DAC e controles com relação a sexo (P= <0,001), história familiar de DAC (P= 0,014), Diabetes (P<0,001), história de hipertensão (P= <0,001) e tabagismo (P= <0,001) estão demonstradas na Tabela 1.

A distribuição genotípica e a freqüência dos alelos de VNTR do IL1RN estão demonstrados na Tabela 2. Dos seis genótipos no gene de IL1RN quatro foram observados nos sujeitos com DAC e nos sujeitos controle. Entre estes genótipos, apenas IL1RN 2/2 apresentou diferença significante entre os sujeitos com SVC e os sadios (P= 0,016, x²: 10,289, 3 GL, OR: 2,94IC 95% 1,183-7.229). No entanto, nenhuma diferença estatisticamente significante foi observada entre os dois controles e DAC (P= 0,262) e entre MVD e controles (P= 0,257). A distribuição genotípica entre SVD e MVD também se mostrou estatisticamente significante (P= 0,003, x²: 13,806, 3 GL, OR: 5,22IC 95% 1,995-14,195). Nenhuma relação foi identificada entre controles e casos para as freqüências alélicas de IL1RN: DAC (P= 0,211), MVD (P= 0,247), SVD (P= 0,423); (Tabela 2).

A distribuição genotípica e a freqüência dos alelos de IL1B (-511) nos grupos DAC, SVD, MVD e controle estão demonstradas na Tabela 3. O genótipo de IL1B -511 não demonstrou diferença significante entre os grupos DAC e controle (P= 0,242), SVD e controle (P= 0,712) e MVD e controle (P= 0,142). Da mesma forma, não foram observadas diferenças significantes na distribuição alélica entre os controles e DAC (P= 0,442), SVD (P= 0,098), e MVD (P= 0,142) (Tabela 3).

A distribuição dos genótipos e a freqüência de alelos de IL1B +3953 nos grupos DAC, SVD, MVD e controle estão demonstradas na Tabela 4. Quando o genótipo de IL1B +3953 foi comparado entre os grupos, não se observou diferença significante entre os grupos controle e DAC (P= 0,629), SVD (P= 0,907) e MVD (P= 0,472). Da mesma forma, não foram observadas diferenças significantes na distribuição de alelos entre os controles e DAC (P= 0,569), SVD (P= 0,750), e MVD (P= 0,591) (Tabela 4).

Observou-se que a homozigose para o alelo IL1RN 2 é significante entre SVD e grupos controle (x²: 7,510, P= 0,010, OR: 3,253, IC 95%: 1,349-7,844). Esta associação, no entanto, não é identificada em heterozigotos para o alelo IL1RN 2 (P=0,757). (Tabela 5). Uma associação significante foi ainda encontrada em homozigotos para o alelo IL1RN 2 entre os grupos MVD e SVD (x²: 7,160, P= 0,011, OR: 2,838, IC 95%: 1,278-6,299); (Tabela 5). Além disso, o efeito relativo do polimorfismo da família IL1 sobre o risco de DAC não pôde ser observado em modelo de regressão logística múltipla incluindo os efeitos dominantes, recessivos e co-dominantes (Tabela 6).

Discussão

A DAC é a maior causa de mortalidade e morbidade nos Estados Unidos, nos países europeus, e também na Turquia¹⁸. A etiologia e os processos de desenvolvimento da DAC não são bem conhecidos; porém, já está demonstrado que tanto os processos inflamatórios quando a genética desempenham um papel importante na patogênese da aterosclerose². Muitos estudos epidemiológicos já investigaram a associação entre DAC e os polimorfismos de genes de citocinas inflamatórias¹⁹. Uma das citocinas pró-inflamatórias candidatas associadas à susceptibilidade de DAC é a IL-1β, que afeta a maioria das células e está envolvida em casos de imunidade, sepse, infecção e inflamação. Opostamente, a IL-1Ra age como um agente anti-inflamatório que inibe a ação de IL-1²⁰.

Francis e cols.¹⁰ identificaram a associação entre o genótipo IL-1RN 2/2 e SVD na população caucasiana de Sheffield, no Reino Unido, mas não na população londrina. Nenhuma diferença significante foi observada para MVD em nenhum dos grupos populacionais¹⁰. Outros relatos tampouco encontraram significância estatística entre o alelo IL1RN 2 e SVD ou entre o alelo IL1RN 2 e CAD^21,13. Além disso, foi relatado anteriormente que o alelo IL1RN 2 mantém associação significante com DAC em pacientes com diabete do tipo 2¹¹. O alelo IL1RN 2 tem, ainda, um efeito protetor sobre a reestenose após PTCA¹² e há relatos da associação entre a presença de IL1RN 2 e aterosclerose da carótida²². Foi também relatado que o risco de futuro infarto de miocárdio aumentou com o alelo IL1RN 2 e altos níveis de PCR em pacientes jovens²³. Em nosso estudo, observamos uma associação entre SVD e o genótipo IL1RN 2/2 (P= 0,016, OR: 2,94IC 95% 1,183-7,229); porém, nenhuma associação estatística entre os alelos IL1RN e DAC (P= 0,211) ou MVD (P= 0,247) ou SVD (P=0,423). Além disso, a análise da distribuição genotípica indicou que os homozigotos portadores de IL1RN2 apresentavam diferenças estatisticamente significantes entre os grupos SVD e controle (x²: 7,510, P= 0,010, OR: 3,253, IC 95%: 1,349-7,844). Indivíduos homozigotos para o alelo IL1RN 2 têm probabilidade 3,25 vezes maior para apresentar SVD do que indivíduos portadores dos outros genótipos. No entanto, a heterozigose para IL1RN 2 não demonstrou a mesma associação (P=0,757). Os homozigotos para IL1RN 2 demonstraram diferença significante entre os grupos MVD e SVD (x²: 7,160, P= 0,011, OR: 2,838, IC 95%: 1,278-6,299). Indivíduos com alelo IL1RN 2 em homozigose têm probabilidade 2,83 vezes maior para SVD do que para MVD. No entanto, a heterozigose na expressão de IL1RN 2 não demonstrou a mesma associação (P=0,234; Tabela 5). Além disso, não encontramos nenhuma influência estatisticamente significante nos polimorfismos da família IL1 (efeitos dominantes, recessivos e co-dominantes) sobre o risco para DAC (Tabela 6). Muito embora os polimorfismos da família IL1 não tenham demonstrado efeito direto com relação à DAC, podem modular alguns dos processos para o desenvolvimento da DAC.

Parece haver um equilíbrio entre a IL-1 e a proteína IL-1Ra, exceto no caso de doenças autoimunes²⁴. Os resultados referentes à função do alelo IL1RN 2 na expressão de IL-1Ra são controversos. Já foi relatado que o alelo IL1RN 2 está associado a níveis aumentados de IL-1Ra in vitro,^25-27, a níveis reduzidos na colite ulcerativa, mas a níveis semelhantes para doenças intestinais inflamatórias em pacientes sul-africanos²⁸. Estes resultados implicam que o papel do polimorfismo de IL1RN 2 ao afetar a expressão da proteína IL-1Ra depende do tipo de célula e da origem étnica.

Foi sugerido anteriormente que a IL-1β pode desempenhar um papel importante na patogênese da aterosclerose pelo estímulo das células do músculo liso vascular. Foram também detectados níveis aumentados de mRNA para IL-1β em placas ateroscleróticas²⁹. Os polimorfismos na expressão do gene IL-1B podem afetar a gravidade ou a susceptibilidade a diferentes doenças. Foram demonstrados dois importantes SNPs no gene IL1B: uma substituição C>T na posição –511 da região promotora e uma substituição C>T no exon 5 na posição +3953 ^8,9.

Resultados controversos e diferentes foram relatados para os efeitos do polimorfismo de IL1B (-511) sobre a produção de IL-1Ra e de IL-1β:indivíduos com alelo 2 de IL1B (-511) apresentam níveis mais altos de IL-1Ra²⁶. A produção de IL-1β induzida por LPS apresentou-se aumentada de 2 a 3 vezes por um alelo T na posição -511³⁰. Não se observou relação significante entre os alelos -511 de IL1B e DAC^10,13. No entanto, Iacoviello e cols.³¹ indicaram que o genótipo de IL1B (-511) 1/1 (C/C) demonstrou estar associado ao IM em idade jovem³¹. Na mesma linha, Zhang e cols.³² relataram que o polimorfismo de IL1B (-511) se mostrou associado à severidade da doença coronariana na população chinesa³². No entanto, não detectamos nenhum risco de DAC relacionado ao polimorfismo de IL1B (-511) na população turca. Não foram observadas diferenças significantes nas freqüências dos alelos 1 e 2 ou dos genótipos 1/1 e 2/2 de IL1B (-511) entre os grupos SVD e controle ou MVD e controle ou DAC e controle (Tabela 3).

Outro polimorfismo na expressão do gene de IL1B está localizado na posição +3953 no exon 5. Considera-se que influencie a expressão de IL-1β. Resultados diferentes foram relatados sobre o efeito do alelo de IL1B (+3953) sobre a produção de proteína de IL-1β. Alguns estudos demonstraram associação entre IL1B (+3953) e níveis plasmáticos aumentados de IL-1β^9,30. Outros, porém, não detectaram nenhum efeito sobre os níveis de IL-1^33-35. Não há estudos disponíveis sobre a relação entre a DAC e o polimorfismo do gene de IL1B (+3953). Tampouco se registrou relação entre a freqüência do alelo ou a distribuição do genótipo de IL1B (+3953) e DAC na população britânica¹⁰. A mesma ausência de relação entre DAC e o polimorfismo de IL1B (+3953) foi observada na população turca (Tabela 4).

O presente estudo demonstrou que homozigotos com o alelo 2 do gene IL-1RN podem estar sob fator de risco para SVD. Resultados controversos foram obtidos para a associação entre IL1RN 2 e DAC em estudos e locais diferentes, o que demonstra que a origem étnica e a localização geográfica desempenham um papel importante para que esta associação ocorra.

Agradecimentos

A presente pesquisa teve o apoio do Fundo de Pesquisa da Universidade Marmara e subvenção parcial do Hospital Americano na Turquia. Nossos agradecimentos ao Professor Philip E. Auron, do Departamento de Ciências Biológicas da Universidade Duquesne, pela revisão crítica do texto.

Potencial Conflito de Interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

Fontes de Financiamento

O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.

Vinculação Acadêmica

Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.

Artigo recebido em 28/08/07; revisado recebido em 24/01/08; aceito em 14/02/08

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  05 Jan 2009
• Data do Fascículo
  Nov 2008

Histórico

• Aceito
  14 Fev 2008
• Revisado
  24 Jan 2008
• Recebido
  28 Ago 2007