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Arquivos Brasileiros de Cardiologia

versão impressa ISSN 0066-782X

Arq. Bras. Cardiol. vol.95 no.2 São Paulo ago. 2010

http://dx.doi.org/10.1590/S0066-782X2010001200020 

ARTIGO DE REVISÃO

 

Aterosclerose experimental em coelhos

 

 

Waleska C. DornasI; Tânia T. de OliveiraII; Luis E. Franklin AugustoII; Tanus J. NagemI

IUniversidade Federal de Ouro Preto
IIDepartamento de Bioquímica e Biologia Celular
IIIUniversidade Federal de Viçosa, Belo Horizonte, MG -Brasil

Correspondência

 

 


RESUMO

Numerosas pesquisas têm sido realizadas utilizando modelos experimentais para estudar o desenvolvimento da aterosclerose com dieta induzindo hiperlipidemia. Devido ao fato de que coelhos são muito sensíveis a dietas ricas em colesterol e acumulam grandes quantidades no plasma, a utilização destes animais como modelo experimental para avaliar o desenvolvimento de aterosclerose é de grande relevância, trazendo informação sobre fatores que contribuem para progressão e regressão aplicadas a situações humanas. Sendo assim, nessa revisão a função aterogênica do colesterol é mostrada em trabalhos que incluem o coelho como modelo experimental, uma vez que este animal tornou-se o mais popular modelo experimental de aterosclerose.

Palavras-chave: Aterosclerose, colesterol, hipercolesterolemia, coelhos.


 

 

Introdução

A importância de distúrbios de lipoproteínas plasmáticas e anormalidades no metabolismo lipídico caracterizadas por hiperlipidemia e/ou hipercolesterolemia como fator etiológico no desenvolvimento de doenças cardíacas coronarianas e aterosclerose potencial são, atualmente, cada vez mais apoiadas por considerável número de estudos populacionais e epidemiológicos1. Dieta induzindo hipercolesterolemia em coelhos tem sido largamente utilizada como modelo para estudar o desenvolvimento de aterosclerose humana.

A primeira investigação sobre indução experimental de aterosclerose ocorreu em 1908. Ignatowski, utilizando coelhos alimentados com leite, carne e ovo, observou espessamento da íntima em aortas. Em seguida, Lubarsch (1910, 1912) e Steimbiss (1913) foram capazes de desenvolver aterosclerose em aorta de coelhos com dietas que incluíam órgãos internos, como fígado, adrenal e músculo. Tais estudos, bem como outros, indicavam uma função causal de proteínas animais; entretanto, outros pesquisadores acreditavam que o fator que estabelecia aterosclerose como componente da dieta era o colesterol e não as proteínas de tecido animal2.

Para avaliar a teoria da aterogênese a partir do colesterol, Clarkson e Newburgh (1926) alimentaram coelhos com dieta normal, aumentando para 25, 113, 253 ou 507 mg/dia de colesterol administrado em cápsula. Encontrou-se moderada aterosclerose em 71% dos coelhos alimentados com 507 mg/ dia de colesterol por 47-87 dias. Meeker & Kesten (1940,1941) dissolveram 60 ou 250 mg de colesterol em óleo vegetal e acrescentaram à dieta de coelhos por três meses. Os animais desenvolveram típicas lesões ateroscleróticas similares àquelas vistas em humanos, permanecendo, deste modo, a teoria de que o colesterol é o precursor para o desenvolvimento de doença vascular aterosclerótica3.

Para induzir hipercolesterolemia em animais, têm-se utilizado dietas contendo colesterol, as quais variam de rações comerciais suplementadas com níveis substancialmente diferentes de colesterol, assim como modificações nas porções de lipídio e carboidrato e nas diferentes fontes e conteúdos de gordura, contendo ou não ácido cólico4. Em nosso laboratório, temos produzido hipercolesterolemia em coelhos, com 1% de colesterol em rações comerciais em várias pesquisas, para investigarmos substâncias que podem ser viabilizadas, no futuro, como medicamentos no controle do metabolismo lipídico e no desenvolvimento de testes de potenciais terapias e diagnósticos entre diferentes procedimentos experimentais5-12.

Na presente revisão, o objetivo foi analisar criticamente o efeito hipercolesterolêmico de dieta rica em colesterol em estudos utilizando coelhos como modelo experimental a partir de investigações que possam levar a um melhor entendimento da biologia da aterosclerose para doença cardiovascular.

 

Aterosclerose experimental

Para melhor entendimento da relação entre desordens do metabolismo de colesterol e aterogênesis, manipulação dietética e a utilização de animais naturalmente com erros metabólicos, como coelhos Watanabe Heritable Hyperlipidemic (WHHL) e St Thomas Hospital (STH) para produzir hipercolesterolemia familiar e hiperlipidemia combinada à hipercolesterolemia, respectivamente, tem sido o foco de muitos experimentos. Atualmente, a tecnologia de deleção de gens tem permitido pesquisas a fim de produzir uma variedade de modelos de animais transgênicos com desordens de lipoproteínas e, a despeito dessa revolucionária descoberta, muitos desses animais geneticamente modificados têm sido alimentados com colesterol para acelerar aterogênesis2.

 

Exposição ao colesterol plasmático e disfunção endotelial

O termo "disfunção endotelial", que tem importante implicação no cuidado da doença cardiovascular, é empregado para descrever situações em que o endotélio perde sua propriedade vasoprotetora, representando a etapa inicial de vários processos de lesão vascular, como dano mecânico, hipercolesterolemia, aterosclerose e hipertensão arterial sistêmica13. Além disso, ocorre diminuição do relaxamento endotelial vascular para acetilcolina, causando vasoconstrição e queda do fluxo sanguíneo, como demonstrado por Sun e cols.14 em coelhos alimentados com colesterol, visto que essa menor vasodilatação pode ser ocasionada pela presença de placas de lipídios na aorta.

Coelhos com 1% de suplementação de colesterol na dieta por 8-10 semanas apresentam prejudicada vasodilatação do endotélio na artéria carótida15 e anormalidades na síntese do óxido nítrico (NO), demonstradas em vasos ateroscleróticos16. Considerando hiperlipidemia e aterosclerose, segmentos aórticos de coelhos hipercolesterolêmicos mostram redução significante de óxido nítrico sintase (NOS) endotelial em relação aos animais-controle17. Vasquez-Vivar e cols.18 relataram que BH4, um cofator para síntese de NO em aortas de coelhos com dieta induzindo hipercolesterolemia, foi acentuadamente reduzido quando comparado a coelhos normocolesterolêmicos. Radicais livres de oxigênio, como o ânion superóxido, podem modular a atividade de NO endógeno em coelhos hipercolesterolêmicos19,20. Interessantemente, isso demonstra que a expressão de NOS relatada em músculo liso vascular de coelhos hipercolesterolêmicos21,22 não é capaz de dominar os defeitos na função vascular endógena.

O aumento de óxido nítrico basal e de vasodilatadores derivados do endotélio é visto em maior quantidade em anéis aórticos do endotélio de coelhos do sexo feminino do que em machos e depende da concentração de estradiol circulante23; portanto, fêmeas são menos inclinadas à dieta para indução de lesões ateroscleróticas do que machos, mas dependem do estado do endotélio arterial, como observado por Holm e cols.24. Estradiol inibe a adesão de monócitos sobre células endoteliais com migração transendotelial, componentes de uma resposta inflamatória que ocorre continuamente através do processo aterogênico após hipercolesterolemia induzida em coelhos25.

O desenvolvimento de intervenções para inibir aterosclerose a partir de colesterol e a disfunção vascular têm recebido muita atenção devido a essa intensa associação. A depleção de L-arginina (um substrato para NOS) em modelos animais de aterosclerose e hipercolesterolemia induz agregação plaquetária, proliferação celular e acumulação de monócito vascular, ao passo que coelhos hipercolesterolêmicos tratados com L-arginina melhoram a vasorreatividade do endotélio-dependente, atenuando os mecanismos de lesão vascular26 e inibindo a neoproliferação intimal27, que podem ser avaliados por vários marcadores propostos de células endoteliais (Tabela 1).

O fator de Von Willebrand foi estudado recentemente em coelhos com dieta rica em colesterol por 30 dias. Após a interrupção do tratamento, observou-se que a hipercolesterolemia induz o aumento deste fator, diminuindo após descontinuação da dieta rica em colesterol. Isso demonstra uma correlação positiva com formação de camada de gordura em ambas as fases do estudo, enquanto há um decréscimo dos níveis de fator de crescimento endotelial vascular, após cessar a dieta hipercolesterolêmica, podendo ser um mecanismo reparativo na prévia aterosclerose, o que pode também indicar dano celular endotelial28.

Avaliando os efeitos da hipercolesterolemia para identificar o risco de aterosclerose com proteína C-reativa (PCR), Sun e cols.29 mostraram que PCR é frequentemente depositada em lesões aterosclerótica em modelos com coelhos. Além disso, elevados níveis plasmáticos de PCR associam-se com a gravidade da hipercolesterolemia30.

O aumento na síntese de NO pode ser um mecanismo de defesa para compensar a inativação de NO e proteger contra fatores que representam dano ao organismo, com o nitrito como um potente metabólito correlacionado à formação de camadas de gordura, sendo examinado em curto e longo tempo em coelhos alimentados com colesterol31.

Paralelamente a essas aferições, constata-se que a função endotelial de segmentos vasculares é a alteração mais precoce na aterogênese. O comprometimento funcional da célula endotelial é demonstrado nas repercussões clínicas, como ocorrência de eventos subsequentes à progressão da formação de placa na íntima dos vasos (Figura 1).

 

Formação de placas ateroscleróticas

O modelo de coelho alimentado com colesterol é notável pelo rápido desenvolvimento de lesões aórticas e baixo custo para manutenção, sendo um regime típico para indução de aterosclerose envolvendo suplementação de 0,5% a 4% de colesterol por peso em aproximadamente 8 a 16 semanas. Nessas condições, coelhos tornam-se rapidamente hipercolesterolêmicos (com colesterol plasmático > 1.000 mg/dl) e as lesões resultantes consistem primariamente de macrófagos derivados de células espumosas32. Contudo, a relação entre formação da lesão aterosclerótica e dieta induzindo hipercolesterolemia em coelhos é dependente de exposição cumulativa preferencialmente em nível de colesterol administrado, demonstrando em coelhos alimentados com 0,5% e 1,0% de colesterol graus similares de hipercolesterolemia induzida14. Alguns pesquisadores apoiam a sugestão de que a formação de lesões avançadas depende da idade do animal. Coelhos mais velhos, com 3-4,5 anos de idade, exibem placas fibróticas enquanto animais mais jovens (4 meses de idade) não apresentam lesões avançadas33.

Como coelhos têm sido utilizados vastamente para estudar o desenvolvimento de aterosclerose em humanos, o rápido desenvolvimento de lesões tem sido produzido com suplementação de colesterol na dieta (< 0,5%), alcançando hipercolesterolemia moderada com níveis de colesterol plasmáticos na faixa de 200 a 800 mg/dl34. Consequentemente, as lesões usualmente produzidas são topográfica e morfologicamente dissimilares àquelas vistas em humanos. Essa dissimilaridade é devida, em parte, ao fato de que humanos comumente não ingerem grandes quantidades de colesterol: em geral, têm níveis de colesterol plasmático que não excedem 800 mg/dl e processam e toleram o consumo de colesterol melhor do que coelhos. Somados a isso, experimentos de longo tempo em coelhos com dietas contendo grandes quantidades de colesterol são desencorajados devido à hepatotoxicidade e à falência do animal. Examinações revelam hepatomegalia com evidência de estase biliar em nível de colesterol plasmático de 3.257 ± 266 mg/dl32. Contudo, a despeito dessas restrições, grande número de pesquisas usa esse modelo para testar a eficiência de fármacos no desenvolvimento de camadas de gordura.

Lesões ateroscleróticas são compostas por três componentes maiores. O primeiro é o componente celular, que predominantemente compreende células musculares lisas e macrófagos. O segundo componente é o tecido conectivo matriz e lipídio extracelular. O terceiro componente é o lipídio intracelular, que se acumula dentro de macrófagos, convertendo-se, então, em células espumosas35. Em prévios eventos celulares, tem sido observada a presença de leucócitos aderidos ao arco aórtico torácico e abdominal de coelhos após três semanas de dieta enriquecida com 0,2% de colesterol. Por 3-5 semanas com a mesma dieta, numerosas células espumosas são encontradas no espaço subendotelial e constituem o desenvolvimento de camadas de gordura na mesma localização em que monócitos aderentes foram observados anteriormente36.

Em aorta, vários tipos de placas de camadas de gordura a lesões ateromatosas são observados em modelo experimental, dependendo do grau de consumo de colesterol. Dietas contendo < 0,15% de colesterol resultam em desenvolvimento de lesões de camada de gordura, enquanto placas ateromatosas são mais encontradas com alta quantidade de colesterol na dieta32.

O grau de aterosclerose em coelhos tende a ser maior na aorta abdominal do que na torácica, o que pode ser explicado devido ao efeito hemodinâmico ou pelo fato de que a aorta abdominal de coelhos diminui gradualmente abaixo na bifurcação aórtica. Dessa forma, a aorta mais distal pode ter mais lesão em relação à aorta proximal37. Mudanças ateromatosas com 8 semanas em coelhos alimentados com colesterol são formadas na aorta torácica e, então, estendem para a aorta abdominal, artéria coronária e outros vasos, predominando lesões concêntricas na aorta torácica e na porção proximal da artéria coronária em contraste com aterosclerose branda produzida nas artérias renal, carótida e femural na 15ª semana da dieta38. Não fica claro, todavia, neste estudo, o quanto a exposição com colesterol influenciou o tipo de lesão.

A extensão da aterosclerose em aorta de coelhos pode ser quantificada pela superfície de lesões sudanofílicas39 e por análise imuno-histoquímica40. Recentemente, ressonância magnética de imagem (RMI) não invasiva tem sido usada no estudo de lesões vasculares. Quantificação em RMI e mudanças na composição de placas ateroscleróticas podem ser usadas com RMI para monitorar a progressão e regressão da aterosclerose in vivo. O método é vantajoso devido ao fato de que estudos em série podem ser realizados em resposta para terapias intervencionais41.

Já a avaliação histológica pela taxa de estenose é um importante método para avaliar a gravidade da aterosclerose coronariana, pois a taxa de estenose é diretamente considerada reflexo da condição clínica. Por outro lado, o método de avaliação através da observação macroscópica em coronárias ateroscleróticas em coelhos tem algumas vantagens em relação a métodos histológicos, uma vez que a análise da área da lesão pode ser concluída dentro de um curto tempo, enquanto toda a imagem da distribuição da aterosclerose pode ser facilmente entendida. Quando seções de tecidos de lesões ateroscleróticas coronarianas são necessárias, pode-se retirar somente a parte da placa aterosclerótica, observada macroscopicamente sobre a superfície luminal da artéria coronária42.

A lesão vascular tem participação importante nas desordens cardiovasculares, embora a participação da hipercolesterolemia em eventos tromboembólicos seja ainda pouco entendida, necessitando ser melhor conhecida.

 

Ruptura de placa e trombose

A ruptura da placa aterosclerótica é reconhecida como a maior causa de trombose e subsequentes manifestações clínicas de aterosclerose como angina instável, infarto miocardial e derrame além de, também, consistir um alvo para intervenção clínica43-45. Entretanto, é ainda difícil predizer quando a ruptura de placa ocorrerá já que o estímulo fisiológico adicional requerido para causar o evento é desconhecido. Os mecanismos de ruptura de placa posterior e formação de subsequentes trombos oclusivos não são ainda muito claros. Ademais, também não é evidente se a placa sem acompanhamento de trombo pode causar ou não eventos cardíacos44. Duas hipóteses principais têm sido propostas como causas para ruptura de placa (Tabela 2).

 

 

Há vários modelos animais de ruptura de placa que têm sido relatados nos últimos anos. Comumente em coelhos alimentados com colesterol, usa-se induzir a lesão a partir de um balão injetado parenteralmente com veneno de víbora Russell e histamina, procedimento este que resultará em ruptura de placa e trombose37. Outro modelo é o de coelhos alimentados com colesterol, com implantação de cateter com balão em aorta torácica. O balão é inflado após a lesão aterosclerótica formar-se ao redor deste, ocasionando ruptura de lesão e trombose46. Entretanto, ambos os modelos conduzem para casos agudos provocados mecanicamente em pesquisas. Assim, o valor desses modelos para estudo sobre apoptose celular, inflamação, aumento de lipídios e degradação de cápsula fibrosa é limitado devido a acentuadas e diferentes características das placas formadas nesses modelos comparados às placas encontradas naturalmente em humanos, uma vez que a lesão está restrita à região subendotelial, mantendo a integridade da lâmina elástica interna47.

A placa aterosclerótica não é uma estrutura estática. Preferencialmente, seu status em qualquer momento é o resultado de uma interação complexa e dinâmica de um grande número de fatores celulares e humorais48. A desestabilização de placa determinada pela quebra de colágeno, com perda local de fonte celular de síntese de colágeno, foi vista em coelhos por Rekhter e cols.49. Eles demonstraram um decréscimo do conteúdo de colágeno total em placas ricas em lipídios tempo dependente, enquanto o nível de ligação cruzada não diferiu entre alto e baixo consumo de colesterol nos grupos. Uma ligação mecânica entre hipercolesterolemia e perda de colágeno é ainda hipotética, embora uma função crítica de macrófagos e outras enzimas proteolíticas têm sido fortemente sugeridas.

Dieta induzindo hipercolesterolemia em coelhos aumenta seletivamente a formação de trombo e embolização em arteríolas, mas não em veias. A observação de que o aumento de colesterol plasmático total resulta principalmente em aumento de colesterol LDL sugere que os efeitos observados da hipercolesterolemia sobre tromboembolismo arteriolar sejam causados pelo LDL e que a estimulação de produção de NO endógeno como estimulado por excesso de L-arginina seja capaz de antagonizar esse acréscimo do colesterol, acentuando tromboembolismo arteriolar50.

Se um trombo é oclusivo, ele conduzirá para infarto do miocárdio45. Como ruptura de placa é a principal complicação clínica, a estabilização da placa é crucial e a diminuição de lipídios pela manipulação dietética mostrou reduzir significativamente a atividade proteolítica e o aumento do conteúdo de colágeno de ateroma estabelecido em coelhos51. O grau substancial de benefício clínico parece ser não proporcional à melhora da estenose produzida por redução do consumo de lipídio, estabilizando a placa ateromatosa pela redução nos níveis de atividade de proteinases, que podem degradar componentes estruturais da matriz extracelular arterial51. Dessa forma, reforça-se a habilidade da placa em resistir à ruptura.

A administração de fatores de crescimento angiogênicos é uma interessante nova terapêutica para doença cardíaca isquêmica. O fator de crescimento de fibroblastos promove reparo vascular e angiogênese, induzindo expressão de fator tecidual em monócitos circulantes e na parede vascular em coelhos normais e hipercolesterolêmicos52.

Segundo Abela e cols.53, o modelo de coelhos com lesões arteriais que desenvolvem trombose após dano arterial mecânico e dieta rica em colesterol ocasiona placa vulnerável para ruptura e trombose, sendo capaz de ser usado para testar agentes farmacológicos que possam reduzir o desenvolvimento de placas ateroscleróticas vulneráveis ou quantidade de trombos formados. Agentes redutores de lipídios, antioxidantes, bloqueadores de canal de cálcio e inibidores da enzima conversora de angiotensina, além de fármacos antiplaquetários e antitrombóticos, podem ser testados para avaliar a habilidade de reduzir a quantidade de trombos. No entanto, a ruptura espontânea da placa não ocorre nesses modelos, embora o estímulo desencadeador possa provocar trombose arterial. Lesões pr oduzidas nesses animais por lesão mais lipídio formam cápsulas fibrosas constituídas por células musculares lisas. O ateroma humano, tipicamente formado por décadas, pode ter aspectos não parecidos ao obtido em tempo relativamente curto em experimentos com coelho 51.

 

Regulação metabólica em coelhos hipercolesterolêmicos

O coelho é uma espécie animal que tem vários aspectos similares aos dos humanos em relação ao metabolismo de lipoproteínas, exceto pela deficiência de lipase hepática54. Várias características dos coelhos fazem deles um excelente modelo para avaliar os efeitos dos transgenes humanos sobre metabolismo de lipoproteínas e susceptibilidade para aterosclerose: 1) lipoproteínas contendo apoB são similares àquelas vistas em humanos55; 2) fígado de coelhos produzem VLDL contendo apoB-100, como em humanos56; 3) abundância de proteína de transferência de ésteres no plasma de coelhos57.

Pelo menos 4 mecanismos são responsáveis pela homeostase do colesterol e afetam as concentrações de colesterol plasmático (Tabela 3).

 

 

Em coelhos, a atividade da 7α-hidroxilase e níveis de mRNA são inibidos após dieta hipercolesterolêmica com níveis de colesterol plasmático substancialmente elevados58. Entretanto, Overturf e cols.59 descobriram que, alimentando coelhos com 0,1% de suplementação de colesterol por 7 meses, não produziram hipercolesterolemia, ao passo que aumentando gradualmente o consumo de colesterol dietético, aumentou-se o tamanho do pool de ácidos biliares inversamente à atividade da 7α-hidroxilase60.

A excreção de ácidos biliares aumenta a taxa do clearance, o qual diminui a concentração efetiva do colesterol intracelular, inibindo que o colesterol exerça influência sobre a expressão do receptor de LDL, já que os ácidos biliares são predominantemente reabsorvidos pela circulação ênterohepática e retornam ao fígado para exercer controle de retroalimentação negativa sobre a enzima 7α-hidroxilase e para regular o metabolismo do colesterol61.

Ácidos biliares são conhecidos por serem reabsorvidos no intestino por mecanismos passivos e ativos. Passivamente, o consumo ocorre via não iônica, iônica e difusão de micelas conjugadas ou não conjugadas a ácidos biliares e, ativamente, a absorção saturável ocorre via Na+ dependente de ácidos biliares conjugados contra o gradiente de concentração. Várias espécies, incluindo coelhos, demostram possuir ambos os processos de reabsorção de ácidos biliares62.E, no entanto, devido à natureza hidrofílica relativa de ácidos biliares conjugadosa porém, sofrem uma reabsorção intestinal passiva mínima devido à natureza hidrofílica relativa de ácidos biliares conjugados. O sítio primário de reabsorção de ácido biliar predominantemente é mediado por co-transportador ácido biliar Na+/bile ileal (ABST) e, a interrupção da circulação êntero-hepática dos ácidos biliares pela atenuação da reabsorção de ácidos biliares intestinais é considerada uma das melhores vias de redução dos níveis de colesterol plasmático62. Higaki e cols.63 demonstraram com inibidor de ABST redução das quantidades de retorno de ácido biliar para o fígado e aumento da conversão de colesterol para ácido biliar em coelhos alimentados com colesterol.

O efeito inibitório do colesterol dietético sobre 7α-hidroxilase em coelhos pode ajudar a explicar porque alguns indivíduos são mais sensíveis ao colesterol na dieta e aumentam as concentrações plasmáticas. Esses indivíduos podem responder a dieta hipercolesterolêmica com diminuída síntese de ácido biliar contribuindo para elevar os níveis de colesterol plasmáticos e reduzir os receptores de LDL. Alternativamente, outras pessoas respondem para dieta rica em colesterol com a síntese de ácido biliar sendo estimulada e, assim, os níveis de colesterol plasmáticos não aumentam. Identificando esses indivíduos, pode-se ajudar a esclarecer seu risco aterogênico e, assim, usar recomendações dietéticas mais sensíveis para o tratamento58.

 

Considerações finais

Considerando que a prevalência de aterosclerose e doença cardíaca isquêmica está aumentando no mundo, ocasionando sérias consequências clínicas que exigem esforços para melhorar o conhecimento de sua patogênese, entende-se que é necessário buscar melhorias nas técnicas experimentais e nos novos tratamentos para essas condições, com avanços no uso de modelos experimentais.

Nesse sentido, o coelho como modelo experimental é uma importante ferramenta para o estudo da aterosclerose entre os animais que têm sido utilizados nas investigações científicas. Representa, dentre os animais estudados, o único que tem tendência para exibir hipercolesterolemia pela acumulação de colesterol exógeno com poucos dias de altas concentrações na dieta, já que não pode aumentar a excreção de esteróis. No entanto, cuidadosas extrapolações devem ser realizadas em relação ao grau de hipercolesterolemia produzido em animais de laboratório, uma vez que excedem o que usualmente encontramos em humanos. Limitações e avanços devem ser discutidos para que possam contribuir e elucidar os conhecimentos sobre etiologia, fisiopatologia e tratamento da aterosclerose com a caracterização dessas descobertas.

 

Agradecimentos

Os autores agradecem à Fundação de Amparo à Pesquisa de Minas Gerais (FAPEMIG) pelo apoio financeiro e bolsa de pesquisa e à Rede Mineira de Toxicologia e Farmacologia -TOXIFAR da Fapemig.

Potencial Conflito de Interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

Fontes de Financiamento

O presente estudo foi financiado pela FAPEMIG.

Vinculação Acadêmica

Este artigo é parte de dissertação de Mestrado de Waleska Cláudia Dornas pela Universidade Federal de Ouro Preto.

 

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Correspondência:
Tanus Jorge Nagem
Rua Tulipa, 357 - Esplanada
30280-200 - Belo Horizonte, MG - Brasil
E-mail: tanus@ufop.br

Artigo recebido em 27/11/08; revisado recebido em 29/06/09; aceito em 24/08/09.