SciELO - Scientific Electronic Library Online

 
vol.96 issue4Percutaneous coronary intervention in Brazil: results from the Brazilian Public Health SystemThe role of titin in the modulation of cardiac function and its pathophysiological implications author indexsubject indexarticles search
Home Pagealphabetic serial listing  

Services on Demand

Article

Indicators

Related links

  • Have no similar articlesSimilars in SciELO

Share


Arquivos Brasileiros de Cardiologia

Print version ISSN 0066-782X

Arq. Bras. Cardiol. vol.96 no.4 São Paulo Apr. 2011 Epub Mar 04, 2011

http://dx.doi.org/10.1590/S0066-782X2011005000028 

Transplante de células da medula óssea na insuficiência cardíaca chagásica: relato da primeira experiência humana

 

 

Fábio Vilas-BoasI; Gilson Soares FeitosaI; Milena B. P. SoaresII; Joel Alves Pinho-FilhoI; Augusto C. A. MotaI; Augusto José Gonçalves AlmeidaI; Marcus Vinícius AndradeI; Heitor Ghissoni CarvalhoI; Adriano Dourado OliveiraI; Ricardo Ribeiro-dos-SantosII

IHospital Santa Izabel da Santa Casa de Misericórdia da Bahia, Salvador, BA - Brasil
IICentro de Pesquisas Gonçalo Moniz - FIOCRUZ/BA, Salvador, BA - Brasil

Correspondência

 

 


RESUMO

FUNDAMENTO: Insuficiência cardíaca (IC) causada por Doença de Chagas (DC) é uma cardiomiopatia inflamatória progressiva que afeta milhões de pessoas na América Latina. Estudos com modelos de camundongo de IC devido à DC indicam que o transplante de células mononucleares derivadas da medula óssea (TCDMO) pode reduzir a inflamação, fibrose e melhorar a função miocárdica.
OBJETIVO: O propósito desse estudo foi avaliar, pela primeira vez em seres humanos, a segurança e a eficácia de TCDMO no miocárdio de pacientes com IC devido à DC.
MÉTODOS: Um total de 28 pacientes com IC devido à DC (média de idade de 52,2 ± 9,9 anos) com classe funcional NYHA III e IV foram submetidos à TCDMO através de injeção coronariana. Os efeitos na fração de ejeção do ventrículo esquerdo (FEVE), capacidade funcional, qualidade de vida, arritmias e parâmetros bioquímicos, imunológicos e neuro-humorais foram avaliados.
RESULTADOS: Não houve complicações diretamente relacionadas ao procedimento. A FEVE foi 20,1 ± 6,8% e 28,3 ± 7,9%, p < 0,03 a nível basal e 180 dias após o procedimento, respectivamente. No mesmo período, melhoras significantes foram observadas na classe funcional NYHA (3,1 ± 0,3 para 1,8 ± 0,5; p < 0,001), qualidade de vida (50,9 ± 11,7 para 25,1 ± 15,9; p < 0,001), e no teste de caminhada de seis minutos (355 ± 136 m para 437 ± 94 m; p < 0,01). Não houve alterações nos marcadores de ativação imune ou neurohormonais. Nenhuma complicação foi registrada.
CONCLUSÃO: Nossos dados sugerem que a injeção intracoronariana de células derivadas da medula óssea é segura e potencialmente efetiva em pacientes com IC devido à DC. A extensão do benefício, entretanto, parece ser discreta e precisa ser confirmada em estudos clínicos maiores, randomizados, duplo-cegos, controlados com placebo.

Palavras-chave: Células tronco, insuficiência cardíaca, doença de Chagas, terapia tecidual, cardiomiopatia dilatada.


 

 

Introdução

A Doença de Chagas (DC) é causada por uma infecção pelo protozoário Trypanosoma cruzi, e ainda afeta milhões de pessoas na América Latina1,2. Devido à intensa imigração a partir de áreas endêmicas, a infecção associada à transfusão tem sido recentemente identificada como uma ameaça potencial nos Estados Unidos da América1. Dentre as suas muitas manifestações, o envolvimento cardíaco é bastante relevante, sendo frequente e habitualmente incapacitante1. Tem sido estimado que um quarto dos pacientes infectados eventualmente desenvolva a forma avançada da doença cardíaca, a qual apresenta características da cardiomiopatia dilatada grave, com arritmias potencialmente fatais frequentes e fenômenos embólicos pulmonares e sistêmicos1. As características macroscópicas dessa condição incluem câmaras dilatadas, afetando as quatro câmaras, áreas localizadas de aneurismas, especialmente na região apical. As características microscópicas dessa condição incluem focos disseminados de inflamação e fibrose1.

O achado real do parasita nessa forma tardia da doença é pouco frequente, embora o uso de técnicas altamente sensíveis permita o reconhecimento de partes do parasita no miocárdio1. Esse achado e outros sugerem que o processo auto-imune tem um papel principal na fase crônica da doença1,2. No estágio avançado da doença, o prognóstico é ruim e uma progressão inexorável para a condição refratária é frequentemente observada, a despeito de todos os recursos terapêuticos disponíveis atualmente1,2.

Com o recente progresso na técnica de transplante de células derivadas de medula óssea (TCDMO) direcionado à doença cardíaca isquêmica1-3, nossa atenção foi direcionada à possibilidade de empregar-se a mesma técnica na doença cardíaca chagásica. Experimentalmente, tem sido demonstrado que em camundongos cronicamente infectados com a cepa colombiana de T. cruzi, a injeção de células autólogas mononucleares de medula óssea resultou em uma redução significante das células inflamatórias e da fibrose intersticial no miocárdio1. Um estudo de referência, o transplante autólogo simultâneo de células-tronco co-cultivadas e mioblastos esqueléticos em um modelo experimental de cardiomiopatia dilatada causada por DC, mostrou ser funcionalmente efetivo1.

O Fator de estimulação de colônia por granulócito (G-CSF) induz a mobilização das células-tronco da medula óssea para o sangue periférico, tornando um grande número de células-tronco disponíveis para reparação de danos1. Assim, a experiência anterior com TCDMO na doença cardíaca isquêmica, bem como os resultados experimentais com ao modelo da DC definiu o cenário para nosso estudo-piloto de fase 1, sobre o uso de TCDMO em seres humanos com doença cardíaca chagásica avançada1,2.

 

Métodos

De Junho de 2003 a Junho de 2006, conduzimos um estudo clínico de fase aberta, fase 1, para testar a viabilidade, segurança e eficácia potencial do transplante de células derivadas da medula óssea para o miocárdio de pacientes com insuficiência cardíaca (IC) causada por cardiomiopatia chagásica. Os indivíduos incluídos no estudo eram de ambos os sexos, com idade variando de 20 a 70 anos e ICC causada por DC, com fração de ejeção do ventrículo esquerdo (FEVE) < 40% no ecocardiograma, classe funcional III e IV (NYHA), recebiam terapia médica otimizada para ICC e haviam permanecido estáveis nessa condição por pelo menos um mês antes do início dos procedimentos de investigação.

Os pacientes excluídos apresentavam condições sistêmicas que poderiam ter um impacto nos resultados do tratamento ou nas análises dos procedimentos de investigação. Essas condições incluíam infecções ou neoplasias, doenças auto-imunes, doenças hematológicas anteriores; doenças hepáticas; insuficiência renal moderada (creatinina > 2 mg/dl); implantação de marcapasso biventricular para ressincronização cardíaca nos 90 dias anteriores ao início do estudo; mulheres em idade fértil e pacientes com doença arterial coronariana detectada por cineangiocoronariografia.

Uma avaliação clínica foi realizada a nível basal e os seguintes dados clínicos e variáveis foram registrados: a) classe funcional (CF) da NYHA; b) escore de qualidade de vida medido pelo questionário "Minnesota Living with Heart Failure'1; c) variáveis hematológicas e bioquímicas; d) eletrocardiograma (ECG) de 12 derivações; e) ecocardiograma transtorácico; f) teste de caminhada de 6 minutos (TC6M)2; g) monitorização por Holter de 24 horas. Após o procedimento, os pacientes foram encaminhados à Unidade de Terapia Intensiva (UTI), onde foram monitorados por pelo menos 24 horas. Em casos sem intercorrências, os pacientes eram transferidos para o quarto, onde permaneciam por pelo menos cinco dias. Todas as avaliações foram repetidas após 180 dias.

Para verificar qualquer possibilidade de dano miocárdico causado pela injeção de células de medula óssea, mensurações seriadas (a cada seis horas durante as primeiras 24 horas) de marcadores de dano miocárdico (CK-MB e troponina I), bem como eletrocardiogramas, foram realizados. Para investigar o desenvolvimento de arritmias cardíacas como complicação da injeção de células, os pacientes foram submetidos à eletrocardiografia ambulatorial (Holter) de 24 horas antes do procedimento e periodicamente após o mesmo.

O protocolo do estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética da instituição e pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa. Os pacientes foram incluídos no estudo apenas após terem sido totalmente informados sobre os procedimentos do mesmo e após assinar o Termo de Consentimento Livre e Informado.

Transplante de células mononucleares de medula óssea

Os pacientes foram encaminhados ao laboratório de cateterismo após jejum de 12 horas. Uma amostra de 50 ml de conteúdo de medula óssea foi aspirada de cada paciente através de 5 punções nas cristas ilíacas posteriores direita e esquerda, sob anestesia local e sedação intravenosa. O aspirado colhido foi filtrado para remoção de debris da medula óssea, como gordura e fragmentos ósseos (malha de aço inoxidável, Washington University) e submetido a centrifugação por gradiente de densidade com Ficoll Histopaque (Amersham Pharmacia, produto licenciado para uso clínico em humanos). A fração mononucleada celular isolada foi então diluída em solução fisiológica estéril e novamente centrifugada. Uma amostra foi utilizada para contagem celular e teste de viabilidade.

Ao final do processo, as amostras foram diluídas em 20 ml de solução fisiológica. Imediatamente antes da injeção intracoronariana, os pacientes foram submetidos à cateterização cardíaca esquerda com abordagem femoral, seguida por angiografia coronariana. Os pacientes foram excluídos se houvesse estenose > 50% em qualquer artéria coronária. A solução contendo as células foi injetada lentamente, durante 10 minutos, no sistema coronariano esquerdo e direito: 10 ml na artéria descendente anterior esquerda, 5 ml na artéria coronária direita e 5 ml na artéria circunflexa esquerda.

Vinte e cinco dias depois, os pacientes receberam injeções diárias subcutâneas de G-CSF (Granulokine®) humano por cinco dias, a uma dose de 5 µg/kg/dia.

O teste de caminhada de 6 minutos (TC6M) foi realizado de acordo com o protocolo utilizado por Bittner e cols.4 no estudo SOLVD. Após um período de repouso de 15 minutos, um novo teste foi realizado e a média das distâncias caminhadas nos dois testes foi usada como resultado. A qualidade de vida (QV) foi avaliada através do questionário de Minnesota (Minnesota Living with Heart Failure Questionnaire). Todas as entrevistas foram realizadas pela mesma enfermeira pesquisadora. Os estudos ecocardiográficos foram conduzidos pelo mesmo observador, cego para exames anteriores e para o status do paciente no protocolo. A FEVE foi calculada de acordo com a regra de Simpson modificada2.

TNF-alfa, IL-1-beta, IL-6, MMP-2 e MMP-9 foram analisados através de kits de imunoensaio disponíveis comercialmente (Quantikine, R&D Systems, Minneapolis, MN, EUA). A vasopressina foi analisada através de um kit EIA (Ann Arbor, MI, EUA). O peptídeo natriurético do tipo B (BNP) foi medido usando-se imunoensaio fluorescente rápido (Biosite Diagnostics Incorporated, San Diego, California, USA). Todos os outros testes bioquímicos e hematológicos foram realizados utilizando-se kits disponíveis comercialmente.

Análise estatística

A análise estatística foi realizada utilizando-se o software SPSS (Statistical Package for Social Sciences) para Windows versão 9.0. As variáveis contínuas foram apresentadas como médias ± desvios-padrão. A distribuição das variáveis foi avaliada pelo teste de Kolmogorov-Smirnov. Como as variáveis não apresentavam distribuição normal, testes não-paramétricos foram realizados. Todas as comparações foram bicaudais. Valores de p < 0,05 foram considerados estatisticamente significantes.

Os autores tiveram acesso total aos dados e são responsáveis por sua integridade. Todos os autores leram e concordam com o manuscrito como foi escrito.

 

Resultados

Durante o período de estudo de seis meses, um total de 30 pacientes foram selecionados. Dois pacientes foram excluídos após a coleta de medula óssea: um paciente devido à doença arterial coronariana detectada durante a cateterização e outro devido a problemas técnicos com o equipamento de cateterização cardíaca, o que impediu a injeção.

As características basais da população estudada são descritas na Tabela 1. Como mostrado, os pacientes estavam no estágio avançado da doença e apresentavam diversos marcadores de gravidade da doença. Todos os pacientes apresentavam classe funcional III e IV, a despeito de tratamento médico otimizado com regime multidrogas e altas doses de diuréticos. Digoxina era utilizada por 95% dos pacientes, furosemida isoladamente ou em combinação com outros medicamentos era usada por 85% dos pacientes, IECA ou BRA por 85% e beta-bloqueadores por 55% dos pacientes. A capacidade funcional era baixa, com base na pequena distância percorrida durante o teste de caminhada de seis minutos e a QV estava significantemente comprometida, como indicado pelos escores altos obtidos no questionário de Minnesota. A função ventricular estava gravemente deprimida, com fração de ejeção muito baixa e diâmetro diastólico do VE aumentado no ecocardiograma. A presença de hiponatremia e disfunção renal caracterizaram ainda mais a grave condição dessa população.

 

 

Não houve complicações diretamente relacionadas à aspiração de conteúdo da medula óssea ou injeção de células. Uma média de 2,4 ± 1,2 x 108 células foram injetadas nas artérias coronárias. Testes de viabilidade mostraram que 96 ± 6,5 % das células eram viáveis no momento da injeção. Nenhuma alteração significante nos marcadores de necrose miocárdica em 24 horas ou alterações eletrocardiográficas sugestivas de isquemia ou infarto ocorreu.

A fim de verificar se o implante miocárdico de células-tronco estava associado com arritmias, o perfil arritmogênico foi avaliado através do numero total de contrações ventriculares prematuras em 24 horas, bem como seu padrão de recorrência e agrupamento. Nenhuma alteração significante foi encontrada no perfil arritmogênico (Tabela 2).

 

 

Houve quatro mortes durante o período de seis meses de seguimento: paciente 04, sexo masculino, idade 37, hemorragia pulmonar e insuficiência respiratória; paciente 16, sexo feminino, idade 34, morte súbita; paciente 27, idade 69, sexo masculino, insuficiência cardíaca terminal; paciente 7, idade 67, infecção respiratória complicada por insuficiência renal e choque). Nenhuma associação causal direta foi encontrada entre as mortes e o transplante de células. Não houve neoplasias, doenças hematológicas, coagulopatias, ou qualquer outro tipo doença que pudesse ser atribuído à injeção de células ou seu implante.

A função ventricular, avaliada pela FEVE, mostrou uma melhora significante, embora pequena, seis meses após o procedimento (Figura 1).

 

 

A QV avaliada pelo Questionário de Minnesota mostrou uma melhora acentuada no escore global após seis meses (Figura 2).

 

 

A capacidade funcional, medida pela distância percorrida no TC6M, mostrou uma melhora significante, embora pequena, após seis meses (Figura 3).

 

 

Uma diminuição significante na classe funcional média da NYHA foi observada após seis meses (Figura 4).

 

 

A análise bioquímica mostrou um aumento acentuado na concentração de sódio sérico durante o seguimento do estudo (Figura 5).

 

 

Entretanto, uma análise das concentrações de vasopressina não mostrou qualquer alteração significante, das suas concentrações basais a 180 dias depois (193 ± 53 para 182 ± 44 pg/ml, p = 0,38). Houve uma tendência de aumento nos níveis de BNP (507 ± 523 para 720 ± 515 pg/ml; p = 0,055), a qual não foi acompanhada por outras evidências de congestão ou deterioração de função ventricular.

Uma análise do turnover da matriz extracelular mostrou um aumento significante nos níveis de MMP-2 (Figura 6), mas não mostrou alterações nos níveis de MMP-9 (1,6 ± 1,8 para 2,3 ± 2,8 pg/ml, p = 0,20).

 

 

Nenhuma diferença significante nos níveis plasmáticos das citoquinas IL-1-beta (12 ± 14 para 13 ± 13 pg/ml, p = 0,54) e IL-6 (40 ± 74 para 28 ± 48 pg/ml, p = 0,21), bem como nos níveis de TNF-alfa (3,4 ± 3,5 para 3,8 ± 4,2 pg/ml, p = 0,38) foi observada.

 

Discussão

Esse estudo demonstra que a terapia celular realizada através de injeção intracoronariana de células mononucleares derivadas de medula óssea autóloga é viável, segura e parece ser efetiva em pacientes com IC avançada causada por DC.

Nesses pacientes selecionados, com IC grave, estável e adequadamente tratados, o procedimento foi bem tolerado e não foram observados arritmias, dano agudo ao miocárdio ou deterioração do desempenho cardíaco após a injeção de células nas artérias coronárias. Esse achado é de grande relevância, considerando que estudos anteriores que utilizaram células-tronco de músculo esquelético (células-satélite) apresentaram preocupações a respeito do desenvolvimento de arritmias em pacientes que foram submetidos a esse tipo de terapia celular2,3.

A despeito de estarem recebendo tratamento otimizado com regime multidrogas em doses adequadas, a CF dos pacientes e sua QV estavam gravemente comprometidas. Entretanto, houve melhoras consistentes em vários dos parâmetros avaliados. A QV melhorou de maneira consistente, como demonstrado pela avaliação feita através do questionário de Minnesota, o que reflete não apenas os parâmetros referentes à dispnéia, mas também os aspectos emocionais, psicológicos, econômicos e profissionais. O mesmo é verdadeiro em relação à variáveis mais objetivas, como a distância percorrida durante o teste de caminhada de 6 minutos, que mede a capacidade de exercício em níveis sub-máximos. Consistente com as variações mencionadas acima, houve uma melhora significante na CF, avaliada através da classificação da NYHA.

Os aumentos na FEVE foram similares àqueles descritos em estudos anteriores. Duas recentes revisões sistemáticas e meta-análises sobre terapia celular intracoronariana mostraram que esse tipo de terapia resulta em um aumento modesto, embora significante, na FEVE, quando comparado com controles (3 para 4%)5,6. No presente estudo, a FEVE média aumentou 5%, correspondendo a aproximadamente 20% do aumento relativo, já que a FEVE de nossos pacientes era significantemente mais baixa. A questão se um pequeno aumento na FEVE é de importância clínica é um assunto importante. A maioria das intervenções salvadoras na cardiologia não aumenta a fração de ejeção de forma substancial. Os mecanismos por trás da melhora no desempenho ventricular são uma questão a ser debatida. Dados recentes indicam que as células derivadas de medula óssea adotam características hematopoiéticas maduras7,8. Outro mecanismo proposto é que o TCDMO pode exercer efeitos anti-apoptóticos parácrinos, induzindo modificações no ambiente imune8.

Considerando a bem-conhecida dificuldade em controlar a hiponatremia com o tratamento usual, é digno de nota a observação da normalização do sódio sérico elevado nesse estudo7,8. O mecanismo de correção parece ser independente do nível de estímulos de vasopressina, considerando que os níveis séricos de vasopressina permaneceram elevados e precisam ser avaliados em outros estudos.

Um achado interessante de nosso estudo foi o comportamento dos níveis de BNP. A nível basal, os níveis de BNP estavam elevados, embora quando considerada a gravidade da IC, seria esperado que estivessem ainda mais altos7,8.

De certa forma surpreendente foi o fato de que, a despeito da melhora clínica consistente observada através de vários parâmetros, seus níveis não diminuíram de forma correspondente. Há alguma documentação demonstrando que, ocasionalmente, em ventrículos gravemente comprometidos, o nível de BNP pode não aumentar como esperado7. Os mecanismos considerados nessa situação podem implicar uma possível exaustão dos cardiomiócitos em produzir o BNP. Seguindo a mesma linha de pensamento, talvez o que tenhamos observado esteja de alguma forma relacionada a algum grau de regeneração de cardiomiócitos, re-estabelecendo sua capacidade de produzir BNP, apesar da melhora clínica parcial. Entretanto, não podemos excluir a possibilidade da regeneração de outros componentes celulares que tenham contribuído para esse fato7.

Sabe-se que a inflamação tem um papel principal na patogênese da DC9. Entretanto, em nosso estudo, os biomarcadores inflamatórios não mostraram alteração em resposta ao TCDMO. Esse achado sugere que a terapia celular não teve efeito sobre os mecanismos de inflamação ou então, outras fontes de hiperprodução dessas substancias não são afetadas pela técnica utilizada. É interessante registrar, entretanto, que os níveis de MMP-2 aumentaram após o TCDMO, o que pode se correlacionar com o aumento do turnover do colágeno7,8.

Considerando as características do presente estudo, um estudo pioneiro de fase 1, a eficácia do procedimento deve ser avaliada em um desenho mais adequado, o qual idealmente incluirá um grupo controlado por placebo para fins de comparação.

De qualquer forma, demonstramos em seres humanos com IC avançada causada por Doença de Chagas, o uso potencial de uma nova forma de terapia que precisa ser confirmada por observações futuras. Um estudo multicêntrico, randomizado, controlado por placebo, para testar os efeitos do TCDMO em IC chagásica em 300 pacientes, está atualmente incluindo pacientes9.

 

Agradecimentos

Os autores gostariam de agradecer a importante contribuição de Cristiane Carvalho e Aline Bernandes, do Hospital Santa Izabel e Daniele Brustollim do Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz, por sua ajuda na seleção dos pacientes, coleta de dados e manuseio de amostras biológicas.

Potencial Conflito de Interesses

Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.

Fontes de Financiamento

O presente estudo não teve fontes de financiamento externas.

Vinculação Acadêmica

Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.

 

Referências

1. Rector TS, Kubo SK, Cohn JN. Patient's self-assessment of their congestive heart failure, II: content, reliability and validity of a new measure. The Minnesota Living with Heart Failure Questionnaire. Heart Fail. 1987;3:198-209.         [ Links ]

2. Murry CE, Wiseman RW, Schwartz SM, Hauschka SD. Skeletal myoblast transplantation for repair of myocardial necrosis. J Clin Invest. 1996;98(11):2512-23.         [ Links ]

3. Menasche P, Hagege AA, Vilquin JT, Desnos M, Abergel E, Pouzet B, et al. Autologous skeletal myoblast transplantation for severe postinfarction left ventricular dysfunction. J Am Coll Cardiol. 2003;41(7):1078-83.         [ Links ]

4. Bittner V, Weiner DH, Yusuf S, Rogers WJ, McIntyre KM, Bangdiwala SI, et al. Prediction of mortality with a 6-minute walk test in patients with left ventricular dysfunction. SOLVD Investigators. JAMA. 1993;270(14):1702-7.         [ Links ]

5. Lipinski MJ, Biondi-Zoccai GG, Abbate A, Khianey R, Sheiban I, Bartunek J, et al. Impact of intracoronary cell therapy on left ventricular function in the setting of acute myocardial infarction: a collaborative systematic review and meta-analysis of controlled clinical trials. J Am Coll Cardiol. 2007;50(18):1761-7.         [ Links ]

6. Abdel-Latif A, Bolli R, Tleyjeh IM, Montori VM, Perin EC, Hornuz CA, et al. Adult bone marrow-derived cells for cardiac repair: a systematic review and meta-analysis. Arch Intern Med. 2007;167(10):989-97.         [ Links ]

7. Fielitz J, Leuschner M, Zurbrugg HR, Hannack B, Pregla R, Hetzer R, et al. Regulation of matrix metalloproteinases and their inhibitors in the left ventricular myocardium of patients with aortic stenosis. J Mol Med. 2004;82(12):809-20.         [ Links ]

8. Martos R, Baugh J, Ledwidge M, O'Loughlin C, Conlon C, Patle A, et al. Diastolic heart failure: evidence of increased myocardial collagen turnover linked to diastolic dysfunction. Circulation. 2007;115(7):888-95.         [ Links ]

9. Andrade ZA, Andrade SG, Correa R, Sadigursky M, Ferrans VJ. Myocardial changes in acute Trypanosoma cruzi infection. Ultrastructural evidence of immune damage and the role of microangioplasty. Am J. Pathol. 1994;144(6):1403-11.         [ Links ]

 

 

Correspondência:
Fábio Vilas-Boas Pinto
Av. Sete de Setembro, 4161 - Barra
41140-900 - Salvador, BA - Brasil
E-mail: fabiovboas@cardiol.br

Artigo recebido em 10/08/10; revisado recebido em 13/10/10; aceito em 19/10/10.