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Arquivos Brasileiros de Cardiologia

Print version ISSN 0066-782X

Arq. Bras. Cardiol. vol.98 no.3 São Paulo Mar. 2012 Epub Feb 16, 2012

http://dx.doi.org/10.1590/S0066-782X2012005000016 

Remodelamento miocárdico após grandes infartos converte potenciação pós-pausa em decaimento da força em ratos

 

 

Danilo Sales BocaliniI, II; Leonardo dos SantosIV; Ednei Luiz AntonioII; Alexandra Alberta dos SantosI; Ana Paula DavelIII; Luciana V. RossoniIII; Dalto Valentim VassaloIV; Paulo José Ferreira TucciI, II

IDepartamento de Medicina - Divisão de Cardiologia - Universidade Federal de São Paulo;, São Paulo, SP
IIDepartamento de Psicologia - Universidade Federal de São Paulo, São Paulo, SP
IIIDepartamento de Psicologia e Biofísica - Instituto de Ciências Biomédicas - Universidade de São Paulo, São Paulo, SP
IVDepartamento de Ciências Psicológicas - Universidade Federal do Espírito Santo, Vitória, ES, Brasil

Correspondência

 

 


RESUMO

FUNDAMENTO: A Contração Pós-Repouso (CPR) do músculo cardíaco fornece informações indiretas sobre a manipulação de cálcio intracelular.
OBJETIVO: Nosso objetivo foi estudar o comportamento da CPR e seus mecanismos subjacentes em camundongos com infarto do miocárdio.
MÉTODOS: Seis semanas após a oclusão coronariana, a contratilidade dos Músculos Papilares (MP) obtidos a partir de camundongos submetidos à cirurgia sham (C, n = 17), com infarto moderado (MMI, n = 10) e grande infarto (LMI, n = 14), foi avaliada após intervalos de repouso de 10 a 60 segundos antes e depois da incubação com cloreto de lítio (Li+) em substituição ao cloreto de sódio ou rianodina (Ry). A expressão proteica de SR Ca(2+)-ATPase (SERCA2), trocador Na+/Ca2+ (NCX), fosfolambam (PLB) e fosfo-Ser (16)-PLB foi analisada por Western blotting.
RESULTADOS: Os camundongos MMI apresentaram potenciação de CPR reduzida em comparação aos camundongos C. Em oposição à potenciação normal para camundongos C, foram observadas degradações de força pós-repouso nos músculos de camundongos LMI. Além disso, a Ry bloqueou a degradação ou potenciação de PRC observada em camundongos LMI e C; o Li+ inibiu o NCX e converteu a degradação em potenciação de CPR em camundongos LMI. Embora os camundongos MMI e LMI tenham apresentado diminuição no SERCA2 (72 ± 7% e 47 ± 9% de camundongos controle, respectivamente) e expressão protéica de fosfo-Ser16-PLB (75 ± 5% e 46 ± 11%, respectivamente), a superexpressão do NCX (175 ± 20%) só foi observada nos músculos de camundongos LMI.
CONCLUSÃO: Nossos resultados mostraram, pela primeira vez, que a remodelação miocárdica pós-IAM em camundongos pode mudar a potenciação regular para degradação pós-repouso, afetando as proteínas de manipulação de Ca(2+) em miócitos.

Palavras-chave: Remodelação cardíaca ventricular, infarto do miocárdio, relaxamento muscular, força muscular, camundongos.


 

 

Introdução

No músculo cardíaco, tanto o influxo de cálcio (Ca2+) pelo sarcolema quanto a liberação de Ca2+ no Retículo Sarcoplasmático (RS) contribuem para a ativação de miofilamentos durante a contração, e na maioria dos mamíferos, a liberação de Ca2+ induzida por Ca2+ a partir do SR é quantitativamente dominante1-3. Os mecanismos básicos celulares da contração muscular cardíaca são significativamente modulados pelo ritmo de estimulação. Assim, mudanças na frequência e no ritmo cardíaco são normalmente usadas como manobras experimentais para avaliar o comportamento ou revelar anormalidades na cinética de Ca2+ no acoplamento excitação-contração3. Assim, a Contração Pós-Repouso (CPR) permite uma avaliação indireta da função do RS2,4,5. No miocárdio de camundongos normais, a CPR é potencializada pelo Ca2+ adicional acumulado no RS durante a pausa em razão de atividade de Ca2+-ATPase (SERCA2) no RS e da liberação fracionária de Ca2+ 2,5 mediante a ativação. Por outro lado, a CPR é negativamente modulada pelo efluxo de Ca2+ ao longo do trocador Na+/Ca2+ 1,2,6,7.

O remodelamento ventricular que acontece após o Infarto do Miocárdio (IM) muitas vezes leva ao comprometimento da função contrátil do miocárdio poupado8-11, estando associado ao comprometimento da manipulação intracelular Ca2+ 12,13. Como resultado, foi proposto que a potenciação pós-repouso pudesse ser alterada patologicamente por uma alteração na cinética do cálcio14,15. Relatórios anteriores descreveram redução da potenciação pós-repouso nos músculos papilares do ventrículo esquerdo de camundongos com IM curado de diferentes tamanhos de infarto9,10. Recentemente, foi identificada, pela primeira vez, a degradação das contrações pós-repouso em camundongos com insuficiência cardíaca crônica16. Considerando que os mecanismos fisiopatológicos subjacentes à gênese da contração pós-repouso no miocárdio de camundongos após a remodelação não estão completamente definidos, no presente relatório foi investigada a CPR do músculo papilar ventricular esquerdo remanescente do MI, e sua relação com a remodelação molecular das principais proteínas de manipulação de Ca2+.

 

Métodos

Animais

Camundongos Wistar pesando 180-220 g foram tratados e utilizados de acordo com os Principles of Laboratory Animal Care (Publicação do NIH No. 86-23, revisados em 1985) e o protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de São Paulo (CEP# 0340/08).

Infarto do miocárdio experimental

O IM foi produzido pela ligadura da artéria coronariana permanente, como descrito pelo nosso laboratório em publicações anteriores11,17. Brevemente, sob anestesia (ketamina 50 mg/kg e xilazina 10 mg/kg, via intraperitoneal) e ventilação artificial (Harvard Rodent Ventilator, modelo 863, Harvard Apparatus, Holliston, MA), foi feita uma toracotomia esquerda. O coração foi exteriorizado e a artéria coronariana descendente anterior foi ligada com sutura de polipropileno 6-0. O coração foi rapidamente reposicionado e o tórax foi fechado. Camundongos submetidos à cirurgia sham foram considerados o grupo controle (C). Todos os resultados morfológicos e funcionais foram avaliados seis semanas após a produção do IM.

Função cardíaca global e morfologia

A fim de caracterizar o IM, bem como as dimensões e a função do coração, foi realizado um ecocardiograma com Doppler em animais anestesiados (mesma mistura de ketamina com xilazina) seis semanas após a cirurgia. Esses procedimentos foram realizados por um observador cego à condição animal, usando um instrumento HP SONOS 5500 (Philips Medical System, Andover, MA, EUA) com um transdutor de 12 MHz a uma profundidade de 2 cm, de acordo com metodologia previamente descrita11,17,18. Imagens transversais foram obtidas nos níveis basal (na extremidade das válvulas da valva mitral), médio (ao nível dos músculos papilares) e apical (distal ao músculo papilar, mas além do tampão da cavidade). O tamanho do infarto foi estimado como a identificação subjetiva de acinesia ou discinesia da parede ventricular esquerda (VE) em cada plano transversal e apresentado como o comprimento do arco correspondente ao segmento da cicatriz do IM em relação ao perímetro total da borda endocárdica do VE. Recentemente, demonstramos que essa medida ecocardiográfica está satisfatoriamente de acordo com a coloração histoquímica18. Os animais infartados foram divididos em dois grupos, de acordo com o tamanho do IM: um grupo composto de camundongos com IM moderado, entre 20% e 39% do VE (MMI), e outro grupo de camundongos com IM maior que 39% do VE (LMI).

Os diâmetros diastólico e sistólico final do VE foram medidos a partir do corte transversal paraesternal usando imagens em modo M. A função sistólica foi definida pela fração de encurtamento e calculada como a média percentual de variação entre os diâmetros diastólico e sistólico. A função diastólica foi analisada pela curva de velocidade de influxo diastólico mitral pelo Doppler pulsado. A partir de uma vista de 4 câmaras, foram adquiridos o pico da onda E e velocidades da onda A e calculada a razão E/A.

Mecânica muscular cardíaca isolada

Imediatamente após o exame ecocardiográfico, foram feitas preparações in vitro do músculo papilar isolado do VE19. O coração foi rapidamente removido e colocado em solução Krebs-Henseleit oxigenada tamponada a 29 °C. O músculo papilar posterior do VE foi cuidadosamente dissecado e verticalmente inserido em um banho de órgãos aquecido a 29 °C e 100% oxigenado. O músculo foi acoplado a um transdutor de força isométrica (GRASS FT-03, Astro-Med, Inc. RI, EUA) conectado a um micrômetro para ajustes de comprimento muscular. A composição da solução de Krebs-Henseleit foi a seguinte (em mM): 135 NaCl; 4,69 KCl, 1,5 CaCl; MgSO4 1,16; KH2PO4 1,18; 5,50 glicose, 10 U de insulina e 20 HEPES, tamponado a pH 7,4. As preparações foram estimuladas a 0,2 Hz, com 5 ms de pulsos de onda quadrada através de eletrodos de platina paralelos com tensões ajustadas para aproximadamente 10% a mais do que o mínimo necessário para produzir resposta mecânica máxima. Após 60 min de estabilização na condição de baixa carga, o músculo foi carregado para contrair isometricamente e esticado até o máximo comprimento de sua curva de comprimento-tensão (Lmáx). Os testes foram realizados em Lmáx (comprimento ideal para contração), e a tensão isométrica foi avaliada pela força normalizada para a área da seção transversal do músculo (g mm-2). Os seguintes parâmetros foram obtidos: Tensão de Repouso (TR), pico da Tensão Desenvolvida (TD) e sua primeira derivada (dT/dt), tempo para atingir o pico da tensão desenvolvida (TPT) e tempo para 50% de relaxamento (TR50). CPRs relativas foram medidas em três grupos experimentais utilizando durações de pausa de 10, 15, 30, 45 e 60 segundos. A CPR relativa foi expressa como a amplitude da TD pós-repouso dividida pela TD em estado estacionário. Para investigar o papel do RS e NCX na CPR, esse protocolo foi repetido na presença de rianodina 1 µM para inibir a função do RS20, usando uma versão modificada de solução KH com zero [Na+] e 135 mM de cloreto de lítio (Li+) para inibir a função do NCX21. O Li+ foi substituído por Na+, porque passa pelo canal de Na+, mantendo a excitabilidade do miócito enquanto os trocadores de membrana não são capazes de usar Li+ para a troca21.

Parâmetros biométricos

Depois da remoção do músculo papilar, os ventrículos direito e esquerdo foram separados e pesados. O pulmão direito também foi excisado e pesado. Após secagem a 70 ºC durante 12h, o Teor de Água Pulmonar (TAP), considerado um índice de congestão, foi determinado utilizando a seguinte equação: TAP (%) = (perda de peso após a secagem / peso úmido) × 100.

Expressão proteica de SERCA2, fosfolambam e NCX

O teor de proteína foi analisado em amostras de VE remanescente dos grupos LMI, MMI e C após a excisão dos músculos papilares e cicatrização do infarto. Homogeneizados de tecido foram analisados por Western blotting de acordo com protocolos previamente descritos5 para comparar a expressão protéica de SERCA2, fosfolambam (PLB), fosfo-Ser16-PLB e NCX em todos os grupos experimentais. Amostras de miocárdios não infartados foram rapidamente congeladas a -70 ºC. Os tecidos foram homogeneizados em tampão de extração gelado (Tris 50 mM, EDTA 1 mM e sacarose mM 250, pH 7,4) usando Polytron (Polytron® PT2100, Kinematica AG, Littau, LU, SWI). Para preparar as frações microssomais de proteínas, foi feita uma centrifugação inicial a 10.000 × g por 10 min a 4 °C. O sobrenadante foi centrifugado a 100.000 × g por 60 min. O pellet, o que representa a fração microssomal, foi ressuspendido em tampão Tris-EDTA (Tris 50 mM, EDTA 1,0 mM, pH 7,4). Vinte e cinco microgramas de proteína do VE e padrões moleculares SDS-PAGE pré-colorados (Bio-Rad, Laboratories, Hercules, CA, EUA) foram separados por eletroforese em SDS-PAGE 7,5% ou 12% (para NCX ou SERCA2 e PLB, respectivamente) e, em seguida, transferidos para membranas de polivinil difluoreto durante a noite a 4 °C, usando um sistema celular de transferência Mini Trans-Blot (Bio-Rad) contendo Tris 25 mM, glicina 190mM, metanol 20% e SDS 0,05%. A eficiência de transferência e a igualdade de carga de proteína foram verificadas através da coloração de Ponceau S 1% (Caledon Laboratories, Georgetown, ON, CAN), previamente validado como uma alternativa eficiente para o controle de qualidade e carga das amostras22. Em seguida, a membrana foi bloqueada por 60 minutos à temperatura ambiente em solução tamponada Tris (Tris 10 mM, NaCl 100 mM, Tween-20 0,1%, pH 7,4) com 5% de leite desnatado em pó. Em seguida, a membrana foi incubada durante a noite a 4 °C com anticorpos monoclonais de camundongo anti-NCX1 (diluição 1:1500, anticorpos suíços Swant®, Bellinzona, CH, SWI), anticorpos monoclonais de camundongo anti-SERCA2 (diluição 1:2.500, Abcam Inc., MA, EUA), anticorpos monoclonais de camundongo anti-PLB (0,25 mg/mL, Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, EUA) ou anticorpos monoclonais anti-fosfo-Ser16-PLB de camundongo (1:1000, Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, EUA). Após a lavagem, a membrana foi incubada por 90 min com um anticorpo IgG anticamundongo conjugado com peroxidase de rábano silvestre (diluição 1:3000; Bio-Rad, CA, EUA). A membrana foi cuidadosamente lavada e os imunocomplexos foram detectados através de sistema de peroxidase de rábano silvestre/quimioluminescência com luminol (ECL Plus, Amersham International plc, Little Chalfont, UK) e, em seguida, submetida a autorradiografia. Parcelas de proteínas foram quantificadas pelo software Scion Image (Scion baseado em imagem NIH) em unidades arbitrárias de densidade óptica normalizadas por valores médios obtidos para as amostras C em cada membrana.

Análise estatística

Os resultados são expressos como média ± EPM e analisados pelo teste t de Student ou por análise de variância (ANOVA mono ou bifatorial), seguidos pelo teste post hoc de Bonferroni, conforme o caso. Todas as análises estatísticas foram realizadas com o software GraphPad Prism 4.0 (GraphPad Softwares Inc., San Diego, CA, EUA) e as diferenças de p < 0,05 foram consideradas significativas.

 

Resultados

Biometria e ecocardiograma com Doppler

A tabela 1 mostra que os pesos dos ventrículos direito e esquerdo aumentaram no grupo LMI comparados aos controles (grupo C). O grupo MMI mostrou-se apenas parcialmente alterado em comparação com o grupo C, somente com índices de peso coração/corpo e VE/corpo aumentados. Esses parâmetros estiveram acompanhados por maior TAP no grupo LMI em comparação com os grupos MMI e C (tab. 1). Dados ecocardiográficos morfológicos e funcionais (tab. 1) sugerem dilatação das cavidades cardíacas associada a disfunção sistólica e diastólica em camundongo de ambos os grupos infartados, sendo que a maioria dos parâmetros avaliados mostrou-se mais extensivamente alterada no grupo LMI do que no grupo MMI.

 

 

Contratilidade miocárdica in vitro

A área transversal foi maior no grupo LMI (1,16 ± 0,05 mm2, n = 14) em comparação com o grupo MMI (1,01 ± 0,05 mm2, n = 10) e o grupo C (0,96 ± 0,04 mm2, n = 17). Como podemos ver na tabela 2, após seis semanas de oclusão coronária, os parâmetros contráteis foram prejudicados nos grupos MMI e LMI em comparação com o grupo C, apresentando uma depressão da TD e da dT/dt positiva. No entanto, somente o grupo LMI mostrou depressão significativa da dT/dt negativa, bem como maior tempo de duração das fases de contração e relaxamento.

 

 

Na figura 1A, traçados originais ilustram o comportamento da CPR dos músculos papilares de camundongos infartados e controles durante as pausas da estimulação. No grupo C, a potenciação da CPR ocorreu, o que aumentou com a duração da pausa. No entanto, nos músculos dos grupos infartados, o comportamento da CPR foi substancialmente alterado. Enquanto o grupo MMI apresentou uma redução nessa potenciação de CPR, os músculos no grupo LMI desenvolveram degradação da força após o repouso em comparação com contrações em estado estacionário. A degradação se acentuou com o aumento da duração da pausa (fig. 1B).

A fim de investigar os mecanismos da CPR em músculos papilares de camundongos infartados, foram utilizadas ferramentas farmacológicas (fig. 2) e moleculares (fig. 3). Tendo em vista que apenas o grupo LMI exibiu o comportamento incomum da CPR, os seguintes protocolos farmacológicos foram realizados apenas no grupo C; no grupo LMI foram feitas preparações papilares. A administração de Ry (1 µM, durante 30 min) na solução de Krebs-Henseleit aboliu completamente a potenciação de CPR no grupo C e a degradação de CPR no grupo LMI (fig. 2A). Por outro lado, o bloqueio de NCX com uma solução de Krebs-Henseleit modificada contendo Li+ em vez de Na+ promoveu uma ligeira melhora na contração relativa CPR no grupo C e restabeleceu o comportamento normal no grupo LMI, convertendo a degradação de CPR para um perfil de potenciação de CPR (fig. 2B).

Teor de proteínas por Western blotting

Em todos os grupos, foram investigadas proteínas de manipulação cálcio possivelmente envolvidas nessas alterações (fig. 3). O remodelamento miocárdico após o infarto levou a uma diminuição do teor de SERCA2: embora o grupo MMI tenha apresentado diminuição moderada da expressão proteica de SERCA2, foi alcançada significância apenas no grupo LMI (fig. 3A). O PLB total mostrou-se significativamente reduzido tanto no grupo MMI (79 ± 12% do teor de C) quanto no grupo LMI (65 ± 10% do teor de C). Sua forma fosforilada (Ser16-PLB) também se apresentou reduzida nos grupos infartados (fig. 3B). Embora o teor de proteína NCX não tenha se alterado no grupo MMI quando comparado ao grupo C, esse mesmo teor mostrou-se aproximadamente 1,7 vez mais expressivo no grupo LMI (fig. 3C).

 

Discussão

Nossos resultados mostram que a remodelação miocárdica pós-IM em camundongos pode mudar a potenciação regular pós-repouso para pós-degradação da força ativa afetando proteínas de manipulação de Ca(2+) em miócitos. Esse comportamento incomum da mecânica do miocárdio mostrou-se evidente apenas em animais com grande infarto, em que o processo de remodelação incluiu não apenas dilatação do VE com disfunção sistólica e diastólica, mas também pior contração e relaxamento do miocárdio, provavelmente pela deficiência de captação de SR Ca2+ e efluxo excessivo de Ca2+ do sarcolema.

Disfunção ventricular no IM e dilatação das cavidades cardíacas, normalmente observadas em camundongos com infartos maiores23, também são mostradas no presente estudo. A remodelação pós-IAM esteve associada com a diminuição do desenvolvimento de tensão nos músculos papilares de camundongos infartados e taxa reduzida de geração de força e relaxamento, como relatado anteriormente para os músculos papilares9,10,13,20,24. Identificou-se também um comprometimento similar do encurtamento em miócitos ventriculares isolados25,26, e os mecanismos propostos para explicar a disfunção contrátil incluem defeitos no acoplamento excitação-contração13,24.

Contrações pós-repouso no músculo cardíaco

Durante o repouso do miocárdio, o Ca2+ é removido do citosol para o RS por SERCA2 ou para a mitocôndria pelo uniportador de Ca2+, ou é expulso pelo NCX e Ca2+-ATPase do sarcolema1. Nos protocolos de CPR como o utilizado no presente trabalho, a potenciação da TD ocorre depois de uma pausa de estímulos, como esperado para o músculo cardíaco de camundongos. Normalmente, como a maior parte do Ca2+ retorna ao RS durante o período de repouso, seu teor tende a aumentar com o prolongamento da pausa, aumentando também a liberação de Ca2+ e, por fim, a geração de força sobre a próxima ativação1. Na verdade, a administração de Ry para bloquear a função do RS nos nossos experimentos aboliu completamente a potenciação dos músculos no grupo C, reforçando estudos anteriores que descrevem o papel fundamental da função de armazenamento do RS nesse fenômeno4. Por outro lado, a inibição da extrusão de Ca2+ pelo sarcolema pelo NCX em nossas preparações (usando Li+) aumentou a potenciação dos músculos C, o que confirma a importância dos mecanismos de efluxo de Ca2+ para modular negativamente a CPR do músculo do VE dos camundongos6,7. De fato, relatou-se que a estimulação do NCX leva a um aumento do efluxo de Ca2+ e influxo de Na+ e, consequentemente, a uma diminuição da CPR27,28

Degradação pós-repouso no músculo cardíaco de camundongos

Diversos relatos investigaram a remodelação miocárdica pós-infarto e disfunção contrátil, tendo apontado deficiências na movimentação de Ca2+ em cardiomiócitos13,29-31. A literatura é controversa a respeito do comportamento da CPR na remodelação pós-IM. Em miocárdios humanos com disfunção, os autores relataram diminuição da potenciação32,33 ou degradação28 da contração após pausas prolongadas. Em modelos animais9,10, observou-se a diminuição da potenciação em comparação aos controles a partir de ratos infartados. Além disso, em miócitos sobreviventes após IM em cães, houve redução da potenciação da contração após o repouso34. Essas alterações foram atribuídas essencialmente ao comprometimento da função de armazenamento do RS associado com relativa redução da liberação de Ca2+. Recentemente, nosso grupo identificou degradação da CPR nos músculos papilares de camundongos com insuficiência cardíaca 40 semanas após a oclusão coronariana16. No entanto, os mecanismos causais para esse comportamento inédito da CPR em camundongos não foram investigados, tendo em vista que o presente estudo utiliza camundongos adultos com infartos curados de seis semanas de idade.

Nossos experimentos sugerem que as alterações do acoplamento excitação-contração contribuem para a redução da CPR nos camundongos LMI: a disfunção de armazenamento do RS associada com a intensificação da extrusão de Ca2+, uma vez que a Ry aboliu este fenômeno, ao passo que a inibição de NCX normalizou-o.

O comprometimento da função de reabsorção do RS, o que provavelmente ocorre tanto no grupo MMI quanto no grupo LMI, pode não se dar somente pela diminuição da expressão proteica de SERCA2, mas também ao menor teor de Ser16-PLB como mostra os ensaios de Western blotting. Quando fosforilada, a proteína reguladora PLB alivia a inibição da SERCA2, permitindo a sua função de captação de Ca2+ 1. De fato, a diminuição da fosforilação de PLB no miocárdio remodelado de camundongos infartados também tem sido descrita como levando à disfunção do RS31. Além disso, não podemos ignorar a ocorrência de vazamento diastólico elevado de Ca2+ das vesículas do RS. Relata-se que as proteínas reguladoras receptoras da Ry (FKBP, em especial, FKBP12.6) podem ser patologicamente alteradas em sua estrutura e conteúdo, bem como nos mecanismos de fosforilação que modulam o acoplamento do receptor FKBP-rianodina, resultando em uma subcondutância no remodelamento do miocárdio29,35.

Particularmente nos músculos do grupo LMI, usando Li+ em vez de Na+ na solução de Krebs-Henseleit, a degradação da CPR em experimentos realizados no grupo LMI passou a se constituir em uma potenciação típica da CPR, sugerindo o papel fundamental do NCX sobre a deficiência da contração subseqüente quando ocorre degradação da CPR. Como mencionado anteriormente, embora a acumulação de Ca2+ no RS seja relativamente limitada pelo efluxo de Ca2+ através do sarcolema, o RS normalmente reabsorve a maior parte do Ca2+ como resultado da absorção dominante de SERCA2 sobre a extrusão deste íon pelo sarcolema em cardiomiócitos de camundongos. Por outro lado, se os mecanismos de efluxo de Ca2+ pelo sarcolema estão desempenhando um papel mais importante do que a reabsorção pelo RS, a degradação do teor de Ca2+ pelo RS tende a ocorrer com o prolongamento da pausa em coelhos27. De fato, nos mamíferos em que a importância da SERCA2 é contrabalançada pelo NCX na realização da retirada de Ca2+, como é o caso dos coelhos, o miocárdio normalmente exibe essa redução na força da primeira contração seguinte às restantes, proporcionalmente à duração da pausa, designada como degradação pós-repouso1. De fato, nossos resultados mostram uma superexpressão significativa do teor do NCX no grupo LMI quando comparado aos grupos MMI e C, o que corrobora a ideia que o aumento da atividade e/ou expressão de NCX está relacionado com a degradação pós-repouso após o IM e insuficiência cardíaca, pelo menos nos camundongos.

Embora o miocárdio remodelado tanto do grupo MMI quanto do grupo LMI tenha diminuído os teores de SERCA2 e Ser16-PLB, observou-se elevação do nível de proteína NCX somente no grupo LMI, o grupo experimental que apresentou degradação pós-repouso. Assim, o perfil molecular com remodelação pós-IM deve ser uma variável de fundamental importância para a ocorrência de degradação pós-repouso. De fato, as mudanças em diferentes proteínas de cardiomiócitos foram relatadas em modelos animais21,30,36 e humanos com insuficiência cardíaca37,38 como causadoras do acoplamento disfuncional excitação-contração. Como resultado, sugerimos que a importância alterada do efluxo de Ca2+ pelo sarcolema provocado pela superexpressão de NCX associada com a captação disfuncional por parte do RS tenha, provavelmente, levado ao comprometimento miocárdico dos camundongos, apresentando essa degradação da CPR.

Embora não tenhamos medido diretamente o [Ca2+]i ou a atividade das proteínas manipuladoras de cálcio analisadas, limitações reconhecidas no presente estudo, nossos resultados sugerem que o comprometimento da função de reabsorção do RS associado com o aumento de efluxo de cálcio durante a diástole do músculo do grupo LMI é a causa provável da degradação da força pós-repouso. Portanto, é possível especular também que menores índices de [Ca2+]i devido ao aumento de NCX, embora possa reduzir a sobrecarga deletéria de Ca2+, pode diminuir o Ca2+ disponível para reabsorção durante a diástole e, conseqüentemente, a quantidade liberada durante a sístole.

Em suma, nossos resultados confirmaram que camundongos infartados apresentam disfunção ventricular global e também distúrbios contráteis do miocárdio decorrentes do infarto diretamente relacionado à gravidade da remodelação. Contribuindo para essa alteração, o uso do protocolo CPR identificou um comportamento excepcional do miocárdio dos camundongos, designado como degradação da força pós-repouso. Atribui-se esse fenômeno a um distúrbio nas proteínas de manipulação de Ca2+ no exercício das suas funções normais, especialmente em grandes infartos do miocárdio, devido à associação da reduzida reabsorção de Ca2+ pela SERCA2 com o efluxo excessivo de Ca2+ pelo NCX.

 

Referências

1. Bassani JWM, Bassani RA, Bers DM. Relaxation in rabbit and rat cardiac cells: species-dependent differences in cellular mechanisms. J Physiol. 1994;476(2):279-93.         [ Links ]

2. Bers DM. Calcium cycling and signaling in cardiac myocytes. Annu Rev Physiol. 2008;70:23-49.         [ Links ]

3. Endoh M. Force-frequency relationship in intact mammalian ventricular myocardium: physiological and pathophysiological relevance. Eur J Pharmacol. 2004;500(1-3):73-86.         [ Links ]

4. Ravens U, Link S, Gath J, Noble M. Post-rest potentiation and its decay after inotropic interventions in isolated rat heart muscle. Pharmacol Toxicol. 1995;76(1):9-16.         [ Links ]

5. Rossoni LV, Xavier FE, Moreira CM, Falcochio D, Amanso AM, Tanoue CU, et al. Ouabain-induced hypertension enhances left ventricular contractility in rats. Life Sci. 2006;79(16):1537-45.         [ Links ]

6. Abreu G, Vassallo D, Mill J. The Na+-Ca2+ exchange mechanism as a regulator of post rest contractions in cardiac muscle. Braz J Med Biol Res. 1987;20(6):817-20.         [ Links ]

7. Mill J, Vassallo D, Leite C. Mechanisms underlying the genesis of post-rest contractions in cardiac muscle. Braz J Med Biol Res. 1992;25(4):399-408.         [ Links ]

8. Stefanon I, Martins M, Vassallo D, Mill J. Analysis of right and left ventricular performance of the rat heart with chronic myocardial infarction. Braz J Med Biol Res. 1994;27(11):2667-79.         [ Links ]

9. Novaes M, Stefanon I, Mill J, Vassallo D. Contractility changes of the right ventricular muscle after chronic myocardial infarction. Braz J Med Biol Res. 1996;29(12):1683-90.         [ Links ]

10. Wagner KD, Theres H, Born A, Strube S, Wunderlich N, Pfitzer G, et al. Contractile function of papillary muscle from rats with different infarct size after beta-adrenergic blockade and ACE-inhibition. J Mol Cell Cardiol. 1997;29(11):2941-51.         [ Links ]

11. Portes LA, Tucci PJF. Swim training attenuates myocardial remodeling and the pulmonary congestion in wistar rats with secondary heart failure to myocardial infarction. Arq Bras Cardiol. 2006,87(1):54-9.         [ Links ]

12. Gomez AM, Guatimosim S, Dilly KW, Vassort G, Lederer WJ. Heart failure after myocardial infarction: altered excitation-contraction coupling. Circulation. 2001;104(6):688-93.         [ Links ]

13. Sjaastad I, Birkeland J, Ferrier G, Howlett S, Skomedal T, BjØrnerheim R, et al. Defective excitation-contraction coupling in hearts of rats with congestive heart failure. Acta Physiol Scand. 2005;184(1):45-58.         [ Links ]

14. O'Rourke B, Kass DA, Tomaselli GF, Kaab S, Tunin, R, Marban E. Mechanisms of altered excitation-contraction coupling in canine tachycardia-induced heart failure, I : experimental studies. Circ Res. 1999;84(5):562-70.         [ Links ]

15. Pogwizd SM, Qi M, Yuan W, Samarel AM, Bers DM. Upregulation of Na+/Ca2+ exchanger expression and function in an arrhythmogenic rabbit model of heart failure. Circ Res. 1999;85(11):1009-19.         [ Links ]

16. Helber I, dos Santos AA, Antonio EL, Flumignan RLG, Bocalini, DS, Piccolo C, et al. Digitoxin prolongs survival of female rats with heart failure due to large myocardial infarction. J Card Fail. 2009;15(9):798-804.         [ Links ]

17. dos Santos L, Antonio EL, Souza AFM, Tucci PJF. Use of afterload hemodynamic stress as a practical method for assessing cardiac performance in rats with heart failure. Can J Physiol Pharmacol. 2010;88(7):724-32.         [ Links ]

18. dos Santos L, Mello AF, Antonio EL, Tucci PJ. Determination of myocardial infarction size in rats by echocardiography and tetrazolium staining: correlation, agreements, and simplifications. Braz J Med Biol Res. 2008;41(3):199-201.         [ Links ]

19. Bocalini DS, Veiga ECA, Souza AFM, Levy RF, Tucci PJF. Exercise training-induced enhancement in myocardial mechanics is lost after two-weeks of detraining in rats. Eur J Appl Physiol. 2010;109(5):909-14.         [ Links ]

20. Mill J, Novaes M, Galon M, Nogueira J, Vassallo D. Comparison of the contractile performance of the hypertrophied myocardium from spontaneous hypertensive rats and normotensive infarcted rats. Can J Physiol Pharmacol. 1998;76(4):387-94.         [ Links ]

21. Smith GL, Allen DG. Effects of metabolic blockade on intracellular calcium concentration in isolated ferret ventricular muscle. Circ Res. 1988;62(6):1223-36.         [ Links ]

22. Romero-Calvo I, Ocón B, Martínez-Moya P, Suárez MD, Zarzuelo A, Martínez-Augustin O, et al. Reversible Ponceau staining as a loading control alternative to actin in Western blots. Anal Biochem. 2010;401(2):318-20.         [ Links ]

23. Litwin SE, Katz SE, Morgan JP, Douglas PS. Serial echocardiographic assessment of left ventricular geometry and function after large myocardial infarction in the rat. Circulation. 1994;89(1):345-54.         [ Links ]

24. Litwin SE, Litwin CM, Raya T, Warner A, Goldman S. Contractility and stiffness of noninfarcted myocardium after coronary ligation in rats: effects of chronic angiotensin converting enzyme inhibition. Circulation. 1991;83(3):1028-37.         [ Links ]

25. WislØff U, Loennechen JP, Currie S, Smith GL, Ellingsen O. Aerobic exercise reduces cardiomyocyte hypertrophy and increases contractility, Ca2+ sensitivity and SERCA-2 in rat after myocardial infarction. Cardiovasc Res. 2002;54(1):162-74.         [ Links ]

26. Zhang X-Q, Song J, Qureshi A, Rothblum LI, Carl LL, Tian Q, et al. Rescue of contractile abnormalities by Na+/Ca2+ exchanger overexpression in postinfarction rat myocytes. J Appl Physiol. 2002;93(6):1925-31.         [ Links ]

27. Bassani RA, Bers DM. Na-Ca exchange is required for rest-decay but not for rest-potential of twitches in rabbit and rat ventricular myocytes. J Mol Cell Cardiol. 1994;26(10):1335-47.         [ Links ]

28. Maier LS, Schwan C, Schillinger W, Minami K, Schutt U, Pieske B. Gingerol, isoproterenol and ouabain normalize impaired post-rest behavior but not force-frequency relation in failing human myocardium. Cardiovasc Res. 2000;45(4):913-24.         [ Links ]

29. Marx SO, Reiken S, Hisamatsu Y, Jayaraman T, Burkhoff D, Rosemblit N, et al. PKA phosphorylation dissociates FKBP12.6 from the calcium release channel (ryanodine receptor): defective regulation in failing hearts. Cell. 2000;101(4):365-76.         [ Links ]

30. Gomez AM, Schwaller B, Porzig H, Vassort G, Niggli E, Egger M. Increased exchange current but normal Ca2+ transport via Na+-Ca2+ exchange during cardiac hypertrophy after myocardial infarction. Circ Res. 2002;91(4):323-30.         [ Links ]

31. Bers DM. Altered cardiac myocyte Ca regulation in heart failure. Physiology. 2006;21:380-7.         [ Links ]

32. Pieske B, Maier LS, Bers DM, Hasenfuss G. Ca2+ handling and sarcoplasmic reticulum Ca2+ content in isolated failing and nonfailing human myocardium. Circ Res. 1999;85(1):38-46.         [ Links ]

33. Rossman EI, Petre RE, Chaudhary KW, Piacentino V, Janssen PML, Gaughan JP, et al. Abnormal frequency-dependent responses represent the pathophysiologic signature of contractile failure in human myocardium. J Mol Cell Cardiol. 2004;36(1):33-42.         [ Links ]

34. Licata A, Aggarwal R, Robinson RB, Boyden P. Frequency dependent effects on Cai transients and cell shortening in myocytes that survive in the infarcted heart. Cardiovasc Res. 1997;33(2):341-50.         [ Links ]

35. Yano M, Yamamoto T, Ikemoto N, Matsuzaki M. Abnormal ryanodine receptor function in heart failure. Pharmacol Ther. 2005;107(3):377-91.         [ Links ]

36. Wasserstrom JA, Holt E, Sjaastad I, Lunde PK, Odegaard A, Sejersted OM. Altered E-C coupling in rat ventricular myocytes from failing hearts 6 wk after MI. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2000;279(2):H798-807.         [ Links ]

37. Hasenfuss G, Reinecke H, Studer R, Pieske B, Meyer M, Drexler H, et al. Calcium cycling proteins and force-frequency relationship in heart failure. Basic Res Cardiol. 1996;91(Suppl.2):17-22.         [ Links ]

38. Prestle J, Quinn FR, Smith GL. Ca(2+)-handling proteins and heart failure: novel molecular targets? Curr Med Chem. 2003;10(11):967-81.         [ Links ]

 

 

Correspondência:
Danilo Sales Bocalini
Rua General Chagas Santos, 392 - Saúde
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E-mail: bocalini@fcr.epm.br

Artigo recebido em 31/05/11
Revisado recebido em 13/09/11
Aceito em 20/09/11.