Influência do tempo de exposição à obesidade induzida por dieta hiperlipídica sobre os colágenos tipo I e III miocárdico

Resumos

FUNDAMENTO:

A obesidade é um fator de risco para muitas complicações médicas; a pesquisa médica demonstrou que as alterações hemodinâmicas, morfológicas e funcionais estão correlacionadas com a duração e gravidade da obesidade.

OBJETIVO:

O presente estudo determinou a influência do tempo de exposição à obesidade induzida por dieta com alto teor de gordura no colágenos tipo I e III miocárdico.

MÉTODOS:

Ratos machos com trinta dias de idade, da raça Wistar, foram distribuídos aleatoriamente em dois grupos: um grupo de controle (C) alimentado com ração padrão e um grupo de ratos obesos (Ob) alternadamente alimentados com uma de quatro dietas palatáveis ricas em gordura. Cada dieta foi mudada diariamente, e os ratos foram mantidos em suas respectivas dietas por 15 (C₁₅ e Ob₁₅) e 30 (C₃₀ e Ob₃₀) semanas consecutivas. A obesidade foi determinada pelo índice de adiposidade.

RESULTADOS:

O grupo Ob₁₅ foi similar ao grupo C₁₅ em relação à expressão de colágeno miocárdico tipo I; contudo, a expressão no grupo Ob₃₀ foi menor do que no grupo C₃₀. O tempo de exposição à obesidade foi associado com uma redução de colágeno do tipo I no grupo Ob₃₀, quando comparado com o Ob₁₅. A obesidade não afetou a expressão do colágeno tipo III.

CONCLUSÃO:

Este estudo mostrou que o tempo de exposição à obesidade por 30 semanas induzida por uma dieta rica em gordura insaturada causou uma redução na expressão do colágeno miocárdico tipo I em ratos obesos. No entanto, nenhum efeito foi observado em relação à expressão do colágeno miocárdico tipo III

Obesidade; Dieta hiperlipídica / normas; Colágeno Tipo I; Colágeno Tipo III; Miocárdio

BACKGROUND:

Obesity is a risk factor for many medical complications; medical research has shown that hemodynamic, morphological and functional abnormalities are correlated with the duration and severity of obesity.

OBJECTIVE:

Present study determined the influence of term of exposure to high-fat diet-induced obesity on myocardial collagen type I and III.

METHODS:

Thirty-day-old male Wistar rats were randomly distributed into two groups: a control (C) group fed a standard rat chow and an obese (Ob) group alternately fed one of four palatable high-fat diets. Each diet was changed daily, and the rats were maintained on their respective diets for 15 (C₁₅ and Ob₁₅) and 30 (C₃₀ and Ob₃₀) consecutive weeks. Obesity was determined by adiposity index.

RESULTS:

The Ob₁₅ group was similar to the C₁₅ group regarding the expression of myocardial collagen type I; however, expression in the Ob₃₀ group was less than C₃₀ group. The time of exposure to obesity was associated with a reduction in collagen type I in Ob₃₀ when compared with Ob₁₅. Obesity did not affect collagen type III expression.

CONCLUSION:

This study showed that the time of exposure to obesity for 30 weeks induced by unsaturated high-fat diet caused a reduction in myocardial collagen type I expression in the obese rats. However, no effect was seen on myocardial collagen type III expression.

Obesity; High-fat diet; Collagen Type I; Collagen Type III; Myocardium

Introdução

A obesidade é uma doença metabólica crônica, caracterizada por um acúmulo excessivo de tecido adiposo em relação à massa magra. Atualmente, é uma epidemia global e um importante problema de saúde pública, que afeta tanto os países desenvolvidos quanto os em desenvolvimento^{1 , 2}. Comportamentos associados a uma sociedade industrializada moderna, incluindo um estilo de vida sedentário, hábitos alimentares inadequados ou uma combinação de ambos, levaram a um aumento da prevalência da obesidade³.

A obesidade também é considerada um fator de risco para muitas complicações médicas, entre elas as doenças cardiovasculares^{4 , 5}. Alterações hemodinâmicas associadas a alterações hormonais alteram a expressão gênica do miocárdio, promovendo o remodelamento da matriz extracelular miocárdica⁶. Estudos usando coelhos tornados obesos tanto através de uma dieta rica em gordura⁷ ou através de engenharia genética, ratos Zucker⁸, relataram um aumento no colágeno miocárdico tipo I e III ao longo de 12 e 24 semanas, respectivamente. Em contraste, Carroll e cols.⁹ não encontraram nenhuma mudança na fração de colágeno total em ratos obesos submetidos a uma dieta rica em gordura durante 12 semanas. Estudos anteriores realizados em nosso laboratório demonstraram que ratos Wistar tornados obesos por uma dieta de 15 semanas rica em gordura¹⁰ e ratos Wistar- Kyoto tornados obesos por uma dieta de 20 semanas com alto teor de gordura e carboidratos¹¹ mostraram aumento de colágeno total miocárdico. Nesses estudos, no entanto, as frações de colágeno tipos I e II não foram avaliadas.

A pesquisa médica demonstrou que anormalidades hemodinâmicas, morfológicas e funcionais estão correlacionadas com a duração e a gravidade da obesidade^{12 - 14}. Por causa da escassez de estudos que avaliaram o efeito do tempo de exposição à obesidade induzida por dieta rica em gordura nas frações de colágeno tipo I e III miocárdico, o presente estudo foi planejado para testar a hipótese de que o tempo de exposição à obesidade promove um aumento progressivo da quantidade de colágeno tipo I e tipo III miocárdico.

Métodos

Animais e Protocolo Experimental

Depois de um período de 7 dias para aclimatação, ratos machos de 30 dias de idade da raça Wistar foram divididos aleatoriamente em dois grupos: controle (C) e obeso (Ob). O grupo C foi alimentado com uma ração padrão (RC Focus 1765, Agroceres^®, Rio Claro, SP, Brasil), contendo 12,3% de quilocalorias de gordura, 57,9% de carboidratos e 29,8% de proteína, enquanto o grupo Ob foi alimentado com uma de quatro dietas alternadas, ricas em gordura (RC Focus 2413, 2414, 2415 e 2416, Agroceres ^®, Rio Claro, SP, Brasil), contendo 49,2% de quilocalorias de gordura, 28,9% de carboidratos e 21,9 % de proteína. Cada dieta foi mudada diariamente, e os ratos foram mantidos em suas respectivas dietas por 15 (Ob₁₅ e C₁₅, n = 22) e 30 (C₃₀ e Ob₃₀, n = 25) semanas consecutivas. A dieta rica em gorduras foi caloricamente mais rica em comparação com a dieta padrão (3,65 kcal/g vs. 2,95 kcal/g) devido à composição mais elevada de gordura. A dieta rica em gorduras consistiu em ácidos graxos saturados e insaturados, que proporcionava 20% e 80% das calorias derivadas da gordura, respectivamente.

Os ratos foram alojados em gaiolas individuais em uma sala com ar limpo em ambiente controlado a 23 (± 3)ºC com ciclo de 12 horas de luz/escuridão e 60 (± 5)% de umidade relativa. Todos os experimentos e os procedimentos foram realizados de acordo com o Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório, publicado pelo Conselho Nacional de Pesquisa (1996) e foram aprovados pelo Comitê de Ética da Faculdade de Medicina de Botucatu (UNESP, Botucatu, SP, Brasil).

Perfis nutricionais, metabólicos e endócrinos

Os perfis nutricionais e metabólicos incluíram o índice de adiposidade, peso corporal final (PCF) e tolerância à glicose; os perfis endócrinos incluíram as concentrações de leptina e insulina. Como a obesidade é definida como uma quantidade excessiva de gordura corporal em relação à massa magra¹⁵ foi utilizado um critério baseado no índice de adiposidade para determinar a obesidade, de acordo com dados de estudos anteriores^{9 , 16}.

Após um jejum de 12 a 15 horas, os animais foram anestesiados (por via intraperitoneal com pentobarbital de sódio 50 mg/kg), decapitados, e toracotomizados; as depósitos de gordura de tecido adiposo foram dissecadas e pesadas. O índice de adiposidade foi calculado pela seguinte fórmula: índice de adiposidade = (gordura corporal [GC]/PCF) × 100¹⁷. A gordura corporal foi calculada como a soma do peso das depósitos de gordura individuais, conforme indicado a seguir: GC = gordura epididimal + gordura retroperitoneal + gordura visceral.

Como a obesidade pode ser acompanhada por alterações metabólicas e endócrinas¹⁸, todos os animais foram submetidos a testes de tolerância à glicose, leptinemia e hiperinsulinemia. Depois de 15 e 30 semanas de tratamento, a tolerância à glicose e a resistência à insulina foram avaliadas em todos os animais com um teste de tolerância à glicose (TTG). Após 4 a 6 horas de jejum, uma amostra de sangue foi tirada a partir da ponta da cauda do animal e coletada em um tubo heparinizado. A concentração da glicose no sangue (como a condição basal) de cada animal foi imediatamente determinada usando um glicosímetro portátil (Accuchek Advantage; Roche Diagnostics Co., Indianapolis, IN, EUA). Subsequentemente, 2 g/kg de glicose (Sigma-Aldrich^®, St. Louis, MO, EUA) foi administrada por via intravenosa, e as concentrações de glicose no sangue foram medidas após 15, 30, 60, 90, e 120 minutos¹⁹. A intolerância à glicose foi avaliada utilizando a área sob a curva (AUC) para a glicose.

Para análises hormonais, o sangue do tronco foi recolhido em tubos heparinizados e centrifugado a 3000 g por 15 minutos a 4ºC. As concentrações séricas de leptina e insulina foram determinadas por ensaio imunoenzimático (ELISA), utilizando kits disponíveis comercialmente (Linco Research Inc., St. Louis, MO, EUA).

Perfil cardiovascular

Como a obesidade pode estar associada à comorbidades cardiovasculares, o perfil cardiovascular dos animais também foi avaliado, usando a pressão arterial sistólica, morfologia do tecido cardíaco e a expressão da proteína do colágeno tipo I e III do ventrículo esquerdo.

Pressão arterial sistólica

Ao final da experiência, a pressão arterial sistólica foi avaliada usando o método não invasivo de manguito de cauda, com um eletro-esfigmomanômetro Narco BioSystems^® (International Biomédica, Austin, TX, EUA) ²⁰. A média de duas leituras foi registrada para cada medição.

Estudos morfológicos

O coração foi removido e dissecado no momento da eutanásia. Os pesos do ventrículo esquerdo, bem como suas respectivas razões com a tíbia foram determinados como índice de remodelamento cardíaco.

Expressão da proteína do colágeno miocárdico tipo I e III

O tecido ventricular esquerdo foi analisado por Western Blot⁷ para quantificar a expressão da proteína do colágeno tipo I e III. Resumidamente, os ventrículos isolados dos ratos controle (C₁₅ e C₃₀, n = 6 em cada grupo) e obesos (Ob₁₅ e Ob₃₀, n = 6 em cada grupo) foram congelados com nitrogênio líquido e homogeneizados em um buffer contendo 10 mM Tris (pH 7,4), 100 mM de NaCl, 1 mM de EDTA , 1 mM de EGTA, 1% de Triton X -100, glicerol a 10%, dodecilsulfato de sódio (SDS) a 0,1% e 0,5% de desoxicolato. O homogeneizado foi centrifugado a 4ºC por 20 minutos a 12000 rpm. O sobrenadante foi recolhido e o conteúdo total de proteína foi determinado pelo método de Bradford (Bradford, 1976). As amostras foram submetidas a eletroforese em gel de poliacrilamida-SDS (SDS-PAGE) em géis de poliacrilamida (6% ou 10%, dependendo do peso molecular de proteína). Após a eletroforese, as proteínas foram eletro-transferidas para a membrana de nitrocelulose (BioRad Biosciences; NJ, USC ). Os pesos das amostras (50 ug) e as transferências foram monitorados em relação à igualdade e eficiência, respectivamente, com a utilização de 0,5% de corante de Ponceau S na membrana de blot. A membrana de blot foi então bloqueada (usando 5% de leite em pó desnatado, 10 mmol/L Tris-HCl [pH 7,6], 150 mmol/L de NaCl, e 0,1% de Tween 20) por 2 horas à temperatura ambiente e incubada durante a noite com anticorpos específicos a 4ºC. A ligação do anticorpo primário foi detectado com a utilização de anticorpos secundários conjugados com peroxidase (anti-coelho ou anti-camundongo, dependendo da proteína a uma diluição de 1:10000 e incubados por 1,5 horas à temperatura ambiente), desenvolvidos por quimiluminescência aumentada (Amersham Biosciences, NJ, EUA) e detectados por autorradiografia. A análise de quantificação dos blots foi realizada com a utilização do software Scion Image (Scion, com base em imagem NIH). Anticorpos monoclonais de camundongos para colágeno tipo I e III (1:10000) e anticorpos monoclonais de camundongos para β-actina (1:1000) foram obtidos de Abcam (Reino Unido, Cambridge) e Santa Cruz Biotechnology (CA, EUA), respectivamente. Bandas alvo foram normalizadas para a expressão da β-actina cardíaca.

A análise estatística

Todos os resultados foram apresentados como média ± desvio padrão e os grupos foram avaliados através da análise de variância (ANOVA) de dois fatores para amostras independentes. Quando encontradas diferenças significativas (p < 0,05), foi realizado o teste de Bonferroni post hoc para comparações múltiplas²¹. O nível de significância foi de 5% (α = 0,05).

Resultados

A Figura 1 mostra as características gerais dos animais nos grupos C₁₅, C₃₀, Ob₁₅ e Ob₃₀. A dieta de alto teor de gordura causou um aumento no PCF e no índice de adiposidade em animais obesos em comparação com os respectivos controles em todos os tempos avaliados. A duração da exposição à obesidade não resultou em uma diferença significativa no PCF e índice de adiposidade entre os grupos C₁₅ e C₃₀ e entre os grupos Ob₁₅ e Ob₃₀. Não houve diferença na pressão arterial sistólica entre os grupos C e Ob nos dois períodos de estudo, e isso também não se alterou com o tempo de exposição à obesidade. A AUC para a glicose foi maior nos grupos Ob em comparação com os controles; o tempo de exposição não afetou os níveis de glicose. A obesidade promoveu um aumento nos níveis de insulina e leptina nos grupos Ob em relação aos respectivos controles. Os níveis de insulina não se alteraram com o tempo de exposição à obesidade; o nível de leptina foi maior no grupo Ob₃₀ em comparação com os grupos Ob₁₅.

Figura 1
Peso corporal final (A), índice de adiposidade (B), leptina (C), insulina (D), área sob a curva (AUC) do teste de tolerância à glicose intraperitoneal (E), pressão arterial sistólica (PAS) (F) em ratos controle (barras brancas) e obesos (barras pretas) após 15 e 30 semanas de tratamento. Os dados são apresentados em média ± DP, teste de Bonferroni post hoc e ANOVA de 2 fatores. *p < 0,05 vs. grupo controle; # p < 0,05 Ob₁₅ vs Ob₃₀.

Como mostrado na Figura 2, a presença de obesidade aumentou o peso do ventrículo esquerdo, assim como a razão VE/comprimento da tíbia no grupo Ob₁₅, em comparação com o grupo C₁₅. No entanto, a razão VE/comprimento da tíbia foi semelhante nos grupos Ob₃₀ e C₃₀, sugerindo que a exposição à obesidade não têm qualquer efeito sobre esta variável.

Figura 2
Dimensões do ventrículo esquerdo. Peso do ventrículo esquerdo (VE) (A), e razão peso do ventrículo esquerdo/tíbia (B) nos ratos controle (barras brancas) e obesos (barras pretas) após 15 e 30 semanas de tratamento. Os dados são apresentados em média ± DP, teste de Bonferroni post hoc e ANOVA de 2 fatores. *p < 0,05 vs. grupo de controle.

Não houve diferença na expressão do colágeno miocárdico tipo I entre os grupos Ob₁₅ e C₁₅ (Figura 3); no entanto, a expressão da proteína foi menor no grupo Ob₃₀ comparada com o grupo C₃₀. O tempo de exposição a obesidade também resultou em uma redução da expressão do colágeno tipo I no grupo Ob₃₀ em comparação com o grupo Ob₁₅. A obesidade não alterou a expressão do colágeno tipo III, e o tempo de exposição à obesidade não influenciou a expressão desse colágeno.

Figura 3
Análise Western blot do colágeno tipo I e III no coração de ratos controle (barras brancas) e obesos (barras pretas) após 15 e 30 semanas de tratamento. Blots foram escaneados. Apresentação histográfica das razões colágeno I/β-actina (A) e colágeno III/β-actina. (B) Dados são apresentados em médias ± DP de seis animais diferentes por grupo; ANOVA de 2 fatores e teste de Bonferroni post hoc. *p < 0,05 vs. Grupo controle; # p < 0,05 Ob₁₅ vs Ob₃₀

Discussão

O principal achado desse estudo foi que o tempo de exposição à obesidade induzida por uma dieta rica em gordura insaturada afetou a expressão do colágeno tipo I no miocárdio, mas não teve efeito sobre o colágeno miocárdico tipo III. A obesidade induzida experimentalmente pela dieta é a que mais se assemelha à obesidade encontrada na população humana, e tem sido frequentemente utilizada para reproduzir as possíveis alterações morfológicas, moleculares, bioquímicas e funcionais em diferentes órgãos do corpo humano^{9 , 16 , 22}.

A dieta de alto teor calórico usada nessa experiência continha uma quantidade suficiente de calorias e sua duração foi suficiente para promover a obesidade em ratos; isso provavelmente ocorreu devido ao alto teor de gorduras insaturadas da dieta, que contêm uma densidade energética mais elevada e uma maior capacidade de armazenagem no corpo.

Esse estudo mostrou que o peso corporal final e o índice de adiposidade de animais obesos estavam aumentados em comparação com os respectivos controles em todos os momentos avaliados, e esses dados são consistentes com a literatura²². No entanto, o tempo de exposição à dieta não alterou essas duas variáveis, que foram semelhantes nos dois períodos de tempo estudados - 15 e 30 semanas.

A carga de glicose nos grupos obesos resultou em intolerância à glicose durante os dois períodos de tratamento, 15 e 30 semanas. Outro aspecto importante é que o tempo de exposição à obesidade não influenciou o perfil da glicemia entre os animais obesos, pois a intolerância à glicose vista nas primeiras 15 semanas manteve-se estável até a 30ª semana do protocolo experimental. A diminuição da tolerância à glicose, uma fase intermediária entre a homeostase normal da glicose e diabetes mellitus²³ tipo 2 pode estar relacionada com o desenvolvimento de resistência à insulina nos animais obesos. Em apoio a essa hipótese, os nossos dados mostram que a obesidade levou à hiperinsulinemia em ambas as avaliações. Os resultados desse estudo estão de acordo com os autores que observaram que a obesidade induzida por uma dieta rica em gordura insaturada promove a intolerância à glicose, hiperinsulinemia e resistência à insulina em um curto período de tempo^{24 - 27} e que esses efeitos são prolongados²⁸.

Um aumento das concentrações séricas de leptina após 15 e 30 semanas foi observado em animais obesos em comparação com os respectivos controles. O tempo de exposição à obesidade influenciou o nível desse hormônio, com aumentos observados a partir de 15 semanas. As concentrações de leptina estão correlacionadas com a gordura corporal, influenciando tanto a lipogênese quanto a lipólise²⁹. Nesse estudo, embora o índice de adiposidade permanecesse o mesmo nos grupos Ob₁₅ e Ob₃₀, as concentrações de leptina foram mais elevadas no grupo Ob₃₀ comparado com o Ob₁₅. Esse fato provavelmente ocorreu devido ao surgimento da resistência à ação desse hormônio após a 30ª semana. Outros estudos têm mostrado que longos períodos de obesidade promovem a resistência à leptina, o que consequentemente conduz ao aumento desse hormônio^{14 , 24 , 30}.

Embora o aumento no tecido adiposo tenha levado a alterações metabólicas e hormonais, a obesidade não resultou em aumento na pressão arterial após 15 e 30 semanas, que se manteve estável durante os dois períodos de estudo. Os mecanismos responsáveis pela alteração da pressão arterial incluem a hiperatividade do sistema nervoso simpático³¹, aumento da atividade do sistema renina-angiotensina-aldosterona (RAAS)^{16 , 32 , 33} e estresse oxidativo³¹, que pode resultar em vasoconstrição periférica e aumento da reabsorção renal de sódio. A ausência de efeito sobre a pressão arterial sugere que a obesidade não altera os fatores envolvidos no controle da pressão arterial. Esses resultados estão de acordo com alguns autores que não observaram alterações na pressão arterial em animais obesos⁹; mas diferem dos estudos que mostraram níveis elevados da mesma^{32 - 34}. No entanto, apesar de a obesidade não ter alterado a pressão arterial, houve uma ligeira remodelação do ventrículo esquerdo, provavelmente devido a um aumento dos fatores neuro-hormonais mencionados acima.

O achado mais importante desse estudo foi que o tempo de exposição à obesidade provocou uma redução na expressão do colágeno miocárdico tipo I no grupo Ob₃₀ comparado com o grupo Ob₁₅ e, em contraste, não alterou a expressão do colágeno miocárdio tipo III. Não encontramos estudos que tenham investigado a associação entre a duração da obesidade e a expressão do colágeno miocárdico tipo I e III. O(s) mecanismo(s) responsável(eis) pela diminuição da expressão do colágeno tipo I permanecem obscuros. Uma possível explicação para essa redução pode ser a diminuição da síntese e/ou um aumento da degradação do colágeno. O tecido adiposo secreta várias substâncias que estão envolvidas na regulação do colágeno miocárdico, incluindo o hormônio leptina, que é produzido principalmente nos adipócitos e também é sintetizado por vários tecidos, incluindo o coração³⁵. Os efeitos da leptina no coração não foram completamente elucidados, mas acredita-se que influenciam a hipertrofia de cardiomiócitos e a regulação da produção de vários componentes da matriz extracelular do miocárdio que agem sobre os fibroblastos cardíacos³⁵. Embora haja controvérsia sobre a associação entre a leptina e o colágeno miocárdico tipo I tais como o aumento da expressão de procolágeno^{35 - 37} e a diminuição da síntese³⁸, há um consenso entre os autores de que a leptina aumenta a atividade das metaloproteinases (MMP) 2^{35 - 38} e a expressão do mRNA do MMP-9^{39 , 40}, participantes da degradação do colágeno do tipo I. Portanto, é possível que o aumento da atividade tanto de MMP -2 e MMP-9 seja responsável pela redução do colágeno tipo I no miocárdio. Como referido acima, o colágeno miocárdico tipo III não se alterou na obesidade. Nenhuma informação foi encontrada na literatura como uma possível explicação para esse achado.

É importante mencionar que o nosso achado pode ter relevância clínica, uma vez que demonstra que a obesidade de longa duração, comum em pacientes, não acompanhada de hipertensão arterial, pode causar uma diminuição na complacência ventricular devido à redução do colágeno tipo I. Esse fenômeno pode resultar em uma melhor adaptação do coração à obesidade, devido ao fato dessa patologia estar associada ao aumento do volume de sangue.

Como conclusão, o presente estudo mostra que o tempo de exposição à obesidade induzida por uma dieta rica em gordura insaturada provoca uma redução na expressão do colágeno miocárdico tipo I após 30 semanas, mas não se verificaram alterações no colágeno miocárdico tipo III. Estudos futuros são necessários para determinar o mecanismo responsável pela diminuição do colágeno miocárdico tipo I e a ausência de efeito sobre o colágeno tipo III.

Fontes de Financiamento

FAPESP - processo nº 07/53267-3 e 08/50172-4.

Contribuição dos autores

Concepção e desenho da pesquisa: da Silva DCT, Padovani CR, Cicogna AC; Obtenção de dados: da Silva DCT, Lima-Leopoldo AP, Leopoldo AS, de Campos DHS; Análise e interpretação dos dados: da Silva DCT, Lima-Leopoldo AP, Leopoldo AS, de Campos DHS, Nascimento AF, Oliveira Junior SA, Padovani CR, Cicogna AC; Análise estatística: da Silva DCT, Padovani CR; Obtenção de financiamento: Cicogna AC; Redação do manuscrito: da Silva DCT; Revisão crítica do manuscrito quanto ao conteúdo intelectual: da Silva DCT, Lima-Leopoldo AP, Nascimento AF, Oliveira Junior SA, Cicogna AC.

Somos gratos a José C. Georgette, Mário B. Bruno, Sandra A. Fabio, Elenize J. Pereira, Sueli A. Clara, Vitor M. Souza, Camila RC Camacho e Corina J. Correa por seu auxílio técnico. Esse manuscrito foi revisado e editado por nativos da língua inglesa com experiência biomédica no BioMed Proofreading (Cleveland, Ohio, EUA).

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• Potencial Conflito de Interesses
  Declaro não haver conflito de interesses pertinentes.
• Fontes de Financiamento
  O presente estudo foi financiado pela FAPESP.
• Vinculação Acadêmica
  Não há vinculação deste estudo com dissertações e teses de pós-graduação.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  09 Nov 2013
• Data do Fascículo
  Mar 2014

Histórico

• Recebido
  02 Abr 2013
• Revisado
  21 Ago 2013
• Aceito
  22 Ago 2013