O consumo agudo de etanol induz a ativação da NAD(P)H oxidase e translocação da RhoA em artérias de resistência

Resumo

Fundamento:

O mecanismo da disfunção vascular induzido pelo consumo de etanol não é totalmente compreendido. Justifica-se, assim a identificação de mecanismos bioquímicos e moleculares que poderiam explicar tais efeitos.

Objetivos:

Investigar se a ingestão aguda de etanol ativa a via vascular RhoA/Rho quinase em artérias de resistência e o papel das espécies reativas de oxigênio (ERO) derivadas da NAD(P)H oxidase nessa resposta. Nós também avaliamos se ocorreu translocação da p47phox e ativação da NAD(P)H oxidase após o consumo agudo de etanol.

Métodos:

Ratos Wistar machos foram tratados com etanol via oral (1g/kg, p.o. gavagem) ou água (controle). Alguns ratos foram tratados com vitamina C (250 mg/kg, p.o. gavagem, 5 dias) antes de água ou etanol. O leito arterial mesentérico (LAM) foi coleado 30 min após a administração de etanol.

Resultados:

A vitamina C preveniu o aumento da geração de ânion superóxido (O₂ ^-) e lipoperoxidação no LAM induzidos pelo etanol. A atividade da catalase (CAT), da superóxido dismutase (SOD) e os níveis de glutationa reduzida(GSH), nitrato e peróxido de hidrogênio (H₂O₂) não foram afetados após a ingestão aguda de etanol. A vitamina C e o 4-metilpirazol preveniram o aumento na geração de O₂ ^- induzido pelo etanol em cultura de células do músculo liso vascular (CMLV). O etanol não afetou a fosforilação da proteína quinase B (Akt) e nem da óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) (nos resíduos de Ser¹¹⁷⁷ ou Thr⁴⁹⁵) ou a reatividade vascular do LAM. A vitamina C preveniu o aumento da razão membrana:citosol da p47phox e a expressão da RhoA no LAM de rato induzido pelo etanol.

Conclusão:

A ingestão aguda de etanol induz a ativação da via RhoA/Rho quinase por um mecanismo que envolve a geração de ERO. Nas artérias de resistência, o etanol ativa NAD(P)H oxidase induzindo a translocação da p47phox por um mecanismo redox-sensível.

Palavras-chave:
Etanol; NADPH Oxidase; Ratos; Estresse Oxidativo; Ácido Ascórbico; Proteína rhoA de Ligação do GTP

Abstract

Background:

The mechanism underlying the vascular dysfunction induced by ethanol is not totally understood. Identification of biochemical/molecular mechanisms that could explain such effects is warranted.

Objective:

To investigate whether acute ethanol intake activates the vascular RhoA/Rho kinase pathway in resistance arteries and the role of NAD(P)H oxidase-derived reactive oxygen species (ROS) on such response. We also evaluated the requirement of p47phox translocation for ethanol-induced NAD(P)H oxidase activation.

Methods:

Male Wistar rats were orally treated with ethanol (1g/kg, p.o. gavage) or water (control). Some rats were treated with vitamin C (250 mg/kg, p.o. gavage, 5 days) before administration of water or ethanol. The mesenteric arterial bed (MAB) was collected 30 min after ethanol administration.

Results:

Vitamin C prevented ethanol-induced increase in superoxide anion (O₂^-) generation and lipoperoxidation in the MAB. Catalase and superoxide dismutase activities and the reduced glutathione, nitrate and hydrogen peroxide (H₂O₂) levels were not affected by ethanol. Vitamin C and 4-methylpyrazole prevented the increase on O₂^- generation induced by ethanol in cultured MAB vascular smooth muscle cells. Ethanol had no effect on phosphorylation levels of protein kinase B (Akt) and eNOS (Ser¹¹⁷⁷ or Thr⁴⁹⁵ residues) or MAB vascular reactivity. Vitamin C prevented ethanol-induced increase in the membrane: cytosol fraction ratio of p47phox and RhoA expression in the rat MAB.

Conclusion:

Acute ethanol intake induces activation of the RhoA/Rho kinase pathway by a mechanism that involves ROS generation. In resistance arteries, ethanol activates NAD(P)H oxidase by inducing p47phox translocation by a redox-sensitive mechanism.

Keywords:
Ethanol; NADPH Oxidase; Rats; Oxidative Stress; Ascorbic Acid; rhoAGTP-Binding Protein

Introdução

O consumo excessivo de etanol, frequentemente referido na literatura como "binge drinking", é considerado um fator de risco para o sistema cardiovascular. Binge drinking está associado a um risco aumentado para eventos cardiovasculares, tais como aterosclerose, acidente vascular cerebral e infarto do miocárdio^1-3. O mecanismo exato que envolve a disfunção cardiovascular associada com o consumo excessivo de álcool não foi totalmente elucidado, mas alterações da função vascular parecem exercer um papel fundamental^4-6.

Um mecanismo importante pelo qual o etanol causa danos vasculares é pelo aumento da geração de espécies reativas de oxigênio (ERO). A formação de ânion superóxido (O₂^-) e peróxido de hidrogênio (H₂O₂) está associada à disfunção vascular.^7,8 A enzima nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato, [NAD(P)H] oxidase, é a principal fonte de ERO nas células endoteliais e nas células do músculo liso vascular (CMLV)⁹, sendo um fator essencial na disfunção vascular induzida por etanol¹⁰. A ativação da [NAD(P)H] oxidase é um processo complexo, mas a translocação da subunidade p47phox para a membrana, com posterior associação com o citocromo b₅₅₈, é uma etapa decisiva para a ativação da enzima.¹¹ Achados recentes do nosso laboratório mostraram que a ingestão aguda de etanol aumenta a geração de ERO derivados da NADPH oxidase em artérias de resistência.¹²

ERO influenciam na ativação de diversas vias de sinalização, incluindo as proteínas quinases ativadas por mitógenos (MAPK) e a RhoA/Rho quinase, consideradas importantes mediadores de disfunção vascular. A ativação de vias redox-sensíveis regula o crescimento de células vasculares, a inflamação e a contração¹³. Um dado importante é que a ingestão aguda de etanol induz a ativação da [NAD(P)H] oxidase e a fosforilação de MAPK em artérias de resistência¹². Além disso, o O₂^- é responsável pela rápida inativação do óxido nítrico (NO)¹⁴ e, alterações na síntese e/ou biodisponibilidade do NO estão envolvidas no desenvolvimento de eventos vasculares clinicamente significantes.

No presente estudo, buscamos investigar se a ingestão aguda de etanol ativa a via da RhoA/Rho quinase em células vasculares de artérias de resistência, e o papel das ERO derivadas da [NAD(P)H] oxidase nessa resposta. Além disso, avaliamos a translocação da p47phox para a ativação da [NAD(P)H] oxidase induzida por etanol, e o efeito das ERO induzidas pelo etanol sobre a produção de NO. O ácido ascórbico (vitamina C) foi o antioxidante escolhido, uma vez que, segundo estudos anteriores^15,16, reduz o estresse oxidativo na vasculatura.

Métodos

Administração aguda de etanol

Dose de 1g/kg de etanol (10mL/kg de etanol a 13% diluído em água) foi administrado por gavagem a 20 ratos Wistar machos (200-250g) mantidos em jejum por 12 h.^12,16 Aplicando esse modelo de administração, os níveis sanguíneos de etanol mantêm-se no intervalo entre 20 e 24 mmoL/L^12,16,17. Ratos do grupo controle (n=20) receberam água (gavagem). Alguns animais foram tratados com vitamina C na dose de 250 mg/kg (gavagem) por 5 dias,^16,18,19 antes da administração de água (n=18) ou etanol (n=19). O tamanho da amostra foi baseado em estudos prévios.^12,16,17 O leito arterial mesentérico (LAM) foi isolado 30 min após a administração de etanol.¹⁷ Todos os experimentos estavam de acordo com os princípios e diretrizes do comitê de ética em uso de animais da Universidade de São Paulo (#10.1.235.53.0).

Detecção de O₂^- no LAM de rato

A produção de O₂^- no LAM de ratos foi medida pelo método da quimioluminescência da lucigenina, conforme descrito anteriormente.¹² A luminescência foi medida em um luminômetro (Orion II Luminometer, Berthold detection systems, Pforzheim, Germany), e os resultados expressos em unidades relativas de luz (URL) por mg de proteína. As concentrações de proteína nas amostras foram medidas pelo método de Lowry (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

Detecção de H₂O₂ no LAM de rato

Para medir a concentração de H₂O₂ no LAM de rato, foi utilizado o Amplex red^® (#A22188, Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), conforme descrito previamente.²⁰ Os resultados foram expressos em nmol por mg de proteína.

Detecção de nitrato basal no LAM de rato

A concentração basal de nitrato no sobrenadante do homogeneizado de LAM foi avaliado usando um analisador de óxido nítrico Sievers (NOA™ 280, Sievers Instruments, CO, USA), conforme descrito previamente.¹² Os resultados foram expressos em µmol/L por mg de proteína.

Avaliação das atividades da superóxido dismutase (SOD) e da catalase (CAT) em LAM de rato

A atividade da SOD no LAM de rato foi avaliada usando um kit disponível comercialmente (#19160, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA). A atividade da SOD foi expressa como taxa de inibição (%) / mg de proteína. A atividade da CAT foi determinada conforme descrito anteriormente.¹² Uma unidade de CAT foi definida como a quantidade de enzima necessária para decompor 1 µmol de H₂O₂/min.

Avaliação da concentração de glutationa reduzida (GSH) em LAM de rato

A concentração de GSH no LAM foi determinada conforme descrito anteriormente .¹² Os resultados foram expressos em µg GSH por mg de proteína.

Avaliação de espécies reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) em LAM de rato

A concentração de TBARS no LAM foi determinada utilizando-se um kit disponível comercialmente (#10009055, Cayman Chemical, Ann Arbor, MI, USA). Os resultados foram expressos em nmol por mg de proteína.

Immunoblotting

O LAM de rato foi homogeneizado em um tampão de lise composto por 50 mmol/L Tris-HCl (pH 7,4), NP-40 (1%), desoxicolato de sódio (0,5%) e SDS (0,1%). As amostras foram centrifugadas a 5000 × g por 10 min (4ºC). Quarenta microgramas de proteína foram separadas por eletroforese em um gel de poliacrilamida a 10%, e transferida para uma membrana de nitrocelulose. Leite desnatado (5%) diluído em solução salina tamponada (Tris) com Tween 20 foi usado para bloquear sítios de ligação não específicos (1 h a 24ºC). As membranas foram incubadas por uma noite a 4ºC com os seguintes anticorpos primários: p-eNOS (Ser¹¹⁷⁷) (diluído 1:1000, 9571, Cell Signaling, Danvers, MA, USA), p-eNOS (Thr⁴⁹⁵) (diluído 1:1000, 9574, Cell Signaling), eNOS total (diluído 1:1000, 9572, Cell Signaling), P- proteína quinase B (P-Akt) (Ser⁴⁷³) (diluído 1:1000, 4058, Cell Signaling) e Akt total (diluído 1:1000, 9272, Cell Signaling). Em seguida, as membranas foram incubadas com anticorpos secundários por 90 min à temperatura ambiente e os sinais foram revelados pela exposição das membranas à uma solução de quimioluminescência e quantificados densitometricamente. Os resultados foram expressos pela razão entre proteínas não fosforiladas / proteínas totais.

Fracionamento celular (membrana plasmática / citosol)

O LAM de rato foi homogeneizado em tampão de lise contendo Tris-HCl 50 mmol/L (pH 7,4), EDTA 2,5 mmol/L, EGTA 5 mmol/L, e inibidor de protease. Em seguida, centrifugado a 100 000 × g por 1 h, a 4ºC. O sobrenadante (fração citosólica) foi coletado. O pellet, contendo a fração com partículas, foi ressuspenso em tampão de lise contendo Triton X-100 1%, e centrifugado a 10 000 × g por 10 min a 4 ºC. As membranas foram então incubadas com anticorpos específicos para RhoA (diluído 1:1000, sc-418, Santa Cruz Biotechnology, Dallas, TX, USA) ou p47phox (diluído 1:500, Santa Cruz Biotechnology), como publicado anteriormente.²¹

Experimentos de reatividade vascular

Ratos machos Wistar foram anestesiados com uretana (1,25 g/kg, i.p., Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), e sacrificados por exsanguinação da aorta. Segmentos do terceiro ramo das artérias mesentéricas, medindo aproximadamente 2 mm de comprimento, foram colocados em um miógrafo para pequenos vasos (Danish Myo Tech, Model 620M, A/S, Århus, Denmark), conforme descrito previamente.²² As artérias foram mantidas em solução Krebs Henseleit [(em mmol/L) NaCl 130, KCl 4,7, KH₂PO₄ 1,18, MgSO₄ 1,17, NaHCO₃ 14,9, glicose 5,5, EDTA 0,03, CaCl₂ 1,6)], temperatura constante de 37°C, pH 7,4, e gaseificadas com uma mistura de O₂ 95% e CO₂ 5%. Curvas dose-resposta à fenilefrina (0,1 nmol/L-100 µmol/L) foram obtidas em artérias com endotélio intacto e na ausência de endotélio. As curvas para acetilcolina (0,1 nmol/L-10 µmol/L) foram obtidas nas artérias com endotélio intacto, pré-contraídas com fenilefrina (1 µmol/L). Curvas dose-resposta foram ajustadas com um programa não linear de ajuste de curvas (Graph Pad Prism 3.0; GraphPad Software Inc., San Diego, CA) e dois parâmetros farmacológicos foram analisados: pD₂ (logaritmo negativo da concentração molar da droga produzindo 50% da resposta máxima) e E_max (efeito máximo induzido pelo agonista).

Cultura de células e estimulação

CMLV derivadas do LAM de ratos machos foram isoladas e caracterizadas como descrito anteriormente.²³ Foram utilizadas células nas séries 4 a 8 isoladas de pelo menos 5 culturas diferentes de células primárias. As CMLV foram estimuladas com etanol (50 mmol/L, 5 min) na ausência e na presença de apocinina, um inibidor da NAD(P)H oxidase (10 µmol/L, 30 min), tiron (sequestrador de O₂^-, 10 µmol/L, 30 min), 4-metilpirazol (4-MP) (10 µmol/L, 30 min), um inibidor seletivo de álcool desidrogenase (ADH,) ou vitamina C (100 µmol/L, 24 h). A concentração e o período de exposição ao etanol e aos antioxidantes foram baseados em estudos prévios.^12,24 A produção de ânion superóxido foi medida por quimioluminescência dependente de lucigenina como descrito acima, e expressa em porcentagem de aumento dos valores basais.

Análise estatística

Os dados foram representados pela média ± erro padrão da média. A comparação entre os grupos foi realizada por análise de variância (ANOVA), seguida pelo teste de comparação múltipla de Bonferroni. Os dados apresentavam distribuição normal. Os resultados dos testes estatísticos com p<0,05 foram considerados significativos. As análises foram realizadas pelo programa Graph Pad Prism 3.0 (GraphPad Software Inc., San Diego, CA, USA).

Resultados

Níveis de etanol sanguíneo

Conforme descrito previamente,^12,16,17 neste modelo de administração de etanol, os níveis sanguíneos de etanol variam de 20 a 24 mmol/L, os quais encontram-se dentro dos valores encontrados na corrente sanguínea humana após um episódio de binge drinking.²⁵

Efeito da ingestão aguda de etanol sobre os níveis de O₂^-, H₂O₂, TBARS, nitrato, GSH e atividades da SOD e CAT no LAM de ratos

Para verificar o efeito da ingestão aguda de etanol sobre a geração de ERO e peroxidação lipídica no LAM de rato, foi avaliada a geração de O₂ ^- e H₂O₂, bem como a concentração de TBARS. A quimioluminescência dependente de lucigenina foi significativamente maior no LAM de ratos tratados com etanol, e o tratamento com vitamina C preveniu essa resposta (Figura 1A). Não foram observadas mudanças nos níveis de H₂O₂ após tratamento com etanol (Figura 1B). A vitamina C preveniu o aumento na concentração de TBARS induzido por ingestão aguda de etanol (Figura 1C). Uma vez que o estresse oxidativo está associado com menor biodisponibilidade de NO, nós avaliamos o efeito da ingestão aguda de etanol sobre a concentração de nitrato no LAM de rato. O tratamento com etanol não alterou os níveis basais de nitrato no LAM de rato (Figura 1D). Para avaliar o efeito do etanol sobre o estado antioxidante vascular, foram determinadas as atividades da SOD e CAT, bem como as concentrações de GSH no LAM de rato. Nossos resultados mostraram que a ingestão aguda de etanol não alterou as atividades da SOD e CAT (Figuras 2A e B), ou os níveis de GSH (Figura 2C).

Figura 1
Efeitos da ingestão aguda de etanol sobre os níveis de O₂^-, H₂O₂ e nitrato no leito arterial mesentérico de rato. Os níveis vasculares de O₂^- (A) e nitrato (D) foram determinados por quimioluminescência. Os níveis vasculares de H₂O₂ foram determinados por fluorimetria (B). Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) foram medidas por colorimetria (C). Os resultados foram apresentados em média ± erro padrão da média de 6-9 experimentos. *Em comparação aos grupos controle, controle + vitamina C e etanol + vitamina C (p<0,05, ANOVA).

Figura 2
Efeitos da ingestão aguda de etanol sobre as atividades das enzimas superóxido dismutase (SOD) e catalase (CTA) e os níveis de glutationa reduzida (GSH) no leito arterial mesentérico de rato. As atividades da SOD e CAT (A e B) e os níveis de GSH (C) foram determinados colorimetricamente. Os resultados foram apresentados em média ± erro padrão da média de 6-8 experimentos.

Efeito de etanol sobre a geração de O_2- na cultura de CMLV de LAM

O efeito antioxidante da vitamina C foi testado na cultura de CMLV derivadas do LAM. A vitamina C preveniu o aumento da geração de O₂^- induzida por etanol (50 mmol/L, 5 min) em cultura de CMLV. A fim de avaliar o papel de um metabólito de etanol sobre a geração de O₂- induzida por etanol, as células foram incubadas com 4-MP, um inibidor de ADH. 4-MP preveniu a geração de O₂^- induzida por etanol na cultura de CMLV (Figura 3).

Figura 3
Efeito do tiron, da apocinina, do 4-metilpirazol (4-MP) e da vitamina C sobre a geração de O₂^- induzida por etanol na cultura de células vasculares do músculo liso de células do leito arterial mesentérico de rato. As células foram estimuladas com etanol (50 mmol/L, 5 min) na ausência de inibidor ou após incubação com tiron (10 µmol/L, 30 min), apocinina (10 µmol/L, 30 min), 4-MP (10 µmol/L, 30 min) ou vitamina C (100 µmol/L, 24 h). As barras representam média ± erro padrão da média de 7-11 experimentos. *Comparado ao veículo (p<0.05, ANOVA).

Avaliação de fosforilação de Akt e eNOS no LAM de rato

Nossos resultados mostraram que não houve alteração na fosforilação da Akt no resíduo de Ser⁴⁷³ ou da eNOS nos resíduos de Ser¹¹⁷⁷ e Thr⁴⁹⁵ após ingestão aguda de etanol ou tratamento com vitamina C (Figura 4).

Figura 4
Efeitos da ingestão aguda de etanol sobre a fosforilação da proteína quinase B (Akt) e óxido nítrico sintase endotelial (eNOS) no leito arterial mesentérico de rato. Parte superior: resultados de western blotting para expressão e fosforilação de Akt e proteína eNOS. Parte inferior: gráficos de coluna correspondentes mostrando dados densitométricos para fosforilação da Akt no resíduo de Ser⁴⁷³ (A), eNOS no resíduo de Ser¹¹⁷⁷ (B), eNOS no resíduo de Tre⁴⁹⁵ (C). Os resultados foram apresentados em média ± erro padrão da média de 4-6 experimentos.

Avaliação da translocação da p47phox e RhoA em LAM de rato

Uma vez que a NAD(P)H oxidase é a principal fonte de ERO na vasculatura, e as ERO proveniente da NAD(P)H induzem a ativação da via de sinalização RhoA/Rho quinase, foi avaliado o efeito do etanol sobre a translocação da p47phox e RhoA. LAM de ratos tratados com etanol apresentaram um aumento significativo na expressão proteica da razão fração membrana/citosol da p47phox (Figura 5A) e na expressão proteica de RhoA (Figura 5B), indicando a translocação das proteínas. O tratamento com vitamina C preveniu o aumento da translocação da p47phox e da RhoA induzida pelo etanol.

Figura 5
Efeitos da ingestão aguda de etanol sobre a translocação da p47phox e RhoA no leito arterial mesentérico (LAM) de rato. O gráfico de barra representa a translocação da p47phox e RhoA como razão da expressão membrana/citosol (A e B) no LAM de rato. Parte superior: resultados de western blotting. Resultados são apresentados como média ± erro padrão da média de 5-7 experimentos. *em comparação aos grupos controle, controle + vitamina C e etanol + vitamina C (p<0,05, ANOVA).

Experimentos sobre a reatividade vascular da artéria mesentérica

O tratamento com etanol não afetou o relaxamento induzido por acetilcolina (E_max: 98,3 ± 1,5%; pD₂: 8,2 ± 0,2, n=6), quando comparado aos grupos controle (E_max: 100,3 ± 2,3%; pD₂: 8,1 ± 0,4, n=6), controle + vitamina C (E_max: 98,6 ± 1,8%; pD₂: 8,1 ± 0,2, n=4) e etanol + vitamina C (E_max: 99,8 ± 0,4%; pD₂: 7,8 ± 0,3, n=5). Nas artérias com endotélio intacto, a ingestão aguda de etanol não afetou a contração (% KCl 120 mmol/L) induzida por fenilefrina (E_max: 138,8 ± 10,4%; pD₂: 5,9 ± 0,3, n=5), em comparação aos grupos controle (E_max: 136,3 ± 10,3%; pD₂: 6,3 ± 0,2, n=4), controle + vitamina C (E_max: 112,9 ± 2,4%; pD₂: 6,3 ± 0,1, n=4) e etanol + vitamina C (E_max: 122,3 ± 7,7%; pD₂: 6,1 ± 0,1, n=6). O mesmo foi observado nas artérias sem endotélio, em que o tratamento com etanol não afetou a contração induzida por fenilefrina (E_max: 135,1 ± 7,2%; pD₂: 6,1 ± 0,1, n=6), em comparação aos grupos controle (E_max: 120,7 ± 5,5%; pD₂: 6,1 ± 0,3, n=5), controle + vitamina C (E_max: 116,3 ± 3,5%; pD₂: 5,7 ± 0,1, n=4) e etanol+ vitamina ((Emax: 144.3 ± 10.4%; pD2: 6.1 ± 0.3, n=5).

Discussão

Os resultados presentes mostram que a ingestão aguda de etanol induz a translocação da RhoA e a ativação da NAD(P)H oxidase, pela translocação da p47phox em artérias de resistência. Apesar de aumentar a geração de ERO, a ingestão aguda de etanol não afeta a síntese ou a biodisponibilidade de NO nas artérias de resistência. A relevância de nossos achados ganha força ao considerarmos estudos prévios de nosso grupo de pesquisa^12,16,17 em que se demonstrou que, utilizando este mesmo modelo de administração de etanol, a concentração plasmática de etanol atingida é de 20-24 mmol/L, a qual corresponde à encontrada em humanos após consumo excessivo de álcool,²⁵ ou em ratos após 30 min de administração oral de etanol.²⁶

Nossos resultados demonstraram que o etanol aumentou a geração de O₂^- no LAM de rato, o que está de acordo com resultados prévios de nosso laboratório.¹²

Além disso, observou-se um aumento da peroxidação lipídica no LAM de rato após ingestão de álcool. O teste de quimioluminescência dependente de lucigenina baseia-se na ação enzimática da enzima NAD(P)H oxidase.²⁷ Nesse sentido, o aumento na quimioluminescência descrito neste estudo sugere que a enzima NAD(P)H oxidase seja uma importante fonte de geração de O₂^- induzida pelo etanol nas artérias de resistência. Esta ideia é corroborada pelo fato de que a apocinina inibiu a geração de O₂^- na cultura de CMLV. A vitamina C é um eficaz agente sequestrador de O₂,²⁸ e, em nosso modelo, ela diminuiu a geração de O₂^- e a peroxidação lipídica em artérias de resistência. A propriedade antioxidante da vitamina C também está associada à menor ativação de NAD(P)H oxidase.¹⁵

Em culturas de células CMLV, a vitamina C preveniu a geração de O₂^- induzida pelo etanol, sugerindo que a inibição da NAD(P)H oxidase pela vitamina C também pode estar envolvida na diminuição da geração vascular de O_2- induzida pelo etanol.

ADH é uma enzima que atua na metabolização do etanol, e é funcionalmente ativa na vasculatura.²⁹ Foi descrito anteriormente que metabólitos do etanol estão envolvidos nos efeitos vasculares estimulados pelo etanol.³⁰ Para determinar um possível papel dos metabólitos do etanol sobre a geração de O₂^- induzido por etanol em artérias de resistência, foi avaliado o efeito do 4-MP nesse processo. A inibição do metabolismo do etanol mediado pela ADH levou à diminuição da geração de O_2- induzida pelo etanol na cultura de CMLV. Assim, apresentamos uma evidência de que um metabólito de etanol, possivelmente o acetaldeído, é responsável pela geração de ERO em artérias de resistência.

A NAD(P)H oxidase é a principal fonte de ERO na vasculatura. A prototípica, Nox fagocítica é composta por cinco subunidades - três subunidades citosólicas, p40phox, p47phox e p67phox, e dois componentes associados à membrana, denominados gp91phox (Nox2) e p22phox. O complexo enzimático encontra-se dissociado nas células de repouso, mas é rapidamente ativado à estimulação celular. A fosforilação da p47phox em um resíduo de serina inicia a ativação da enzima, desencadeando a formação de um complexo composto por subunidades citosólicas. Essa resposta é seguida pela translocação do complexo citosólico à membrana, e associação com as subunidades gp91phox e p22phox (citocromo b₅₅₈). Os componentes da NAD(P)H oxidase são expressos em células endoteliais e CMLV, e a translocação da subunidade p47phox mostrou-se essencial para a produção de ERO nessa células.³¹ Em nosso estudo, foi observado o aumento da translocação da p47phox em LAM de ratos tratados com etanol, e tal efeito foi inibido pela vitamina C, sugerindo que o estresse oxidativo esteja envolvido na translocação da p47phox induzida pelo etanol e na ativação da NAD(P)H oxidase. Além disso, essa resposta reforça nossa ideia inicial de que a NAD(P)H oxidase esteja envolvida na geração de O₂- induzida pelo etanol no LAM de rato. A ação inibitória da vitamina C sobre a translocação da p47phox foi previamente descrita.³² Os mecanismos pelos quais a vitamina C inibe a translocação da p47phox não foram totalmente elucidados, mas parecem envolver a inibição dos ativadores da enzima NAD(P)H oxidase. Um grande número de proteínas está envolvido no complexo NAD(P)H oxidase, que inclui Rac GTPases, proteína quinase C (PKC) e c-Src.¹¹ Papparella et al.³² demonstraram que a vitamina C inibiu a ativação da PKC com subsequente redução na translocação da p47phox e geração de ERO. O presente estudo não abordou o mecanismo exato pelo qual o etanol modula a atividade da NAD(P)H oxidase. Diferentes estímulos, tais como endotelina-1, angiotensina II, catecolaminas, trombina e fatores de crescimento (p.ex.: fator de crescimento epidérmico e fator de crescimento derivado de plaquetas) promovem ativação aguda da NAD(P)H oxidase na vasculatura.³³ Nós demonstramos anteriormente que o losartan, um antagonista de receptores AT₁, não impediu a geração de ERO induzida por etanol em LAM de rato,¹² descartando um possível papel da angiotensina II na ativação da NAD(P)H aqui descrita. Seria interessante outros estudos que avaliem a maneira exata que ingestão aguda de etanol induz a translocação de p47phox e a geração de ERO nas artérias de resistência.

Figura 6
Efeitos da ingestão aguda de etanol sobre a reatividade vascular à acetilcolina e fenilefrina. Curvas dose-resposta para acetilcolina foram obtidas no terceiro ramo das artérias mesentéricas com endotélio intacto (A). Curvas dose-resposta para fenilefrina foram obtidas nas artérias com endotélio (Endo+, B) e sem endotélio (Endo-,C). Resultados são apresentados como média ± erro padrão da média de 4-6 experimentos.

O ânion superóxido é uma molécula altamente instável, reduzida à H₂O₂ pela SOD³⁴. Em nosso estudo, a ação antioxidante da vitamina C não estava relacionada com aumento da ativação da SOD, uma vez que não foi observada diferença na atividade da SOD no LAM após o tratamento com a vitamina. Além disso, uma vez que o tratamento com etanol não alterou a atividade da SOD, o aumento nos níveis de O₂^- induzido pelo etanol parece não estar relacionado com a redução da dismutação do O₂^- pela SOD. Tanto o O₂^- como o H₂O₂ atuam como moléculas de sinalização, sendo o H₂O₂ considerado o principal composto de sinalização, dado sua relativa estabilidade e localização subcelular ³⁴. Por exemplo, o H₂O₂ ativa vias sensíveis à sinalização redox, tais como MAPK e Rho kinase³⁵. H₂O₂ é intimamente regulado por enzimas intracelulares e extracelulares, incluindo CAT, que converte H₂O₂ em água e O₂. Nossos resultados mostraram que a ingestão aguda de etanol não alterou os níveis de H₂O₂ ou a atividade da CAT no LAM de rato.

A disfunção endotelial é causada por um aumento na geração de ERO e redução na biodisponibilidade de NO, aumentando a inativação oxidativa do NO e/ou diminuindo sua síntese. No endotélio vascular, o NO é sintetizado pela eNOS. A Akt, uma proteína quinase serina/treonina, fosforila a eNOS, promovendo a ativação da enzima.³⁶ A fosforilação da eNOS no resíduo de Ser¹⁷⁷ é um requisito crucial para a ativação da eNOS, enquanto que a fosforilação no resíduo Tre⁴⁹⁵ leva à inativação da enzima.³⁶ Neste trabalho, demonstramos que o etanol não teve efeito sobre a fosforilação Akt/NOS, o que corroborou a observação de que a concentração de nitrato no LAM de rato não foi afetada pelo etanol. O etanol induz um aumento transitório na atividade da SOD e CAT, e tal resposta pode mudar o equilíbrio entre EROs e NO em direção aos níveis de NO.³⁷ Nesse sentido, o aumento induzido por etanol nas defesas antioxidantes poderia explicar a ausência de efeito do etanol sobre os níveis de NO no LAM de rato.

As ERO derivadas da NAD(P)H oxidase na vasculatura ativam alvos redox-sensíveis tais como RhoA/Rho quinase. O ânion superóxido e H₂O₂ ativam a via RhoA/Rho quinase, que representa uma importante classe de moléculas sinalizadoras reguladas pelo estado redox no sistema cardiovascular.¹³ A via RhoA/Rho quinase regula muitas vias de sinalização intracelulares na vasculatura. A proteína Rho permanece em um ciclo entre sua forma inativa ligada ao GDP no citoplasma, e sua forma ativa ligada ao GTP na membrana celular,³⁸ e a translocação de RhoA para a membrana está associada com sua ativação. Os presentes achados mostraram que a ingestão de etanol aumentou a translocação de RhoA, o que sugere uma ativação da via RhoA/Rho quinase. Além do fato de a vitamina C ter prevenido a translocação de RhoA induzida pelo etanol sugerimos que essa resposta seja mediada por ERO. Esse resultado vai ao encontro de resultados anteriores mostrando que as ERO, principalmente O₂ ^- e H₂O₂, estão ligados à ativação da via RhoA/Rho quinase.³⁹ Até nosso conhecimento, este é o primeiro estudo demonstrando uma interação direta entre ingestão de etanol, ERO derivadas de NAD(P)H oxidase, e a ativação da via de sinalização da RhoA/Rho quinase. A RhoA é abundantemente expressa nas CMLV e participa da vasoconstrição via fosforilação da cadeia leve de miosina e sensibilização das proteínas contráteis ao cálcio. Além disso, a ativação aumentada de RhoA foi associada à disfunção endotelial, resistência periférica aumentada e hipertensão.⁴⁰ Apesar da ativação da via de sinalização da RhoA/Rho quinase, a ingestão aguda de etanol não afetou a resposta contrátil induzida pela fenilefrina ou o relaxamento dependente do endotélio induzido por acetilcolina na artéria mesentérica. Esses resultados sugerem que a ativação da RhoA aqui descrita provavelmente ocorre antes do início das disfunções graves.

Algumas limitações do presente estudo devem ser consideradas. Em nosso estudo, todos os parâmetros foram avaliados quando o etanol atingiu sua concentração plasmática máxima. Não foi avaliado o período de ação do etanol na vasculatura após a administração de uma única dose. Portanto, seria interessante a realização de estudos sobre o efeito de uma única dose de etanol ao longo do tempo. Outro ponto a ser considerado é que enquanto binge drinking em humanos é amplamente definido como o consumo de uma grande quantidade de etanol (4-5 doses) em um período de duas horas, em nosso estudo, a quantidade total de etanol (1g/kg) foi administrada em uma única dose.

A ativação da NAD(P)H oxidase, com aumento subsequente na geração de ERO, e a ativação das vias de sinalização redox-sensíveis, tais como a via RhoA/Rho quinase, são eventos importantes ligados à disfunção vascular e, segundo estudos anteriores,^9,11,13 exercem um papel na fisiopatologia de várias doenças cardiovasculares. Binge drinking está associado a um risco aumentado de eventos cardiovasculares, tais como acidente vascular cerebral, morte súbita, infarto do miocárdio, maior mortalidade após infarto do miocárdio,^2-4 e a progressão de aterosclerose carotídea.¹ Importante mencionar que mudanças na biologia vascular são mecanismos chaves para o risco aumentado de eventos cardiovasculares induzidos pelo consumo de álcool excessivo.⁶ Assim, nossos resultados levantam a possibilidade de que não somente a ingestão crônica de etanol seja um fator de risco para eventos cardiovasculares, como a ingestão aguda de etanol também pode aumentar o risco de causar danos vasculares pelo aumento da geração de ERO e ativação de vias redox-sensíveis. Em geral, essas respostas desencadeadas pelo etanol poderiam predispor ao desenvolvimento de doenças cardiovasculares.

Conclusões

Em resumo, o principal achado inédito deste estudo é que a ingestão aguda de etanol induz a ativação da via RhoA/Rho quinase por um mecanismo que envolve a geração de ERO. Além disso, nós demonstramos, pela primeira vez, que o etanol ativa a NAD(P)H oxidase por estímulo da translocação da p47phox e por mecanismos redox-sensíveis em artérias de resistência.

• Fontes de financiamento
  O presente estudo foi financiado pela Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo.
• Vinculação acadêmica
  Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  27 Out 2016
• Data do Fascículo
  Nov 2016

Histórico

• Recebido
  29 Mar 2016
• Revisado
  12 Abr 2016
• Aceito
  24 Maio 2016