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Mutação em Hetrozigose Composta no Gene da Proteína C Ligante de Miosina e sua Expressão Fenotípica na Cardiomiopatia Hipertrófica

Resumo

A cardiomiopatia hipertrófica (CMH) é uma doença autossômica dominante causada por mutações em genes que codificam as proteínas dos sarcômeros. É a principal causa de morte súbita cardíaca em atletas jovens de alto nível. Estudos têm demonstrado um pior prognóstico associado a mutações específicas. A associação entre genótipo e fenótipo em CMH tem sido objeto de diversos estudos desde a descoberta da origem genética dessa doença.

Este trabalho apresenta o efeito de uma mutação composta em MYBPC3 na expressão fenotípica da CMH.

Uma família na qual um jovem tem o diagnóstico clínico de CMH foi submetida à investigação clínica e genética. As regiões codificadoras dos genes MYH7, MYBPC3 e TNNT2 foram sequenciadas e analisadas.

O probando apresenta uma manifestação maligna da doença e é o único em sua família a desenvolver CMH. A análise genética pelo sequenciamento direto dos três principais genes relacionados à essa doença identificou uma variante em heterozigose composta (p.E542Q e p.D610H) em MYBPC3. A análise da família mostrou que os alelos p.E542Q e p.D610H tem origem paterna e materna, respectivamente. Nenhum familiar portador de um dos alelos variantes manifestou sinais clínicos de CMH.

Sugerimos que a expressão heterozigótica bialélica de p.E542Q e p.D610H pode ser responsável pelo fenótipo severo da doença encontrada no probando.

Palavras-chave
Cardiomiopatia Hipertrófica; Genes Sarcoméricos; Mutação Composta; MYBPC3

Abstract

Hypertrophic cardiomyopathy (HCM) is an autosomal dominant genetic disease caused by mutations in genes encoding sarcomere proteins. It is the major cause of sudden cardiac death in young high-level athletes. Studies have demonstrated a poorer prognosis when associated with specific mutations. The association between HCM genotype and phenotype has been the subject of several studies since the discovery of the genetic nature of the disease.

This study shows the effect of a MYBPC3 compound variant on the phenotypic HCM expression.

A family in which a young man had a clinical diagnosis of HCM underwent clinical and genetic investigations. The coding regions of the MYH7, MYBPC3 and TNNT2 genes were sequenced and analyzed.

The proband present a malignant manifestation of the disease, and is the only one to express HCM in his family. The genetic analysis through direct sequencing of the three main genes related to this disease identified a compound heterozygous variant (p.E542Q and p.D610H) in MYBPC3. A family analysis indicated that the p.E542Q and p.D610H alleles have paternal and maternal origin, respectively. No family member carrier of one of the variant alleles manifested clinical signs of HCM.

We suggest that the MYBPC3-biallelic heterozygous expression of p.E542Q and p.D610H may cause the severe disease phenotype seen in the proband.

Keywords
Hypertrophic cardiomyopathy; sarcomere genes; compound variant; MYBPC3 gene

Introdução

A cardiomiopatia hipertrófica (CMH) é um transtorno miocárdico genético caracterizado por hipertrofia ventricular (HV), frequentemente assimétrica no septo interventricular e que pode levar a uma obstrução dinâmica da via de saída do ventrículo esquerdo (VE).11 Arola A, Jokinen E, Ruuskanen O, Saraste M, Pesonen E, Kuusela AL, et al. Epidemiology of idiopathic cardiomyopathies in children and adolescents. A nationwide study in Finland. Am J Epidemiol. 1997;146(5):385-93. É a principal causa de morte súbita cardíaca (MSC) em jovens, com uma mortalidade anual de 2-4% em adultos e 6% em adolescentes e crianças.22 Maron BJ, Olivotto I, Spirito P, Casey SA, Bellone P, Gohman TE, et al. Epidemiology of hypertrophic cardiomyopathy-related death: revisited in a large non-referral-based patient population. Circulation. 2000;102(8):858-64. Um resultado benigno da CMH também pode ocorrer, como início tardio, hipertrofia leve e histórico sem eventos malignos.33 Niimura H, Patton KK, McKenna WJ, Soults J, Maron BJ, Seidman JG, et al. Sarcomere protein gene mutations in hypertrophic cardiomyopathy of the elderly. Circulation. 2002;105(4):446-51. Genes modificadores, influências ambientais, diversidade de variantes genéticas e o efeito de múltiplas variantes poderiam explicar a grande heterogeneidade clínica entre indivíduos de uma mesma família ou de famílias diferentes.44 Richard P, Charron P, Carrier L, Ledeuil C, Cheav T, Pichereau C, et al; EUROGENE Heart Failure Project. Hypertrophic cardiomyopathy: distribution of disease genes, spectrum of mutations, and implications for a molecular diagnosis strategy. Circulation. 2003;107(17):2227-32. Erratum in: Circulation. 2004;109(25):3258.

A CMH é um distúrbio mendeliano relativamente comum (0,2%), causado principalmente por mutações nos genes das proteínas do sarcômero, mais comumente aqueles que codificam a cadeia pesada da β-miosina (MYH7), a proteína C ligante de miosina (MYBPC3) e a troponina T (TNNT2).55 Maron BJ, Ommen SR, Semsarian C, Spirito P, Olivotto I, Maron MS. Hypertrophic cardiomyopathy: present and future, with translation into contemporary cardiovascular medicine. J Am Coll Cardiol. 2014;64(1):83-99. Erratum in: J Am Coll Cardiol. 2014;64(11):1188 Estudos recentes sugerem que essa prevalência é ainda maior, em torno de 1: 200 na população em geral,66 Semsarian C, Ingles J, Maron MS, Maron BJ. New perspectives on the prevalence of hypertrophic cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol. 2015;65(12):1249-54. e cerca de 5% daqueles que têm CMH possuem mais de uma variante genética causadora da doença.77 Kelly M, Semsarian C. Multiple mutations in genetic cardiovascular disease: a marker of disease severity? Circ Cardiovasc Genet. 2009;2(2):182-90.

8 Van Driest SL, Vasile VC, Ommen SR, Will ML, Tajik AJ, Gersh BJ, et al. Myosin binding protein C mutations and compound heterozygosity in hypertrophic cardiomyopathy. J Am Coll Cardiol. 2004;44(9):1903-10.
-99 Ingles J, Doolan A, Chiu C, Seidman J, Seidman C, Semsarian C. Compound and double mutations in patients with hypertrophic cardiomyopathy: implications for genetic testing and counselling. J Med Genet. 2005;42(10):e59. A hipótese de efeitos da dosagem gênica em pacientes com múltiplas variantes é sustentada por alguns autores que relataram quadro clínico mais grave, com maior risco de MSC, maior hipertrofia do VE e início mais precoce da CMH.77 Kelly M, Semsarian C. Multiple mutations in genetic cardiovascular disease: a marker of disease severity? Circ Cardiovasc Genet. 2009;2(2):182-90.,1010 Wang J, Wang Y, Zou Y, Sun K, Wang Z, Ding H, et al. Malignant effects of multiple rare variants in sarcomere genes on the prognosis of patients with hypertrophic cardiomyopathy. Eur J Heart Fail. 2014;16(9):950-7.

Neste contexto, apresentamos aqui um caso no qual uma variante em heterozigose composta conduz à uma manifestação da CMH com exacerbação do fenótipo da doença.

Métodos

Amostra

O probando com diagnóstico clínico de CMH foi encaminhado para análise genética no Instituto Nacional de Cardiologia - INC, no Rio de Janeiro. Uma árvore genealógica, incluindo o maior número de gerações possíveis, foi construída com base em sua história familiar. Os membros da família foram submetidos a avaliações clínicas e investigações genéticas. O comitê de ética local aprovou este estudo. Obteve-se consentimento informado por escrito para cada membro avaliado da família.

Avaliação clínica

O probando foi submetido a exame clínico e cardiovascular, incluindo eletrocardiograma de 12 derivações (ECG), ecocardiograma transtorácico (ETT) e monitoramento de 24h por Holter. O diagnóstico de CMH foi baseado no ETT: os principais critérios diagnósticos do ecocardiograma foram definidos por uma espessura máxima diastólica final do VE ≥ 15 mm. O mesmo exame clínico foi realizado para as análises fenotípicas de todos os membros da família, e a ressonância magnética cardíaca (RMC) foi solicitada como exame complementar.

Foi utilizado um escore de risco proposto pela European Cardiac Society (ESC) para prever o risco de MSC em cinco anos para os pacientes com CMH.1111 O'Mahony C, Jichi F, Pavlou M, Monserrat L, Anastasakis A, Rapezzi C, et al; Hypertrophic Cardiomyopathy Outcomes Investigators. A novel clinical risk prediction model for sudden cardiac death in hypertrophic cardiomyopathy (CMH risk-SCD). Eur Heart J. 2014;35(30):2010-20.

Análise genética

Sequenciamento de Sanger

A análise genética do probando foi realizada através do sequenciamento direto de três genes do sarcômero: MYH7, MYBPC3 e TNNT2. O DNA genômico obtido de leucócitos, de acordo com Miller et al.,1212 Miller SA, Dykes DD, Polesky HF. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acids Res. 1988;16(3):1215. foi submetido à reação em cadeia da polimerase (PCR) de todos os exons codificadores, utilizando primers previamente descritos e outros projetados por nós (Tabelas 1, 2 e 3), e o mesmo programa de amplificação. Os produtos da PCR foram purificados com EXOSAP-IT (Affymetrix, Santa Clara, CA), submetidos à reação de sequenciamento utilizando o reagente BigDye® Terminator v3.1 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) e subsequentemente analisados em um analisador genético ABI 3500xL (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). As análises de sequências foram realizadas utilizando-se o pacote de software Geneious® v.6.1.6 (Biomatters, Auckland, NZ). A família foi submetida a um teste de mutação específica de acordo com a declaração de consenso de especialistas HRS/EHRA.1313 Ackerman MJ, Priori SG, Willems S, Berul C, Brugada R, Calkins H, et al; Heart Rhythm Society (HRS); European Heart Rhythm Association (EHRA). HRS/EHRA expert consensus statement on the state of genetic testing for the channelopathies and cardiomyopathies: this document was developed as a partnership between the Heart Rhythm Society (HRS) and the European Heart Rhythm Association (EHRA). Europace. 2011;13(8):1077-109. Erratum in: Erratum in: Europace. 2012;14(2):277.

Tabela 1
Primers para o sequenciamento do MYH7
Tabela 2
Primers para o sequenciamento de MYBPC3
Tabela 3
Primers para o sequenciamento de TNNT2

Previsão de patogenicidade da variante

Os efeitos de mutações missense foram previstos utilizando-se as ferramentas PolyPhen-2 (http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/), SIFT/PROVEAN (http://SIFT.jcvi.org/) e PredictProtein (http:/predictprotein.org/home). A5YM48 e Q14896 foram utilizados como sequências de referência para MYBPC3 (UniProtKB).

Resultados

Um paciente de dezessete anos de idade apresentando manifestação clínica de CMH e histórico de síncope foi submetido ao implante de cardioversor-desfibrilador para prevenção primária de síncope. O diagnóstico foi baseado no ETT e mostrou hipertrofia septal assimétrica de curva reversa, de 39 mm de espessura, com função sistólica do VE preservada e fração de ejeção normal do VE (Figura 1). Além disso, também apresentou disfunção diastólica tipo II, gradiente máximo VE/Aorta de 25 mmHg, movimento sistólico anterior da valva mitral, obstrução do trato de saída do VE e aumento do átrio esquerdo (46 mm). O ECG mostrou uma sobrecarga no VE e AE e o Holter de 24h não documentou a presença de taquicardia ventricular. O risco de MSC foi considerado elevado, 7,69%. A análise genética identificou uma variante missense em heterozigose composta, c.1624G>C (p.E542Q) e c.1828G>C (p.D610H) em MYBPC3 (Figura 2). A variante p.E542Q (rs121909374) já foi associada com CMH no ClinVar e no banco de dados Human Gene Mutation Database (HGMD). A análise in silico realizada com PolyPhen-2 prevê essa variante como possivelmente prejudicial, enquanto o SIFT/PROVEAN e PredictProtein classificam essa mutação como tolerável. Por outro lado, a variante p.D610H (rs371564200) é classificada como uma variante de significado incerto (VSI), embora as ferramentas de previsão de patogenicidade classifiquem a p.D610H como provavelmente prejudicial/nociva. Ambas as variantes afetam os resíduos conservados na cadeia polipeptídica (Figura 2).

Figura 1
ETT do probando e RMC da família. A) Imagem do ETT das quatro câmaras cardíacas e aorta revelando a hipertrofia septal de curva reversa. B) Vista do eixo curto paraesternal mostrando a hipertrofia septal. C) Vista do eixo longitudinal paraesternal mostrando o VE e a hipertrofia septal e o átrio esquerdo aumentado. A seta branca mostra o movimento sistólico anterior da válvula mitral. D) Imagem de ETT mostrando a obstrução e a turbulência no trato de saída do ventrículo esquerdo (seta branca). Regurgitação mitral leve no átrio esquerdo é visível. RMC do pai (E), tia (F) e mãe (G) do probando, sem sinais de hipertrofia ou fibrose. RMC na sequência de inversão-recuperação (atraso do realce) no eixo de 4 câmaras (E1, F1, G1), LVSV (E2, F2, G2) e 2 câmaras (E3, F3, G3). AD: átrio direito; VD: ventrículo direito; AE: átrio esquerdo; VE: ventrículo esquerdo; Ao: aorta.

Figura 2
A) Pedigree mostrando cinco gerações da família materna. O probando é o único membro afetado pela CMH. Os portadores de alelos variantes da família são indicados por E542Q+ e D610H+. B) Eletroferogramas das regiões das variantes missense do gene MYBPC3 do probando. C) Alinhamento de múltiplas espécies da sequência de aminoácidos da proteína C ligante de miosina dos resíduos 538 a 546 e 606 a 614. Os resíduos conservados, ácido glutâmico e ácido aspártico, são indicados por um retângulo.

O probando é o único membro que manifesta um fenótipo de CMH em sua família. Seu pai foi adotado, de modo que só os ascendentes maternos são conhecidos. O heredograma construído revelou 30 parentes, ao longo de cinco gerações, nos quais ocorreu apenas uma morte inexplicável de uma mulher de 30 anos sem diagnóstico de CMH (Figura 2).1414 Mattos BP, Scolari FL, Torres MA, Simon L, Freitas VC, Giugliani R, et al. Prevalence and phenotypic expression of mutations in the MYH7, MYBPC3 and TNNT2 genes in families with hypertrophic cardiomyopathy in the south of Brazil: a cross-sectional study. Arq Bras Cardiol. 2016;107(3):257-65.

A genotipagem dos familiares maternos - avó (59 anos), tia (29 anos), tio (35anos) e mãe (39 anos) - detectou a variante p.D610H. Todos os membros da família eram assintomáticos, com ETT e ECG normais, sem evidência de HV. Por outro lado, o alelo p.E542Q foi detectado no pai (40 anos) e em um irmão por parte de pai (8 anos), ambos com resultados normais na avaliação clínica (Tabela 4). A RMC foi realizada na mãe, tia e pai, e resultou em achados normais, especificamente a espessura normal de parede do VE e sem sinais de fibrose (Figura 1).

Tabela 4
Dados de avaliação clínica dos indivíduos

Discussão

O presente estudo relata o caso de um jovem com CMH grave, portador de uma variante trans em heterozigose composta no gene MYBPC3, com um alelo - p.D610H - herdado da mãe e outro - p.E542Q - herdado do pai.

Indivíduos com apenas uma única variante não apresentaram qualquer fenótipo de CMH. A variante p.E542Q, encontrada nos familiares paternos, está associada à CMH, com prognóstico bom e hipertrofia moderada na parede ventricular, embora poucos estudos citando essa mutação estejam disponíveis.1010 Wang J, Wang Y, Zou Y, Sun K, Wang Z, Ding H, et al. Malignant effects of multiple rare variants in sarcomere genes on the prognosis of patients with hypertrophic cardiomyopathy. Eur J Heart Fail. 2014;16(9):950-7.,1515 Marsiglia JD, Credidio FL, de Oliveira TG, Reis RF, Antunes Mde O, de Araujo AQ, et al. Screening of MYH7, MYBPC3, and TNNT2 genes in Brazilian patients with hypertrophic cardiomyopathy. Am Heart J. 2013;166(4):775-82.

16 Fokstuen S, Munoz A, Melacini P, Iliceto S, Perrot A, Ozcelik C, et al. Rapid detection of genetic variants in hypertrophic cardiomyopathy by custom DNA resequencing array in clinical practice. J Med Genet. 2011;48(8):572-6.
-1717 Rodríguez-García MI, Monserrat L, Ortiz M, Fernández X, Cazón L, Núñez L, et al. Screening mutations in myosin binding protein C3 gene in a cohort of patients with Hypertrophic Cardiomyopathy. BMC Med Genet. 2010;11:67. A previsão de patogenicidade do p.E542Q está de acordo com os dados da literatura.1818 Adzhubei IA, Schmidt S, Peshkin L, Ramensky VE, Gerasimova A, Bork P, et al. A method and server for predicting damaging missense mutations. Nat Methods. 2010;7(4):248-9.

19 Ng PC, Henikoff S. Predicting deleterious amino acid substitutions. Genome Res. 2001;11(5):863-74.

20 Ng PC, Henikoff S. Accounting for human polymorphisms predicted to affect protein function. Genome Res. 2002;12(3):436-46.
-2121 Choi Y, Sims GE, Murphy S, Miller JR, Chan AP. Predicting the functional effect of amino acid substitutions and indels. PLoS One. 2012;7(10):e46688.

Além disso, a variante p.D610H, identificada nos familiares maternos, também não manifestou qualquer fenótipo de CMH, mesmo no membro mais velho da família investigado (59 anos). A associação entre p.D610H e CMH permanece incerta, apesar do fato de que as ferramentas de previsão de patogenicidade a tenham classificado como provavelmente patogênica. Apenas um único estudo na literatura identificou essa mutação, embora não a tivesse correlacionado com a doença.2222 Olivotto I, Girolami F, Sciagrà R, Ackerman MJ, Sotgia B, Bos JM, et al. Microvascular function is selectively impaired in patients with hypertrophic cardiomyopathy and sarcomere myofilament gene mutations. J Am Coll Cardiol. 2011;58(8):839-48.

Em geral, uma única mutação heterozigótica para CMH é suficiente para afetar a função miocárdica e levar à hipertrofia, porém os estudos iniciais associaram variantes no gene MYBPC3 com penetrância incompleta, HV leve, baixo risco de MSC e evolução clínica benigna.2323 Niimura H, Bachinski LL, Sangwatanaroj S, Watkins H, Chudley AE, McKenna W, et al. Mutations in the gene for cardiac myosin-binding protein C and late-onset familial hypertrophic cardiomyopathy. N Engl J Med. 1998;338(18):1248-57.

24 Cardim N, Perrot A, Santos S, Morgado P, Pádua M, Ferreira S, et al. Hypertrophic cardiomyopathy in a Portuguese population: mutations in the myosin-binding protein C gene. Rev Port Cardiol. 2005;24(12):1463-76.
-2525 Charron P, Dubourg O, Desnos M, Isnard R, Hagege A, Millaire A, et al. Diagnostic value of electrocardiography and echocardiography for familial hypertrophic cardiomyopathy in a genotyped adult population. Circulation. 1997;96(1):214-9.

Em conclusão, sugere-se que, individualmente, as variantes p.E542Q e p.D610H resultam em leves alterações na estrutura/função da proteína, insuficientes para causar um fenótipo forte. Contudo, a expressão destas variantes em trans pode ser responsável pelo início precoce da doença, um fenótipo clínico mais grave e um risco aumentado de eventos malignos no probando. Em outras palavras, as variantes duplas e compostas por si só não são decisivas para um prognóstico pior da CMH, mas a composição alélica destas variantes pode ser determinante para este desfecho.

Limitações do estudo

O presente estudo investigou os três principais genes da CMH que representam aproximadamente 60-70% dos casos de CMH.55 Maron BJ, Ommen SR, Semsarian C, Spirito P, Olivotto I, Maron MS. Hypertrophic cardiomyopathy: present and future, with translation into contemporary cardiovascular medicine. J Am Coll Cardiol. 2014;64(1):83-99. Erratum in: J Am Coll Cardiol. 2014;64(11):1188,1414 Mattos BP, Scolari FL, Torres MA, Simon L, Freitas VC, Giugliani R, et al. Prevalence and phenotypic expression of mutations in the MYH7, MYBPC3 and TNNT2 genes in families with hypertrophic cardiomyopathy in the south of Brazil: a cross-sectional study. Arq Bras Cardiol. 2016;107(3):257-65. No entanto, vários outros genes já foram associados a esta doença,55 Maron BJ, Ommen SR, Semsarian C, Spirito P, Olivotto I, Maron MS. Hypertrophic cardiomyopathy: present and future, with translation into contemporary cardiovascular medicine. J Am Coll Cardiol. 2014;64(1):83-99. Erratum in: J Am Coll Cardiol. 2014;64(11):1188,1414 Mattos BP, Scolari FL, Torres MA, Simon L, Freitas VC, Giugliani R, et al. Prevalence and phenotypic expression of mutations in the MYH7, MYBPC3 and TNNT2 genes in families with hypertrophic cardiomyopathy in the south of Brazil: a cross-sectional study. Arq Bras Cardiol. 2016;107(3):257-65. os quais ainda não foram investigados.

  • Fontes de financiamento
    O presente estudo foi financiado pelo Instituto Nacional de Cardiologia and Fundação Pró Coração (Fundacor).
  • Vinculação acadêmica
    Este artigo é parte de dissertação de Mestrado de Julianny Freitas Rafael pelo Instituto Nacional de Cardiologia.

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Datas de Publicação

  • Publicação nesta coleção
    Abr 2017

Histórico

  • Recebido
    21 Jul 2016
  • Revisado
    29 Nov 2016
  • Aceito
    20 Dez 2016
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