Avaliação de Cardiotoxicidade Subclínica Induzida por Doxorrubicina em um Modelo de Rato por Speckle-Tracking

Resumo

Fundamento:

Apesar dos seus claros benefícios terapêuticos, a cardiotoxicidade induzida pela antraciclina é uma grande preocupação que limita a capacidade de reduzir a morbidade e mortalidade associadas com cânceres. A identificação precoce da cardiotoxicidade induzida por antraciclina é de vital importância para o equilíbrio entre o risco cardíaco e o potencial tratamento do câncer.

Objetivo:

Investigar se a análise por speckle-tracking pode fornecer uma medida sensível e precisa na detecção de lesão ventricular esquerda induzida por doxorrubicina.

Métodos:

Ratos Wistar foram divididos em 4 grupos de 8 ratos cada, e doxorrubicina foi administrada intraperitonealmente em intervalos semanais de até 4 semanas. Grupo 1: 2,5 mg/kg/semana; Grupo 2: 3 mg/kg/semana; Grupo 3: 3,5 mg/kg/semana; Grupo 4: 4 mg/kg/semana. Foram utilizados 5 ratos adicionais como controles. As imagens ecocardiográficas foram obtidas na linha basal e 1 semana após a última dose do tratamento. Foram analisados o strain radial (Srad) e circunferencial (Scirc) e as taxas de strain radial (TSrad) e circunferencial (TScirc). Após o experimento, a troponina cardíaca I (cTnI) foi analisada e as amostras cardíacas foram avaliadas histologicamente.

Resultados:

Após a exposição à doxorrubicina, a FEVE foi significativamente reduzida no grupo 4 (p = 0,006), mas permaneceu estável nos outros grupos. Entretanto, após o tratamento, os Srads foram reduzidos nos grupos 2, 3 e 4 (p < 0,05). A diminuição dos Srads foi correlacionada com cTnI (rho = -0,736, p = 0,000) e os escores de cardiomiopatia (rho = -0,797, p = 0,000).

Conclusão:

O strain radial pode fornecer um índice sensível e não-invasivo na detecção precoce da lesão miocárdica induzida pela doxorrubicina. As alterações do strain radial apresentaram correlação significativa com lesões miocárdicas e níveis séricos de troponina I cardíaca, indicando que esse parâmetro pode avaliar com precisão a gravidade da cardiotoxicidade.

Palavras-chave:
Cardiotoxicinas; Estresse Oxidativo; Doxorrubicina; Ecocardiografia Doppler; Troponiona I

Abstract

Backgrounds:

Despite their clear therapeutic benefits, anthracycline-induced cardiotoxicity is a major concern limiting the ability to reduce morbidity and mortality associated with cancers. The early identification of anthracycline-induced cardiotoxicity is of vital importance to assess the cardiac risk against the potential cancer treatment.

Objective:

To investigate whether speckle-tracking analysis can provide a sensitive and accurate measurement when detecting doxorubicin-induced left ventricular injury.

Methods:

Wistar rats were divided into 4 groups with 8 rats each, given doxorubicin intraperitoneally at weekly intervals for up to 4 weeks. Group 1: 2.5 mg/kg/week; group 2: 3 mg/kg/week; group 3: 3.5mg/kg/week; group 4: 4mg/kg/week. An additional 5 rats were used as controls. Echocardiographic images were obtained at baseline and 1 week after the last dose of treatment. Radial (Srad) and circumferential (Scirc) strains, radial (SRrad) and circumferential (SRcirc) strain rates were analyzed. After the experiment, cardiac troponin I (cTnI) was analyzed and the heart samples were histologically evaluated.

Results:

After doxorubicin exposure, LVEF was significantly reduced in group 4 (p = 0.006), but remained stable in the other groups. However, after treatment, Srads were reduced in groups 2, 3 and 4 (p all < 0.05). The decrease in Srads was correlated with cTnI (rho = -0.736, p = 0.000) and cardiomyopathy scores (rho = -0.797, p = 0.000).

Conclusion:

Radial strain could provide a sensitive and noninvasive index in early detection of doxorubicin-induced myocardial injury. The changes in radial strain had a significant correlation with myocardial lesions and serum cardiac troponin I levels, indicating that this parameter could accurately evaluate cardiotoxicity severity.

Keywords:
Cardiotoxicins; Oxidative Stress; Doxorubicin; Echocardiography, Doppler; Troponin I

Introdução

A cardiotoxicidade, que pode ser o resultado do estresse oxidativo cardíaco, é o principal fator limitante da terapia anticancerígena com antraciclina.¹ Técnicas não-invasivas para a identificação de pacientes com alto risco de desenvolver cardiomiopatia induzida por antraciclina são de importância crítica para a prevenção e tratamento dessa complicação. Atualmente, a avaliação de imagem bidimensional por speckle-tracking (STI), baseada no rastreamento de detalhes da imagem local quadro a quadro ao longo do ciclo cardíaco, tem sido considerada como um método simples e preciso para a avaliação da mecânica do ventrículo esquerdo.^2-5 Tem sido aplicada para a detecção precoce de lesão miocárdica em cardiopatia isquêmica ou várias cardiomiopatias, tanto em humanos como em modelos animais experimentais, permitindo medidas mais precisas do desempenho sistólico regional do miocárdio.^6-10

O objetivo desse estudo foi determinar, através de um modelo de rato experimental usando doxorrubicina, se o STI poderia fornecer uma medida mais sensível e precisa na detecção de lesão ventricular esquerda.

Métodos

Tratamento de animais

Este protocolo foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais da Universidade Jiaotong de Xangai, e estava em conformidade com o "Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório", publicado pela Academia Nacional de Imprensa. Trinta e sete ratos Wistar machos adultos, pesando 250,4 ± 4,3 g, foram alojados em um local com temperatura constante e alimento e água disponíveis livremente. O cálculo do tamanho da amostra foi realizado com base nos seguintes pressupostos: após a exposição à antraciclina, a diferença de valores de strain foi de 20% entre os grupos, o desvio padrão dentro do grupo foi de 10%, o poder foi de 0,80, e o nível de significância foi de 0,05. Como resultado, calculamos um tamanho de amostra necessário de 8 ratos em cada grupo de tratamento. Os ratos foram distribuídos aleatoriamente em 4 grupos de 8 ratos cada, com base no processo publicado por Martin RA et al.,¹¹ com administração de doxorrubicina por via intraperitoneal em intervalos semanais de até 4 semanas. Grupo 1: 2,5 mg/kg/semana, dose total de 10 mg/kg; Grupo 2: 3 mg/kg/semana, dose total de 12 mg/kg; Grupo 3: 3,5 mg/kg/semana, dose total de 14 mg/kg; Grupo 4: 4 mg/kg/semana, dose total de 16 mg/kg. Utilizaram-se 5 ratos adicionais como controles, aos quais foi administrada 1 mL de solução salina a 0,9% por via intraperitoneal.

Protocolo ecocardiográfico

As imagens foram obtidas na linha basal e 1 semana após a última dose de tratamento com antraciclina. Os ratos foram anestesiados com uma injeção intraperitoneal de hidrato de cloral a 10% em uma dose de 0,3 mL/Kg. Os ratos foram colocados em decúbito lateral esquerdo e examinados utilizando-se um eco-escâner comercialmente disponível, Vivid ultrasound cardiovascular system (GE Healthcare Inc., Horten, Noruega), com um transdutor pediátrico com arranjo de fase 10S (11,5MHz) e aplicação cardíaca de alta resolução temporal e espacial. A frequência de transmissão foi de 10 MHz, a profundidade de 2,5 cm e a taxa de quadros foi de 225 quadros por segundo. As imagens bidimensionais (2D) padrão de eixo curto, adquiridas a nível do músculo papilar, foram armazenadas digitalmente para posterior análise off-line. As dimensões do ventrículo esquerdo foram medidas utilizando ecocardiografia no modo M no corte de eixo curto do nível papilar médio, e a fração de ejeção do ventrículo esquerdo (FEVE) foi calculada pelo método de Teicholz.

Utilizou-se o EchoPAC 11.0 (GE Healthcare In, Noruega) para a análise de strain radial (Srad), strain circunferencial (Scirc), taxa de strain radial (TSrad) e circunferencial (TScirc). Este programa de strain em 2D monitorou o movimento de refletores fortes que foram observados nas imagens no modo B, quadro a quadro, após segmentar a silhueta ventricular em seis segmentos. A borda endocárdica foi marcada, enquanto a borda externa foi ajustada para se adequar ao contorno epicárdico. O software automaticamente rastreou e calculou o strain e a taxa de strain nas direções radial e circunferencial ao longo do ciclo cardíaco. O pico sistólico do Srad, Scirc, TSrad e TScirc foi obtido a partir de 6 segmentos a nível dos músculos papilares. Foram calculados os dados de pelo menos três ciclos cardíacos distintos.

Estudo histológico

Uma semana após o fim da administração de doxorrubicina, os animais foram sacrificados com uma superdosagem de hidrato de cloral. Foram colhidas amostras de sangue para determinação dos níveis séricos de troponina I cardíaca (cTnI). Os ventrículos esquerdos a nível dos músculos papilares foram fixados em formalina tamponada com fosfato a 10%, embebida em parafina e seccionados com espessura de 5 µm. Essas seções foram coradas com hematoxilina e eosina. A frequência e a gravidade das lesões miocárdicas induzidas pela doxorrubicina foram avaliadas semiquantitativamente por microscopia óptica. As alterações foram classificadas com base no número de miócitos mostrando perda miofibrilar e vacuolização citoplasmática (pontuação de 0 a 3 de acordo com Billingham.¹²) Animais que morreram espontaneamente durante o estudo também foram submetidos à necropsia, mas não foram incluídos na análise dos dados.

Níveis séricos de cTnI

As amostras de sangue foram centrifugadas e as amostras de soro foram congeladas a -80°C até serem analisadas. As concentrações séricas foram determinadas por imunoensaio (Denley Dragon Wellscan MK 3, Thermo, Finlândia). Os escores de cardiomiopatia foram calculados por um especialista e os níveis de cTnI foram registrados por um técnico, cegado para o processo experimental e dados ecocardiográficos.

Análise estatística

As variáveis contínuas próximas a uma distribuição normal foram expressas como média ± desvio padrão. Os dados não-normais, assimétricos, foram expressos como medianas e intervalos interquartis. Utilizou-se o teste K-S para uma amostra para determinar a normalidade dos dados. As diferenças em dados ecocardiográficos antes e após o tratamento, e entre cada grupo, foram determinadas utilizando-se a análise de variância (ANOVA) de medidas repetidas. Os valores dos níveis de cTnI e os escores de cardiomiopatia entre cada grupo foram analisados pelo teste de Kruskal-Wallis. A análise de Spearman foi utilizada na determinação da correlação entre valores de strain, cTnI e cardiomiopatia. Os dados foram analisados através do software SPSS, versão 16.0 (SPSS, Inc, Chicago, IL, EUA). Um valor de p < 0,05 foi considerado significativo.

Resultados

Toxicidade geral e alterações macro-anatômicas

Um dos ratos do grupo 3 morreu após a terceira dose de doxorrubicina. Nenhuma amostra de sangue terminal desse animal estava disponível e, portanto, ele foi excluído do estudo. Na necropsia, foram observadas quantidades excessivas de fluido pericárdico e peritoneal em 4 dos 8 animais do grupo 2, em 6 dos 7 animais do grupo 3 e todos do grupo 4. Também se observou um excesso de fluido no animal que morreu espontaneamente. O acúmulo de fluido não foi encontrado em animais do grupo 1 e nos animais que receberam solução salina.

Funções sistólicas

Não houve diferença significativa na FEVE no início do estudo entre os grupos. Após a exposição à doxorrubicina, a FEVE reduziu de 85,50 ± 1,06% para 82,50 ± 1,85% (p = 0,006) em animais que receberam doxorrubicina a 16 mg/kg. No entanto, a FEVE em outros animais que receberam menores doses de doxorrubicina não mostrou diferença estatística antes e após o tratamento (Tabela 1).

Tabela 1
Índices de speckle-tracking e FEVE em ratos tratados com doxorrubicina e ratos controle

	Grupo controle			Grupo 1			Grupo 2			Grupo 3			Grupo 4
	Basal	Depois	Valor de p	Basal	Depois	Valor de p	Basal	Depois	Valor de p	Basal	Depois	Valor de p	Basal	Depois	Valor de p
FEVE (%)	85,4 ± 0,9	84,8 ± 2,9	0,591	86,2 ± 1,9	86,4 ± 2,3	0,890	84,6 ± 3,3	84,3 ± 2,9	0,714	83,9 ± 2,4	83,3 ± 2,3	0,220	85,5 ± 1,2	82,5 ± 1,8*	0,006
Srad (%)	52,2 ± 3,6	52,6 ± 3,1	0,730	51,2 ± 6,8	49,4 ± 5,2	0,061	52,1 ± 5,6	43,2 ± 5,7*	0,000	52,5 ± 5,1	38,6 ± 4,8*	0,000	52,3 ± 7,3	34,6 ± 7,4*	0,000
Scirc (%)	–17,2 ± 3,1	–18,2 ± 4,6	0,551	–16,1 ± 2,0	–17,0 ± 2,2	0,113	–17,2 ± 2,4	–16,7 ± 2,4	0,578	–17,0 ± 2,7	–17,9 ± 2,0	0,634	–17,4 ± 2,1	–14,1 ± 1,8*	0,004
TSrad (sec-1)	5,7 ± 1,1	5,5 ± 1,2	0,821	5,9 ± 0,8	6,1 ± 1,2	0,617	6,0 ± 0,9	6,0 ± 1,1	0,983	5,6 ± 1,1	5,6 ± 1,1	0,987	5,6 ± 1,0	5,5 ± 1,1	0,786
TScirc(sec-1)	4,5 ± 0,7	4,9 ± 0,5	0,137	4,5 ± 1,2	4,7 ± 0,9	0,556	4,3 ± 1,0	4,3 ± 0,8	0,571	4,6 ± 0,9	4,3 ± 0,5	0,409	4,7 ± 0,7	4,5 ± 0,7	0,179

• FEVE: fração de ejeção do ventrículo esquerdo; Scirc: strain circunferencial; Srad: strain radial; TScirc: taxa de strain circunferencial; TSrad: taxa de strain radial.
• ^*
  p < 0,05 em comparação com o valor basal.

Análise do strain

Os dados sobre os valores do strain e taxa de strain em animais nos vários grupos de tratamento foram resumidos na Tabela 1. As características basais dos animais tratados com doxorrubicina foram semelhantes às dos controles. Os strains radiais foram reduzidos após o tratamento em animais do grupo 2, grupo 3 e grupo 4 (de 52,1 ± 5,6% para 43,2 ± 5,7%, 52,5 ± 5,1% para 38,6 ± 4,8% e 52,3 ± 7,3% para 34,6 ± 7,4% respectivamente, com todos os valores de p < 0,05). O strain circunferencial foi reduzido de -17,4 ± 2,1% para -14,1 ± 1,8% no grupo 4 após o tratamento (p = 0,004). A redução dos strains radiais induzida pela doxorrubicina foi relacionada à dose (p = 0,000). As taxas de strain radial e circunferencial permaneceram estáveis após a exposição, independente das doses de doxorrubicina (Tabela 1, Figura 1).

Figura 1
Curvas de strain radial obtidas a partir do corte de eixo curto de ratos após tratamento com doxorrubicina. A: rato do grupo 1, strain radial = 55,23%; B: rato do grupo 2, strain radial = 41,63%; C: rato do grupo 3, strain radial = 29,71%; D: rato do grupo 4, strain radial = 24,95%.

Patologia miocárdica

Os animais tratados com doxorrubicina desenvolveram lesões cardíacas que foram identificadas em microscopia óptica. As características dessas lesões, vacuolização citoplasmática e perda miofibrilar, têm sido observadas previamente em modelos animais, bem como em pacientes humanos que receberam quimioterapia com antraciclina.^13,14 Os dados sobre a incidência e a gravidade das lesões miocárdicas estão resumidos na Tabela 2. A gravidade dessas lesões foi significativamente maior nos grupos 3 e 4 (com 14 mg/kg e 16 mg/kg de doxorrubicina, respectivamente) do que naqueles que receberam 12 mg/kg ou 10 mg/Kg de doxorrubicina. Os corações de todos os grupos controle estavam normais (Figura 2).

Tabela 2
Escores de cardiomiopatia em ratos Wistar tratados com doxorrubicina durante 4 semanas

Dose de doxorrubicina (mg/kg/semana)	No. de animais	Escore de cardiomiopatia
		0	1	1,5	2	2,5	3
4*	8	0	2	3	3	0	0
3,5†	7	2	2	2	1	0	0
3	8	4	2	2	0	0	0
2,5	8	6	2	0	0	0	0
Solução salina controle	5	5	0	0	0	0	0

• Os escores de cardiomiopatia são baseados na porcentagem de miócitos que apresentam vacuolização citoplasmática e/ou perda miofibrilar, e são classificados de 0 a 3 da seguinte forma: 0 = sem alterações, 1 ≤ 5%, 1,5 = 5% a 15%, 2,0 = 16% a 25%, 2,5 = 26% a 35% e 3 ≥ 35%.
• ^*
  Escores de cardiomiopatia significativamente (p < 0,05) maiores do que naqueles que receberam 3 mg/kg/semana ou menos de doxorrubicina.
• ^†
  Escores de cardiomiopatia foram significativamente (p < 0,05) maiores do que naqueles que receberam 2,5 mg/kg/semana ou menos de doxorrubicina.

Figura 2
Alterações miocárdicas após tratamento com doxorrubicina vistas sob microscópio óptico (× 400). Vacuolização do citoplasma, perda de miofbrilas mais grave em ratos do grupo 4 (D). A: rato do grupo 1; B: rato do grupo 2; C: rato do grupo 3; D: rato do grupo 4.

Níveis de cTnI

Os níveis de cTnI no grupo de controle e nos grupos 1,2,3,4 foram 7,62 (3,06) ng/mL, 6,92 (4,04) ng/mL, 17,03 (8,46) ng/mL, 22,57 (12,21) ng/mL e 34,93 (11,24) ng/mL, respectivamente. Conforme mostrado na Figura 3, os níveis séricos de cTnI no grupo 1 não foram significativamente diferentes daqueles do grupo de controle. No entanto, em comparação com os animais que receberam soro fisiológico, os níveis de cTnI aumentaram significativamente com o aumento das doses cumulativas totais de doxorrubicina (Figura 3).

Figura 3
Diagrama de dispersão dos níveis séricos de cTnI em ratos individuais. *: p < 0,05 em comparação com o valor basal.

Correlações entre os valores de strain, níveis de cTnI e as lesões histológicas

A diminuição dos valores de strain radial exibiu uma clara correlação com a concentração de cTnI (correlação de Spearman rho = -0,736, p = 0,000) (Figura 4) e com os escores de cardiomiopatia (correlação de Spearman rho = -0,797, p = 0,000) (Figura 5).

Figura 4
Correlações entre strains radiais e níveis de cTnI.

Figura 5
Correlações entre strains radiais e escores de cardiomiopatia.

Discussão

A antraciclina continua a ser um agente quimioterápico comumente utilizado. No entanto, a eficácia clínica é prejudicada devido à cardiotoxicidade potencialmente fatal. Um método preciso e não invasivo para o monitoramento precoce da lesão cardíaca é de vital importância para orientar as estratégias preventivas e terapêuticas na redução da cardiotoxicidade. Nesse estudo, propusemos uma nova aplicação da imagem por speckle-tracking para a avaliação da lesão miocárdica subclínica após o tratamento com antraciclina. Na prática clínica, o monitoramento da FEVE é a ferramenta diagnóstica clínica mais importante no reconhecimento da disfunção cardíaca.^15,16 No entanto, esses níveis são um pouco insensíveis na detecção de sinais precoces de estresse cardíaco, lesão miocárdica e alterações na complacência miocárdica. No presente estudo, apesar de terem sido observadas lesões miocárdicas e elevação dos níveis séricos de cTnI após o tratamento, a FEVE permaneceu estável e dentro do intervalo normal, indicando que a FEVE não é sensível para a detecção precoce de lesão miocárdica.

O strain é um parâmetro sem dimensão que representa a deformação de um segmento miocárdico em relação às suas dimensões originais dentro de um período de tempo sistólico. Estudos iniciais relataram que a redução na função ventricular esquerda, causada pela antraciclina, poderia ser avaliada pelos índices de strain e taxa de strain medidos por Doppler.¹⁷ Com as vantagens da independência de ângulo, a técnica de speckle-tracking, uma técnica relativamente nova e mais abrangente, poderia avaliar a deformação miocárdica ventricular esquerda regional e global em três dimensões, fornecendo parâmetros confiáveis e sensíveis para a detecção precoce de lesões cardíacas. Shi et al.¹⁸ descobriram que a análise do strain radial baseada em STI podia detectar rejeição aguda de aloenxerto em um modelo de transplante cardíaco de rato, que era mais sensível do que os parâmetros ecocardiográficos convencionais. Em um modelo de rato de coração de atleta, os valores de strain baseados no speckle-tracking correlacionaram-se bem com os índices de contratilidade privados do loop de pressão-volume.⁸ Estudos anteriores observaram que os strains diminuíram significativamente após o tratamento com epirubicina, embora os parâmetros ecocardiográficos convencionais se mantivessem estáveis e dentro da faixa normal.¹⁹

Demonstramos que em nosso modelo animal, o strain radial foi mais sensível do que a fração de ejeção do ventrículo esquerdo na avaliação da lesão cardíaca em estágio inicial, o que foi confirmado pelo exame histológico e cTnI sérica. A cardiotoxicidade induzida pela quimioterapia possui padrão regional,^20,21 o que poderia explicar o aumento da sensibilidade dos valores de strain em relação à FEVE na detecção de cardiotoxicidade precoce. Além disso, verificou-se que as alterações de strain radial exibiram uma clara correlação com lesões histológicas e elevação dos níveis de cTnI, indicando que o strain radial pode avaliar com precisão a gravidade da cardiotoxicidade.

O STI tem uma melhor resolução espacial em comparação com a técnica baseada em Doppler tecidual.²² Em uso clínico, as taxas de quadros > 90 quadros/s geralmente levam a uma avaliação ruim por speckle-tracking.²³ No entanto, devido à sua alta frequência cardíaca, maiores taxas de quadros são necessárias em roedores. A frequência do transdutor, a largura e a profundidade do setor, bem como o número de cristais dentro do transdutor, terão um impacto na resolução da linha de varredura, o que por sua vez afetará a qualidade do speckle-tracking. Com alta densidade de cristais em uma largura e profundidade de setor muito pequenas, nosso transdutor de 11,5 MHz pode obter boas imagens em altas taxas de quadros sem perda de resolução da linha de varredura.

Limitação

A imagem cardíaca do ventrículo esquerdo em roedores é limitada a alguns cortes ecocardiográficos. Embora seja possível obter um corte apical de 4 câmaras, a parede lateral raramente é visualizada.^24,25 A qualidade da imagem do corte longitudinal foi ruim e, portanto, não foi possível fornecer dados sobre a função longitudinal.

O tipo de anestesia pode influenciar a frequência cardíaca e a contratilidade miocárdica intrínseca. No entanto, nesse estudo, todos os animais, incluindo os grupos tratados e de controle, foram submetidos ao mesmo procedimento de anestesia para limitar o efeito da anestesia na análise da função cardíaca. A taxa de quadros em relação à duração do ciclo cardíaco utilizada nesse estudo foi inferior à dos estudos realizados em humanos ou em animais grandes. Digno de nota, tivemos taxas de quadros semelhantes às de estudos recentes em um modelo de rato de infarto do miocárdio e rejeição aguda.¹⁸

Conclusão

O strain radial baseado em imagens de speckle-tracking pode fornecer uma estratégia sensível e não-invasiva na detecção precoce de lesão miocárdica induzida por doxorrubicina.

• Fontes de financiamento
  O presente estudo foi financiado peli National Natural Science Foundation of China (N° 81401411) and Shanghai Natural Science Foundation (N° 14ZR1425200, 16ZR1420600).
• Vinculação acadêmica
  Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  10 Jul 2017
• Data do Fascículo
  Jul-Aug 2017

Histórico

• Recebido
  12 Out 2016
• Revisado
  20 Jan 2017
• Aceito
  20 Fev 2017