Efeito Cardiodepressor do Acetato de Eugenil em Coração de Roedor

Resumo

No presente trabalho investigou-se o efeito inotrópico do acetato de eugenil (AE), bem como sua ação sobre a corrente de Ca²⁺ do tipo L (I_Ca,L). Os experimentos de contratilidade foram realizados em átrio esquerdo isolado de cobaia exposto às concentrações crescentes da droga (1 a 5.000μM). O AE reduziu a força de contração atrial (IC₅₀=558±24,06μM) de modo dependente de concentração. O efeito do AE sobre a I_Ca,L também foi avaliado em cardiomiócitos ventriculares isolados de camundongos, utilizando-se a técnica de “patch-clamp”. O AE apresentou um efeito inibitório (IC₅₀=1.337±221μM) sobre os canais de Ca²⁺ sensíveis à voltagem (Ca_V1.2). Em conclusão, o AE apesenta efeito cardiodepressor que se deve, pelo menos em parte, à diminuição da entrada de Ca²⁺ nos cardiomiócitos.

Palavras-chave
Acetato de Eugenil; Contração Miocárdica; Syzygium Aromaticum, Ratos

Introdução

As doenças cardiovasculares são um problema de saúde pública e estão entre as principais causas de óbitos no mundo.¹ Nessa perspectiva, é crescente o interesse pela busca de novas substâncias com propriedades farmacológicas sobre o sistema cardiovascular, principalmente as de origem natural.

A planta Syzygium aromaticum (L.) Merr. & L.M. Perry, popularmente conhecida como cravo-da-índia, é constituída por diversos compostos químicos que apresentam uma ampla gama de efeitos farmacológicos. O eugenol (Figura 1A) é o mais abundante composto bioativo encontrado no óleo essencial do cravo-da-índia, seguido pelo acetato de eugenil (AE) (Figura 1B).²

Figura 1
Efeito do acetato de eugenil (AE) sobre a contratilidade do miocárdio atrial. A) Estrutura do eugenol. B) Estrutura do AE. C) Traçados representativos da contratilidade atrial na situação controle, na presença de 700 μM de AE, e após 10 minutos do washout. D) Curva concentração-efeito inotrópico negativo do AE (n=4).

Estudos demonstraram que o eugenol apresenta atividade cardiodepressora em ratos³ e cobaias⁴ provavelmente devido à inibição da corrente de Ca²⁺ do tipo L (I_Ca,L). Além disso, o eugenol atua como cardioprotetor.⁵

Apesar de diversos estudos abordarem as propriedades farmacológicas do eugenol sobre o coração, até o momento não existem informações sobre a ação do AE no miocárdio. Dessa forma, o presente estudo descreve, pela primeira vez, os efeitos do AE sobre a contratilidade cardíaca e sua ação inibitória sobre a I_Ca,L.

Métodos

Animais

Para os experimentos de contratilidade foram utilizadas cobaias machos e fêmeas (Cavia porcellus, 400-600g). Para os estudos eletrofisiológicos foram utilizados camundongos machos adultos C57Bl/6J. Todos os procedimentos foram aprovados pela Comissão de Ética para Uso de Animais (CEUA) da Universidade do Estado da Bahia (licença: 03/2017).

Protocolos Experimentais

Avaliação do Efeito Inotrópico do AE

O átrio esquerdo foi mantido em solução de Tyrode modificada (10 mL, 36,5±0,5°C) com a seguinte composição (em mM): 140 NaCl; 5,4 KCl; 0,5 MgCl₂; 0,33 NaH₂PO₄; 11 glicose; 5 HEPES e 1,8 CaCl₂ (pH =7,4), aerado com oxigênio (99,9%), estirado para uma tensão de 1gF e estimulado eletricamente (2Hz, 100V, 15ms). A força contrátil foi captada por um transdutor isométrico, sendo os sinais digitalizados (512Hz) e armazenados em um computador. Os átrios esquerdos foram submetidos às concentrações crescentes de AE (1-5.000μM, 3 a 5 minutos).

Para fazer a solução-estoque de AE (obtido da Sigma-Aldrich) foi usado dimetil sulfóxido (DMSO).

Avaliação do Efeito do AE Sobre a Corrente de Cálcio Tipo L

Cardiomiócitos ventriculares de camundongos C57Bl/6J foram enzimaticamente isolados.⁶ Para medir a corrente de Ca²⁺ do tipo L (I_Ca,L) foi utilizada a técnica de patch-clamp^7,8 no modo whole-cell voltage-clamp. A composição da solução interna (em mM) foi: 120 CsCl, 10 HEPES, 5 EGTA, 20 TEA-Cl e 5 NaCl (pH=7,2; CsOH). O Tyrode foi usado como solução externa. As células foram mantidas em um potencial de membrara de −80 mV, e depois foram submetidas a um pré-pulso que despolarizou a membrana para −40mV (50ms). Em seguida a membrana foi despolarizada para 0 mV (300ms, 0.1Hz). A amplitude da I_Ca,L foi medida pela diferença entre o final do pulso teste (0mV) e o pico. As células foram expostas ao AE (10-3.000μM, 2-3minutos). Os sinais foram digitalizados (5kHz) e armazenados em computador.

Análise Estatística

Os resultados são expressos com média ± erro padrão da média e foram analisados estatisticamente empregando-se o teste “t” pareado na sua forma bicaudal (nível de significância: p<0,05).

Resultados

Efeito do AE Sobre a Força de Contração Miocárdica

Os traçados da Figura 1C mostram que o AE (700 μM) reduziu em aproximadamente 60% a amplitude da contração atrial quando comparado com o controle. Tal efeito foi parcialmente revertido (aproximadamente 75%) após a remoção da droga, quando comparado com o controle. Na Figura 1D é possível observar a curva de concentração-efeito do AE sobre a contratilidade (n=4), o qual apresentou uma IC₅₀ (concentração que induz metade do efeito máximo) de 558±24,06μM e efeito máximo=100%.

Efeito do AE Sobre a I_Ca,L em Cardiomiócitos Isolados

A Figura 2A mostra o traçado representativo da I_Ca,L medida experimentalmente. Na figura 2B pode ser observado o curso temporal do efeito do AE sobre a amplitude da I_Ca,L. Na Figura 2C é possível visualizar traçados representativos da I_Ca,L na situação controle (ausência da droga) e na presença de 10, 700 e 3.000μM de AE. Na Figura 2D percebe-se que a exposição ao AE reduziu a amplitude da I_Ca,L de modo dependente de concentração (IC₅₀₌1.337±221μM).

Figura 2
Efeito do AE sobre a I_Ca,L. A) Corrente iônica obtida experimentalmente. B) Curso temporal do efeito do AE sobre a I_Ca,L. C) Traçados representativos da I_Ca,L no controle e na presença de diferentes concentrações de AE. A linha tracejada indica zero de corrente D) Curva concentração-efeito do AE sobre a I_Ca,L em cardiomiócitos (n = 4).

Discussão

Os resultados aqui apresentados demonstram que o AE reduz a força de contração do músculo atrial de cobaia de modo dependente de concentração. Também foi observado que o AE inibe os canais de Ca²⁺ do tipo L (Ca_V1.2) em cardiomiócitos.

O AE apresentou um efeito cardiodepressor sobre o inotropismo atrial. Apesar de não existir dados na literatura que demonstrem o efeito cardiodepressor do AE, dados de seus análogos, como o eugenol, estão disponíveis. O eugenol, de modo semelhante à droga aqui investigada reduz a força de contração do miocárdio ventricular de cobaia⁵ e rato,⁴ corroborando os dados aqui achados.

A força da contração do miocárdio correlaciona-se com alterações da amplitude do transiente de Ca²⁺ que é determinada pelo influxo de Ca²⁺ através dos canais de Ca²⁺ presentes no sarcolema, bem como pela quantidade de Ca²⁺ liberada pelo retículo sarcoplasmático (RS) no processo denominado de acoplamento excitação-contração. A despolarização sarcolemal leva a abertura dos canais de Ca²⁺ do tipo L durante a fase do platô do potencial de ação, o que leva a uma corrente de entrada de Ca²⁺. Esse influxo de Ca²⁺ estimula a liberação do Ca²⁺ armazenado no RS, processo conhecido como liberação de Ca²⁺ induzida por Ca²⁺, que induz na contratilidade cardíaca.⁷ Dessa forma, mecanismos que alteram o manejo intracelular de Ca²⁺ estão envolvidos na regulação da contratilidade no músculo cardíaco.

Para tentar explicar o inotropismo negativo do AE sobre o músculo cardíaco foi verificado sua ação sobre a amplitude da I_Ca,L em cardiomiócitos isolados. Os achados indicam que o AE reduz a amplitude da I_Ca,L, efeito que pode estar associado à ativação de receptores que modulam a I_Ca,L e/ou ao bloqueio direto desses canais. Este mecanismo pode ser o responsável pela redução da força induzida pelo AE, uma vez que leva a redução da liberação de Ca²⁺ pelo RS.

Sensch et al.,⁴ ao estudar as propriedades farmacológicas do eugenol, quimicamente semelhante ao AE, demonstraram que essa substância deprime a força de contração atrial por reduzir o influxo de Ca²⁺ nos cardiomiócitos. Nesses experimentos, foi observado que o eugenol apresenta uma IC₅₀ de 127μM, valor menor do que a IC₅₀ do AE (1.337μM). Esses dados sugerem que o eugenol é mais potente em bloquear a corrente de Ca²⁺ do que o AE.

Conclusão

O AE apresenta efeito cardiodepressor que pode ser explicado, pelo menos em parte, pela inibição do Ca_V1.2.

• Fontes de Financiamento
  O presente estudo foi financiado pelo Programa Interno de Iniciação Científica da UNEB (PICIN/UNEB) e Fundação de Amparo de Pesquisa de São Paulo (Fapesp).
• Vinculação Acadêmica
  Não há vinculação deste estudo a programas de pós-graduação.

Agradecimentos

FAPESP 2014/09861-1 and PICIN/UNEB.

Referências

• ¹
  Wang H, Naghavi M, Allen C, Barber RM, Bhutta ZA, Carter A, et al. Global, regional, and national life expectancy, all-cause mortality, and cause-specific mortality for 249 causes of death, 1980–2015: a systematic analysis for the Global Burden of Disease Study 201. The lancet. 2016; 388(10053):1459-544.
• ²
  Khalil AA, urRahman U, Khan MR, Sahar A, Mehmoodac T, Khan M. Essential oil eugenol: sources, extraction techniques and nutraceutical perspectives. RSC Advances. 2017;7(52):32669-81.
• ³
  Damiani CEN, Moreira CM, Zhang HT, Creazzo TL, Vassall DV. Effects of eugenol, an essential oil, on the mechanical and electrical activities of cardiac muscle. J Cardiovasc Pharmacol. 2004;44(6):688-95.
• ⁴
  Sensch O, Vierling W, Brandt W, Reiter M. Effects of inhibition of calcium di and potassium currents in guinea-pig cardiac contraction: comparison of β-caryophyllene oxide, eugenol, and nifedipine. Br J Pharmacol. 2000; 131(6):1089-96.
• ⁵
  Choudhary R, Mishra KP, Subramanyam C. Interrelations between oxidative stress and calcineurin in the attenuation of cardiac apoptosis by eugenol. Mol Cell Biochem. 2006;283(1-2):115-22.
• ⁶
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  amill OP, Marty A, Neher E, Sakmann B, Sigworth FJ. Improved patch-clamp techniques for high-resolution current recording from cells and cell free membrane patches. Pflugers Arch. 1981;391(2):85-100.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  07 Dez 2020
• Data do Fascículo
  Nov 2020

Histórico

• Recebido
  21 Nov 2019
• Revisado
  18 Fev 2020
• Aceito
  16 Mar 2020