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Caracterização citológica dos hemócitos de Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera, Noctuidae) em larvas resistentes ao vírus AgMNPV

Citological characterization of the Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera, Noctuidae) hemocytes in resistant larvae to the virus AgMNPV

Resumos

A ocorrência de larvas de Anticarsia gemmatalis (Hübner, 1932) resistentes ao vírus AgMNPV em laboratório levou ao estudo dos hemócitos deste inseto para avaliar sua participação nos mecanismos que possibilitam a resistência ao vírus. As larvas resistentes com 6 - 11 dias de desenvolvimento (3º a 5º instar) foram anestesiadas por resfriamento e rapidamente limpas em álcool 70%. A hemolinfa foi coletada através de punção abdominal, a análise morfológica foi realizada em contraste de fase e esfregaços corados com solução de Seller. A contagem total de hemócitos (CTH) foi realizada em câmara de Neubauer com hemolinfa não diluída. Para a contagem diferencial de hemócitos (CDH), utilizou-se hemolinfa diluída em solução anticoagulante para insetos. Foram identificados seis tipos de hemócitos: plasmatócitos (38,5%), granulócitos (22,6%), oenocitóides (20,4%), esferulócitos (14,5%), prohemócitos (2,3%) e vermiformes (1,5%). O número total de hemócitos mostrou um aumento significativo durante o período larval estudado.

Insecta; lagarta da soja; hemolinfa; morfologia; quantificação de hemócitos


The occurrence of Anticarsia gemmatalis (Hübner, 1932) larvae resistant to the virus AgMNPV in laboratory led to the study of the hemocytes of this insect, in order to evalue its participation in the mechanisms which enables the resistance to the virus. The resistant larvae with 6 to 11 developmental days old (3rd to 5th instars) were anesthetized by cold and after that were quickly cleaned in 70% alcohol. The hemolymph was collected through abdominal puncturing; the morphological analysis was made in phase contrast and colored smears with Seller solution. The total hemocytes counting (THC), was made in modified Neubauer chamber with not diluted hemolymph. For the differential hemocytes counting (DHC), was used diluted hemolymph in anticoagulant solution for insects. Six hemocytes types were identified: plasmatocytes (38.5%), granulocytes (22.6%), oenocytoids (20.4%), spherulocytes (14.5%), prohemocytes (2.3%) and vermiform (1.5%). The total number of hemocytes showed a significant increase during the studied larval period.

Insecta; velvetbean caterpillar; hemolymph; morphology; hemocytes counting


Caracterização citológica dos hemócitos de Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera, Noctuidae) em larvas resistentes ao vírus AgMNPV

Citological characterization of the Anticarsia gemmatalis (Lepidoptera, Noctuidae) hemocytes in resistant larvae to the virus AgMNPV

Maria C. C. de NegreiroI; Renata B. R. CarvalhoI; Fábio G. de AndradeI; Sheila M. LevyI; Flávio MoscardiII; Ângela M. F. FalleirosI

IDepartamento de Histologia, Centro de Ciências Biológicas, Universidade Estadual de Londrina, Rodovia Celso Garcia Cid Km 380, Caixa Postal 6001, 86051-990 Londrina, PR, Brasil. (angefal@uel.br)

IIEMBRAPA Soja, Rodovia Carlos João Strass - Distrito de Warta, Caixa Postal 231, 86001-970 Londrina, PR, Brasil. (moscardi@cnpso.embrapa.br)

RESUMO

A ocorrência de larvas de Anticarsia gemmatalis (Hübner, 1932) resistentes ao vírus AgMNPV em laboratório levou ao estudo dos hemócitos deste inseto para avaliar sua participação nos mecanismos que possibilitam a resistência ao vírus. As larvas resistentes com 6 - 11 dias de desenvolvimento (3º a 5º instar) foram anestesiadas por resfriamento e rapidamente limpas em álcool 70%. A hemolinfa foi coletada através de punção abdominal, a análise morfológica foi realizada em contraste de fase e esfregaços corados com solução de Seller. A contagem total de hemócitos (CTH) foi realizada em câmara de Neubauer com hemolinfa não diluída. Para a contagem diferencial de hemócitos (CDH), utilizou-se hemolinfa diluída em solução anticoagulante para insetos. Foram identificados seis tipos de hemócitos: plasmatócitos (38,5%), granulócitos (22,6%), oenocitóides (20,4%), esferulócitos (14,5%), prohemócitos (2,3%) e vermiformes (1,5%). O número total de hemócitos mostrou um aumento significativo durante o período larval estudado.

Palavras-chave: Insecta, lagarta da soja, hemolinfa, morfologia, quantificação de hemócitos.

ABSTRACT

The occurrence of Anticarsia gemmatalis (Hübner, 1932) larvae resistant to the virus AgMNPV in laboratory led to the study of the hemocytes of this insect, in order to evalue its participation in the mechanisms which enables the resistance to the virus. The resistant larvae with 6 to 11 developmental days old (3rd to 5th instars) were anesthetized by cold and after that were quickly cleaned in 70% alcohol. The hemolymph was collected through abdominal puncturing; the morphological analysis was made in phase contrast and colored smears with Seller solution. The total hemocytes counting (THC), was made in modified Neubauer chamber with not diluted hemolymph. For the differential hemocytes counting (DHC), was used diluted hemolymph in anticoagulant solution for insects. Six hemocytes types were identified: plasmatocytes (38.5%), granulocytes (22.6%), oenocytoids (20.4%), spherulocytes (14.5%), prohemocytes (2.3%) and vermiform (1.5%). The total number of hemocytes showed a significant increase during the studied larval period.

Keywords: Insecta, velvetbean caterpillar, hemolymph, morphology, hemocytes counting.

A cultura da soja é de grande importância para o complexo agroindustrial do Brasil e estrategicamente os incentivos científicos e tecnológicos para aumento da qualidade e produtividade deste grão têm sido intensificados. O combate às pragas que atacam a soja é cada vez mais criterioso, sendo que o controle da lagarta da soja, Anticarsia gemmatalis (Hübner, 1932) é realizado preferencialmente pela utilização de um patógeno específico, o nucleopoliedrovírus multicapsídeo Baculovirus anticarsia (AgMNPV) (MOSCARDI & SOUZA, 2002).

O uso crescente desta metodologia em laboratório e sob pressão de seleção, levou ao surgimento de larvas resistentes ao AgMNPV, o que tem preocupado os pesquisadores e gerado estudos sobre a condição de resistência destas larvas. A preocupação é procedente, uma vez que a resistência de insetos a patógenos é similar à resistência dos mesmos aos inseticidas químicos. Além disso, o número de casos de resistência em insetos-praga cresce exponencialmente e acredita-se que a lagarta da soja também possa desenvolver alguma resistência ao seu controle viral em condições naturais de campo (ABOT et al., 1996).

De modo geral, o controle biológico é efetivado com sucesso quando o patógeno consegue escapar das reações de defesa do hospedeiro. Essas reações de defesa estão intimamente relacionadas às barreiras físicas e imunológicas, sendo esta última desempenhada principalmente pelos hemócitos (RATCLIFFE & ROWLEY, 1975; BARRACO & MENEZES, 1985; GUPTA, 1985; RATCLIFFE et al., 1985; FALLEIROS & GREGÓRIO, 1995; RUSSO et al., 2001).

Apesar do alto investimento tecnológico e do amplo conhecimento sobre a biologia deste inseto, pouco se conhece sobre os mecanismos de defesa de A. gemmatalis relacionados aos hemócitos, sendo raros os relatos obtidos na literatura, como o de ANDRADE et al. (2003) em larvas suscetíveis ao AgMNPV. Além disso, na literatura não se encontram dados relacionando hemócitos e resistência em larvas de A. gemmatalis.

Assim, este trabalho teve por objetivos caracterizar morfológica e quantitativamente os hemócitos de A. gemmatalis em larvas resistentes ao AgMNPV e comparar aos dados obtidos em estudos anteriores para larvas de A. gemmatalis suscetíveis ao AgMNPV, no intuito de elucidar a participação destas células na resistência/ suscetibilidade do inseto ao vírus.

MATERIAL E MÉTODOS

Foram utilizadas larvas resistentes (LR) de 3º a 5º instar (6 a 11 dias de desenvolvimento) de A. gemmatalis provenientes do Laboratório de Entomologia da EMBRAPA Soja/Londrina, Paraná onde são criadas em condições ambientais climatizadas (temperatura 25-27ºC, umidade relativa, 80%, fotofase, 14h) e alimentadas com dieta artificial à base protéica (HOFFMANN-CAMPO et al., 1985). Os demais procedimentos foram desenvolvidos no Laboratório de Histologia da Universidade Estadual de Londrina, Paraná.

As larvas foram anestesiadas por refrigeração (0ºC, 5 min) e após rápida limpeza com álcool 70%, tiveram sua hemolinfa coletada através de punção abdominal, com auxílio de uma pipeta Pasteur, previamente embebida em solução anticoagulante para inseto (SAI) (LEONARD et al., 1985).

Para observação a fresco, uma gota de hemolinfa foi colocada em lâmina de vidro recoberta por lamínula e observada ao microscópio de luz com contraste de fase de campo escuro. Foram também feitos esfregaços de hemolinfa, secados ao ar, corados por 20 segundos em solução Seller e observados em microscopia de luz convencional.

A contagem total de hemócitos (CTH) foi realizada com hemolinfa não diluída, em câmara de Neubauer modificada. O delineamento experimental foi inteiramente casuístico com 15 repetições por idade larval. Para a contagem diferencial dos hemócitos (CDH) utilizou-se uma gota de hemolinfa diluída em SAI (1:2). O delineamento experimental foi também inteiramente casuístico sendo utilizadas 15 larvas, numa amostragem de 200 células/indivíduo, perfazendo 3.000 células por dia de desenvolvimento.

Os dados da CTH e da CDH foram analisados através do teste de Kruskall-Wallis, complementado por Dunn, segundo ZAR (1996), com 5% de significância.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

Foram identificados seis tipos de hemócitos presentes na hemolinfa de larvas resistentes de A. gemmatalis: plasmatócitos (PL), granulócitos (GR), esferulócitos (ES), vermiformes (VE), prohemócitos (PR) e oenocitoides (OE), em contraste de fase (Fig. 1) e em esfregaços de hemolinfa (Fig. 2).



Os plasmócitos eram células polimórficas, apresentando projeções citoplasmáticas; citoplasma abundante e homogêneo; núcleo central, arredondado ou ovalado e nucléolo evidente.

Os granulócitos apresentaram formato arredondado ou oval, tamanhos variáveis e projeções citoplasmáticas filopodiais (PF, Fig. 1). O citoplasma apresentou grânulos com dimensões variáveis, sendo em sua maioria incolores nos esfregaços e com diferentes graus de refringência nos preparados a fresco. O núcleo era central e arredondado.

Os oenocitoides eram células esféricas, de tamanhos variáveis, apresentando-se como o maior tipo celular. Seu citoplasma era homogêneo nas observações a fresco e apresentou pontuações fortemente coradas em azul nos esfregaços. O núcleo destas células era pequeno e excêntrico. Em contraste de fase, foi possível distinguir duas subpopulações de OE. Um grupo caracterizado por apresentar um processo de retração e escurecimento do citoplasma e (após alguns minutos de observação) escurecimento das regiões circunvizinhas às células. O outro grupo apresentou agregação de pontos escurecidos na periferia do citoplasma (GP, Fig. 1) e posterior extrusão do seu núcleo (EN, Fig. 1).

Os esferulócitos apresentaram formas que variaram de arredondadas a elípticas, desprovidos de projeções citoplasmáticas. Em contraste de fase, apresentaram grande quantidade de esférulas citoplasmáticas salientes e refringentes. Nos esfregaços tais esférulas apresentaram coloração variável, de róseo a azul. O núcleo era pequeno, esférico, central e muitas vezes camuflado pelas esférulas.

Os prohemócitos foram as menores células observadas, com formato arredondado e sem projeções citoplasmáticas. Seu citoplasma homogêneo e escasso formava um halo ao redor do núcleo, que era central e volumoso.

As vermiformes eram células com formato fusiforme, com superfície celular lisa, com núcleo alongado e central.

A CTH demonstrou que o número total de hemócitos por volume de hemolinfa aumenta ao longo do período larval considerado (Tab. I).

A frequência média dos tipos de hemócitos determinada pela CDH pôde ser expressa como PL>GR>OE>ES>PR>VE (Tab. II).

Dos seis tipos de hemócitos encontrados na hemolinfa de larvas de A. gemmatalis resistentes (LR) ao AgMNPV, cinco tipos (PL, GR, ES, PR e VE) apresentaram morfologia semelhante à descrita por ANDRADE et al. (2003), que trabalharam com larvas suscetíveis de A. gemmatalis (LS) ao AgMNPV. Nossos resultados também estão em concordância com o descrito pela maioria dos autores para outros lepidópteros, como AKAI & SATO, 1976; BARDUCO et al., 1988; SAXENA et al., 1988; GENG & DUNN, 1989; BOMBONATO & GREGÓRIO, 1995; RIBEIRO et al., 1996; STRAND & JOHNSON, 1996; RICHARDS & EDWARDS, 1999; YAMASHITA & IWABUCHI, 2001.

Fato interessante foi o observado para os oenocitóides. Embora a morfologia seja a mesma relatada para LS por ANDRADE et al. (2003), foi possível verificar em LR algumas diferenças comportamentais neste tipo celular, o que nos indica a existência, nesta larva, de duas subpopulações.

Vários autores como CROSSLEY (1979), FALLEIROS et al. (2003), KURIHARA et al. (1992b), LAVINE & STRAND (2002), TANADA & KAYA (1993) relacionaram o comportamento de retração e escurecimento citoplasmático, exibido por alguns OE, inerente ao processo de melanização e à participação destas células no sistema de profenoloxidase (proPO). Esta enzima está diretamente relacionada com a produção de fenoloxidase, que atua no sistema de defesa do inseto contra patógenos (SÖDERHÄLL, 1982). Assim, podemos inferir que as alterações exibidas pelos OE podem estar relacionadas à resistência das larvas de A. gemmatalis ao nucleopoliedrovírus AgMNPV.

Quanto aos dados obtidos na CTH, nossos resultados em LR são discordantes dos encontrados nas LS, por ANDRADE et al. (2003), que relataram uma diminuição no número de hemócitos durante o período larval. Deste modo, a resistência deste inseto também pode ser atribuída ao maior número de hemócitos por volume de hemolinfa observado. Este fato é corroborado por autores como MOSCARDI (1988) e ABOT et al., (1996) que relacionam a resistência à patógenos à maior eficiência dos mecanismos de defesa nos insetos. Além disso, é sabido que a virulência do AgMNPV diminui ao longo do desenvolvimento larval (MOSCARDI, 1988; MOSCARDI & CARVALHO, 1993), possivelmente contribuindo para os mecanismos de resistência.

Os resultados obtidos pela CDH são concordantes com as informações constantes na literatura que apontam PL e GR, como os hemócitos mais abundantes em várias espécies de insetos (GUPTA, 1979, 1985; RIBEIRO et al., 1996; RICHARDS & EDWARDS, 1999; YAMASHITA & IWABUCHI, 2001). Também foram concordantes com os encontrados por ANDRADE et al. (2003) para as LS.

Considerando a frequência média de ES, nossos resultados apontaram percentuais inferiores aos descritos para LS por ANDRADE et al. (2003), que descreveram frequência média de 20,9% para este tipo celular. À semelhança de ANDRADE et al. (2003), outros autores (ARNOLD & HINKS, 1976; BARRACCO & MENEZES, 1985; BARDUCO et al., 1988; DRIF & BREHÉLIN, 1993; BOMBONATO & GREGÓRIO, 1995; EDWARDS, 2004) também citam os ES como o terceiro tipo celular mais frequente nos insetos por eles estudados.

Esta frequência encontrada para os ES poderia ser explicada pelo aumento significativo de OE, sugerindo uma possível compensação entre estes tipos de hemócitos. Entretanto na literatura não existem informações sobre tal mecanismo de compensação.

Os OE em larvas resistentes apresentaram frequência superior, sendo o terceiro tipo mais encontrado. Esta frequência também é alta quando comparada à de outros lepidópteros: Bombyx mori Linnaeus, 1758 (NITTONO, 1960), Hyalophora cecropia Linnaeus, 1758 (LEA & GILBERT, 1966), Euxoa declarata Walker, 1865 (ARNOLD & HINKS, 1976), Pieris rapae crucivora Linnaeus, 1758 (TAKADA & KITTANO, 1971), Spodoptera litura Fabricius, 1775 (KURIHARA et al., 1992a), Lacanobia oleracea Linnaeus, 1758 (RICHARDS & EDWARDS, 1999), Diatraea saccharalis Fabricius, 1794 (BARDUCO et al., 1988; BOMBONATO & GREGÓRIO, 1995; FALLEIROS et al., 2003), onde este tipo celular apresentou valores médios inferiores a 10%.

A frequência de OE em LR foi também superior ao encontrado por ANDRADE et al. (2003) em LS. Assim, podemos sugerir que os OE contribuem para o desenvolvimento da resistência das LR. Entretanto, como na literatura não existem relatos correlacionando este tipo celular com a resistência a patógenos, outros estudos deverão ser conduzidos visando elucidar sua efetiva participação nos mecanismos de defesa do inseto à infecção viral.

Os outros tipos celulares descritos e quantificados com baixa frequência (PR e VE, respectivamente) também são citados como células pouco abundantes nos insetos. Os resultados apresentados por estes hemócitos em LR estão em concordância com o descrito por inúmeros autores (GUPTA, 1979, 1985; GUPTA & SUTHERLAND, 1966; KURIHARA et al., 1992a; AHMAD, 1993; BOMBONATO & GREGÓRIO, 1995; YAMASHITA & IWABUCHI, 2001; FALLEIROS et al., 2003) para outras espécies, bem como o descrito para LS de A. gemmatalis por ANDRADE et al. (2003).

A caracterização citológica da maioria dos hemócitos das LR de A. gemmatalis, mostrou-se semelhante à das LS, com exceção dos OE que apresentaram características morfológicas e quantitativas diferenciadas nas LR, permitindo inferir que este tipo celular está envolvido na resistência deste inseto ao vírus. Além disso, pode-se considerar que o elevado número de hemócitos por volume de hemolinfa também contribui para esta resistência.

Agradecimentos. Ao CNPq pelo suporte financeiro, à EMBRAPA Soja pelo fornecimento das larvas de A. gemmatalis e da dieta artificial, à Inês Cristina B. da Fonseca pelo auxílio nas análises estatísticas e à Danielle B. Rissi pelo apoio técnico.

Recebido em janeiro de 2007.

Aceito em julho de 2008.

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Datas de Publicação

  • Publicação nesta coleção
    24 Jul 2009
  • Data do Fascículo
    Mar 2009

Histórico

  • Aceito
    Jul 2008
  • Recebido
    Jan 2007
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