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Revista Brasileira de Entomologia

Print version ISSN 0085-5626On-line version ISSN 1806-9665

Rev. Bras. entomol. vol.52 no.4 São Paulo  2008

http://dx.doi.org/10.1590/S0085-56262008000400008 

SISTEMÁTICA, MORFOLOGIA E BIOGEOGRAFIA

 

Descripción del ARN de transferencia mitocondrial para Serina (UCN) de Lutzomyia columbiana (Diptera, Psychodidae)

 

Description of the mitochondrial serine transfer RNA (UCN) of Lutzomyia columbiana (Diptera, Psychodidae)

 

 

Alveiro Pérez-DoriaI; Eduar Elías BejaranoI; Iván Darío VélezII

IGrupo de Investigaciones Biomédicas, Universidad de Sucre, Cra. 14 No. 16B-32, A.A. 406, Sincelejo, Colombia. eduarelias@yahoo.com
IIPrograma de Estudio y Control de Enfermedades Tropicales PECET, Universidad de Antioquia, Calle 62 No. 52-59, A.A. 1226, Medellín, Colombia

 

 


RESUMEN

Lutzomyia columbiana es un flebotomíneo considerado como vector sospechoso de Leishmania mexicana y Leishmania braziliensis en Colombia. Este insecto pertenece al grupo verrucarum, que incluye algunos taxones isomórficos, lo que ha estimulado la búsqueda de marcadores moleculares que permitan, además de diferenciar las especies, estudiar sus relaciones de parentesco. En este artículo se describe por primera vez la estructura putativa del ARN de transferencia mitocondrial para serina que reconoce el codón UCN (ARNtSer) de Lu. columbiana. El ADN genómico fue extraído, amplificado y secuenciado a partir de seis especímenes colectados con cebo humano. La estructura secundaria del ARNtSer fue inferida con el programa tRNAscan-SE 1.21. El gen ARNts consistió de 67 pares de bases (pb), encontrándose un solo haplotipo en los seis individuos secuenciados. El ARNtSer de Lu. columbiana mostró 7 apareamientos intracatenarios en el brazo aceptor del aminoácido, 3 en el brazo dihidrouridina (DHU), 5 en el brazo del anticodón y 5 en el brazo ribotimidina-pseudouridina-citosina (TøC). El tamaño de las lupas correspondió a 5 nucleótidos en la DHU, 7 en la anticodón, 4 en la variable y 7 en la TøC. Lu. columbiana se distingue del resto de especies de Lutzomyia y Phlebotomus secuenciadas a la fecha por la presencia de una guanina en la posición nucleotídica 64, que produce un apareamiento no canónico tipo uracilo-guanina en el brazo aceptor. Se necesitan más estudios para confirmar la utilidad del ARNtSer como marcador molecular para la discriminación de especies de flebotomíneos.

Palabras-clave: Flebotomíneo; Colombia; genética; leishmaniosis; taxonomía molecular.


ABSTRACT

The sand fly Lutzomyia columbiana is considered a suspected vector of Leishmania mexicana and Leishmania braziliensis in Colombia. Lu. columbiana belongs to the Lutzomyia verrucarum species group, which included some sibling species. This has motivated the search for molecular markers to distinguish these taxa. In this paper, we described for the first time the putative secondary structure of the mitochondrial serine transfer RNA that recognizes the codon UCN of Lu. columbiana (tRNASer). DNA was extracted, amplified and sequenced from six individuals collected in human biting activity. The secondary structure of the tRNASer was inferred using the program tRNAscan-SE 1.21. The tRNASer gene length was 67 pair of bases (pb), and a single haplotype was detected among the six specimens sequenced. In the inferred secondary structure of the tRNASer of Lu. columbiana, the acceptor arm consisted of 7 bp, the dihydrouridine (DHU) arm of 3 pb, the anticodon arm of 5 pb, and the ribothymidine-pseudouridine-cytosine (TøC) arm of 5 pb. Similarity, the estimated size of the loops was 5 nucleotides in the DHU, 7 in the anticodon, 4 in the variable, and 7 in the TøC. Lu. columbiana differs from other Lutzomyia and Phlebotomus species sequenced to date by the presence of guanine in the nucleotide position 64, which induce a non-canonical base pair conformation type uracil-guanine in the acceptor arm. More studies are necessary to confirm the usefulness of the tRNASer as a suitable molecular tool for sand fly species identification.

Keywords: Colombia; genetics; leishmaniasis; molecular taxonomy; sand fly.


 

 

Lutzomyia columbiana (Ristorcelli y Van Ty, 1941) es un flebotomíneo endémico de Colombia, con una distribución geográfica que se extiende desde los bosques húmedos del Nudo de Los Pastos, pasando por las Cordilleras Occidental y Central, hasta zonas esteparias de La Guajira, en un amplio rango altitudinal que va de los 100 a 2700 msnm (Bejarano et al. 2003). Este insecto ha sido asociado con la transmisión del parásito tripanosomatídeo Leishmania mexicana en un foco de leishmaniosis cutánea del suroccidente del país (Montoya-Lerma et al. 1999). Mediante ensayos experimentales en laboratorio se ha comprobado, además, su susceptibilidad a la infección por Leishmania braziliensis Vianna, 1911 (Warburg et al. 1991) y Leishmania mexicana Biagi, 1953 (Arroyo y Garzón 1996; Montoya-Lerma et al. 1999). Igualmente, se sospecha que este flebotomíneo participó en la transmisión de la bacteria Bartonella bacilliformis (Strong et al. 1913) durante un brote de bartonelosis humana registrado en el departamento de Nariño, entre finales de la década de los treinta y principios de los cuarenta (Rozeboom 1947).

Desde el punto de vista taxonómico, Lu. columbiana pertenece al grupo verrucarum Theodor, 1965 (Bejarano et al. 2003), taxón considerado como subgénero Pifanomyia Ortiz y Scorza, 1963, por algunos autores (Galati et al. 2003). Éste incluye varias especies que exhiben una alta semejanza morfológica en uno de los sexos, la cual limita su identificación con las claves taxonómicas tradicionales. Debido a la importancia epidemiológica de estos insectos y a los problemas que afronta la determinación de especie, se han usado tanto genes nucleares como mitocondriales para diferenciar las especies y explorar sus relaciones de parentesco (Bejarano 2001; Rojas 2001; Testa et al. 2002; Beati et al. 2004). Los genes mitocondriales secuenciados a la fecha en Lutzomyia spp. son citocromo b, citocromo oxidasa I, las subunidades 1 y 4 del complejo NAD deshidrogenada, la subunidad pequeña ribosomal y el ARN mitocondrial de transferencia para serina (Ready et al. 1997; Suguri et al. 1997; Uribe et al. 2001; Ishikawa et al. 1999; Bejarano 2001; Rojas et al. 2001; Arrivillaga et al. 2002; Testa et al. 2002; Torgerson et al. 2003; Beati et al. 2004; Vivero et al. 2007). En años recientes el último gen ha empezado a ser valorado como marcador molecular demostrando, de forma preliminar, su utilidad en la caracterización genética y el diagnóstico de especie. Aunque aún se desconoce la estructura primaria y secundaria de la mayoría de los ARN de transferencia que actúan en la mitocondria de los flebotomíneos, se plantea que por su patrón de evolución podrían ser útiles para la distinción de algunas especies dentro del grupo verrucarum. En el presente artículo se describe la estructura secundaria putativa del ARN de transferencia mitocondrial para serina que reconoce el codón UCN (ARNtSer) de Lu. columbiana.

 

MATERIALES Y MÉTODOS

El material entomológico se recolectó entre las 18:00 y las 22:00 horas con cebo humano protegido en un bosque secundario de la vereda El Vallano, en el municipio de Envigado, departamento de Antioquia. Esta zona exhibe condiciones de bosque húmedo tropical, con una pluviometría anual de aproximadamente 1937 mm, temperatura de 16,8ºC y humedad relativa de 85,8%. Los flebotomíneos se transportaron secos hasta el laboratorio de entomología del Programa de Estudio y Control de Enfermedades Tropicales - PECET, donde fueron conservados a -20ºC con el propósito de prevenir la degradación del DNA.

Para el diagnóstico de especie se separó la cabeza, un ala y los últimos segmentos del abdomen de cada espécimen. Estas estructuras se montaron sobre láminas portaobjeto con el medio de Hoyer y están depositadas en la "Colección de Vectores y Hospedadores Intermediarios de Enfermedades Tropicales (VHET)" del PECET de la Universidad de Antioquia, en Medellín, Colombia, bajo los códigos P2465, P2466, P2467, P2468, P2469 y P2470. La identificación morfológica se fundamentó en las claves taxonómicas de Young y Duncan (1994) y Galati (2003).

Para los procedimientos de biología molecular se empleó el tórax y los segmentos proximales de abdomen, a partir de los cuales se extrajo el DNA siguiendo el protocolo descrito por Collins et al. (1987), que incluye maceración en 60 µl del tampón de lisis (0.08 NaCl, 0.16 M Sacarosa, 0.06 M EDTA, 0.5% SDS, 0.1 M Tris-HCL a pH de 7.5), precipitación con 200 µl de etanol absoluto y resuspensión en 30 µl de agua estéril. La técnica de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se efectuó a partir de un volumen de 6 µl de la solución de ADN extraído, a la que se adicionó tampón PCR 1x (Promega Corporation, Madison, WI), 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM de la mezcla de desoxirribonucleótidos (Promega), 0.3 mM de cada cebador y 1.5 U de Taq DNA polimerasa (Promega), hasta alcanzar un volumen final de 50 ml con H2O.

Los cebadores sentido 5'-CA(T/C)ATTCAACC(A/T)GAATGATA-3' y antisentido 5'-GGTA(C/T)(A/T)TTGCCTCGA(T/A)TTCG(T/A)TATGA-3' usados para amplificar el gen ARNtSer de Lu. columbiana tienen como secuencia blanco el extremo 3' del gen citocromo b y el extremo 3' del gen subunidad 1 de la NADH deshidrogenada (NAD1), respectivamente (Ready et al. 1997). La complementariedad de ambos cebadores con el extremo 3' se debe a que los genes citocromo b y NAD1 deshidrogenasa codifican a partir de cadenas opuestas, por lo tanto se transcriben en direcciones contrarias.

Los productos amplificados se secuenciaron directamente en un equipo de electrofóresis capilar ABI 3730xl, el cual emplea cuatro dideoxinucleótidos terminadores de cadena marcados con grupos fluorescentes. Las secuencias obtenidas en ambos sentidos de la doble hélice del ADN se editaron con el programa MEGA 3.1 (Kumar et al. 2004), para generar una secuencia consenso por individuo. Posteriormente, las secuencias se alinearon usando la opción Clustal-W (Thompson et al. 1994) incorporada en MEGA. A partir del alineamiento se derivó la composición nucleotídica del gen. La estructura secundaria putativa del ARNtSer de Lu. columbiana se obtuvo con el programa tRNAscan-SE 1.21 (Lowe y Eddy 1997) y se graficó manualmente. Por último, la molécula generada se comparó con la estructura secundaria del ARNtSer de otras especies del género Lutzomyia (Pérez-Doria et al. 2008; Vivero et al. 2007).

 

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

En el territorio colombiano están registradas 143 especies de Lutzomyia (Bejarano 2006, Bejarano et al. 2006), sin embargo, hasta el momento sólo se ha publicado la estructura secundaria del ARNtSer de Lu.trinidadensis (Newstead, 1922), Lu. panamensis (Shannon, 1926), Lu. cayennensis cayennensis (Floch y Abonnenc, 1941), Lu. dubitans (Sherlock, 1962), Lu. gomezi (Nitzulescu, 1931), Lu. rangeliana (Ortíz, 1952), Lu. evansi (Núñez-Tovar, 1924), Lu. pia (Fairchild y Hertig, 1961), Lu. tihuiliensis Le Pont, Torrez-Espejo & Dujardin 1997, y Lu. hartmanni (Fairchild y Hertig, 1957) (Vivero et al. 2007; Pérez-Doria et al. 2008). Este trabajo constituye, por lo tanto, la primera descripción de la estructura secundaria del ARNtSer mitocondrial de Lu. columbiana. La secuencia de nucleótidos del gen ARNtSer se obtuvo a partir de seis especímenes recolectados mientras intentaban picar al humano. Estas secuencias se encuentran registradas en Genbank con los números de acceso EF033636, EF033637, EF033638, EF033639, EF033640 y EF033641.

El gen mitocondrial ARNtSer de Lu. columbiana exhibe una longitud de 67 pares de bases (pb), consistente con lo descrito en otras especies de Lutzomyia cuyo tamaño varía entre 66 y 69 pb (Vivero et al. 2007). Todos los nucleótidos que conforman este gen son de codificación exclusiva, es decir, el mismo no comparte bases con genes mitocondriales adyacentes. De esta forma el extremo 5' del gen ARNtSer de Lu. columbiana se encuentra separado del gen citocromo b por el espaciador intergénico 1, mientras que el espaciador intergénico 2 se interpone entre su extremo 3' y el gen NAD1. Como era de esperarse para un gen mitocondrial, la composición nucleotídica estuvo dominada por los nucleótidos adenina y timina que constituyeron el 79,1%, con la consiguiente baja representación de guanina y citosina que sólo alcanzaron un 20,9%, lo cual demuestra que el contenido nucleotídico no obedece a factores aleatorios sino que está notoriamente conservado.

En la figura 1 se muestra la estructura secundaria putativa del ARNtSer de Lu. columbiana, que está constituido por el brazo aceptor del aminoácido, el brazo y la lupa dihidrouridina (DHU), el brazo y la lupa del anticodón, la lupa variable, y el brazo y la lupa ribotimidina-pseudouridina-citosina (TøC). El tamaño de las lupas correspondió a 5 nucleótidos en la DHU, 7 en la anticodón, 4 en la variable y 7 en la TøC. Similarmente, el brazo aceptor del aminoácido mostró 7 apareamientos intracatenarios, el brazo DHU 3, el brazo del anticodón 5 y el brazo TøC 5. El brazo aceptor del aminoácido y el brazo DHU se encuentran separados por dos adeninas y a su vez el brazo DHU está distanciado del brazo anticodón por una adenina. En el brazo aceptor y del anticodón es notable la presencia de apareamientos no canónicos tipo uracilo-guanina (U-G) y uracilo-uracilo (U-U), respectivamente, asociaciones de bases que normalmente son determinantes en la formación de la estructura terciaria de los ARNt y en su interacción con otras macromoléculas (Leontis et al. 2002).

 

 

En los seis individuos secuenciados de Lu. columbiana se encontró un solo haplotipo nucleotídico para el gen ARNtSer, lo que refleja la conservación evolutiva de esta molécula a nivel intraespecífico, denotando una baja dinámica mutacional como una probable consecuencia de las complejas restricciones que operan el reconocimiento e interacción de la estructura tridimensional del ARNtSer y su función fisiológica. En la posición nucleotídica 64 del gen se observa la presencia de una guanina que distingue a Lu. columbiana del resto de las especies flebotomíneas americanas analizadas hasta ahora (figura 2), las cuales presentan una adenina en ese lugar (Pérez-Doria et al. 2008; Vivero et al. 2007). El cambio de este nucleótido genera el apareamiento no canónico U-G en el brazo del anticodón (figura 1), que surge dos posiciones antes de los uracilos, los cuales son reemplazados por los nucleótidos citosina, citosina y adenina durante la maduración del ARNtSer, constituyendo el sitio de unión para el aminoácido serina.

 

 

Los porcentajes de similitud entre las secuencias de Lu. columbiana y las secuencias homólogas de Lutzomyia spp. incluidas en Genbank, obtenidos con Nucleotide Blast (Basic Local Alingment Search Tool), estuvieron en el orden de 98% con Lu. ovallesi (Ortiz, 1952) (número de acceso AF403491) y 91% con Lu. nuneztovari (Ortiz, 1954) (número de acceso AF403487). Más aún, la comparación y búsqueda con BLAST mostró que la preantepenúltima base del extremo 3' del ARNtSer de L. columbiana (figura 1), también es distinta a la de todas las especies de Phlebotomus Rondani y Berté, 1840, secuenciadas a la fecha, con porcentajes de similitud que oscilan entre el 89% con Ph. mascomai Muller, Depaquit y Léger, 2007, (número de acceso EU035612) y el 97% con Ph. papatasi (Scopoli, 1786) (número de acceso DQ381835) (Hamarsheh et al. 2007; Muller et al. 2007).

Contrariamente, al comparar el gen ARNtSer de L. columbiana de la población de Envigado, Valle de Aburrá, con el segmento homólogo (número de acceso AF403485) de ejemplares de la misma especie recolectados en La Cumbre, Valle del Cauca, se encontró un porcentaje de similitud del 100%, lo que demuestra la robustez del marcador mitocondrial para asociar individuos de la misma especie, pero que provienen de poblaciones geográficamente distantes. Esto es importante, considerando que los marcadores moleculares apropiados para el estudio del grupo verrucarum, deben tener el suficiente polimorfismo como para establecer patrones únicos que permitan discriminar las especies y, a la vez, ser muy conservados en cada taxón para agrupar individuos co-específicos.

La potencial ventaja del ARNtSer se derivaría no sólo de la variación hallada en la secuencia primaria de nucleótidos, sino también de los cambios en la estructura secundaria putativa. Sin embargo, es de notar que se necesitan más estudios genéticos para poner a prueba el poder de resolución del ARNtSer en la separación de especies morfológicamente similares. Este trabajo constituye un llamado a los sistemáticos a evaluar la utilidad de estos genes mitocondriales en la taxonomía de los insectos flebotomíneos.

Agradecimientos. Esta investigación fue financiada por la Fundación para la Promoción de la Investigación y la Tecnología del Banco de la República (código no. 1606).

 

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Recibido 08/10/2007; aceptado 21/08/2008

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