Enriquecimento e alocação de 13C em plantas de eucalipto

13C enrichment and allocation in eucalypt plants

Resumos

Nas últimas décadas, a utilização de isótopos estáveis em várias áreas de pesquisa vem se destacando, como na análise de fluxos e rotas metabólicas, análise de efeitos de estresses em plantas e, em grande escala, no estudo da matéria orgânica do solo (MOS). Estudos de alterações e dinâmica da MOS usando a variação da abundância natural do 13C requerem mudanças na razão isotópica do C. Quando não existe essa possibilidade, uma das alternativas é enriquecer o material vegetal (planta) com 13C, via fixação de 13CO2, de modo que a razão isotópica seja distinta daquela da MOS original. O objetivo deste trabalho foi investigar a magnitude e a homogeneidade do enriquecimento em 13C em diferentes componentes da planta de eucalipto. No processo de marcação, três plantas de eucalipto, com 4 meses de idade, cultivadas em solução nutritiva foram expostas a uma atmosfera enriquecida com 13CO2, em uma câmara de vidro (448 dm³), com temperatura em torno de 24 ºC. A concentração de CO2 e a razão 13C/12C foram monitoradas por um espectrômetro de massa de razão isotópica (IRMS) em amostras de ar retiradas ao longo do processo (126 dias com três pulsos de 13CO2 semanais). Após o período de marcação, as plantas foram separadas em folha (folha-fonte e folha-dreno), galho, casca, lenho e raiz e analisadas em IRMS. O resultado foi expresso em partes por mil (‰) em relação ao padrão internacional de C denominado Pee-Dee Belemnite (PDB), obtendo-se a δ13C PDB delas: folha-fonte (828,07 ‰), folha-dreno (645,72 ‰), galho (672,49 ‰), casca (691,86 ‰), lenho (632,02 ‰) e raiz (536,55 ‰). O padrão de alocação e enriquecimento de 13C entre os componentes das plantas foi homogêneo, embora com diferenças numéricas da ordem de 291 ‰ na δ13C PDB. As plantas de eucalipto mantiveram alta taxa de absorção de CO2 e, consequentemente, alta taxa fotossintética em concentrações de CO2 muito acima (180,4 mmol L-1 - 7.934 ppmv) da encontrada na atmosfera (8,64 mmol L-1 - 380 ppmv). O 13C fixado durante o dia foi liberado em menor escala na respiração noturna, em comparação com o 12C. O grau de enriquecimento com 13C obtido indica que a técnica empregada permite o enriquecimento suficiente do material para traçar o C em estudos de decomposição e estabilização de litter de eucalipto em frações da MOS.

plantas C3; plantas C4; matéria orgânica do solo; isótopo estável; marcação

In the last decades the use of stable isotopes has gained importance in several research areas, e.g., for metabolic flux and pathway analysis and studies on effects of biotic and abiotic plant stresses and on soil organic matter (SOM). Studies on the alterations and dynamics of SOM based on the variation in natural 13C abundance require variations in the C isotopic composition, which are not always observed. One alternative is to label the plant material with 13C by 13CO2 fixation, so that the C isotope ratio is different from that of native SOM. The objective of this study was to investigate the magnitude and homogeneity of 13C labeling in the different plant parts of eucalypts. Three 4-month-old eucalypt plants grown in nutrient solution were labeled, using a pulse technique. Plants were exposed to a 13CO2 enriched atmosphere in a 448 dm³ glass chamber, at around 24 ºC. The CO2 concentration and the 13C/12C ratio were monitored by gas sample analysis in an isotope ratio mass spectrometer (IRMS) during the pulse-labeling period (126 days, three 13CO2 pulses per week). After the labeling period the plants were separated in leaves (leaf-source and leaf-sink), branches, bark, stem, and roots and analyzed in an IRMS. The results were expressed in parts per one thousand (‰) relative to the Pee-Dee Belemnite standard (δ13C PDB). The δ13C PDB were: 828.07 ‰ for young leaves, 645.7 ‰ for mature leaves, 672.5 ‰ for branches, 691.9 ‰ for bark, 632.02 ‰ for stem, and 536.6 ‰ for roots. The 13C allocation and enrichment pattern among plant parts was homogeneous (statistically equal), although variations in δ13C PDB of 291 ‰ between plant parts were observed. The eucalypt plants maintained a high CO2 absorption, and consequently photosynthetic rates well above the normal atmospheric CO2 concentration (8.64 mmol L-1 - 380 ppmv), even at high CO2 concentrations (180.4 mmol L-1 - 7.934 ppmv). The 13C fixed during the day was proportionally less respired at night in comparison to 12C. The degree of 13C enrichment obtained indicates that the technique allows a sufficient plant enrichment to trace C in studies of litter decomposition and eucalypt litter stabilization in SOM fractions.

C3 plants; C4 plants; soil organic matter; stable isotope; labelling

COMISSÃO 2.4 - QUÍMICA DO SOLO

Enriquecimento e alocação de ¹³C em plantas de eucalipto¹

¹³ C enrichment and allocation in eucalypt plants

Daniel Nolasco Machado^I; Roberto Ferreira Novais^{II, V}; Ivo Ribeiro da Silva^{II, V}; Marcelo Ehlers Loureiro^{III, V}; João José Milagres^IV; Emanuelle Mercês Barros Soares^II

^IMestre em Solos e Nutrição de Plantas, Departamento de Solos, Universidade Federal de Viçosa - UFV. Av. PH. Rolfs s/n, CEP 36570-000 Viçosa (MG). E-mail: [e-mail]

^IIProfessor do Departamento de Solos, UFV. E-mails: [e-mail]; [e-mail]; [e-mail]

^IIIProfessor do Departamento de Biologia Vegetal, UFV. E-mail: [e-mail]

^IVMestre em Solos e Nutrição de Plantas, Departamento de Solos, UFV. E-mail: [e-mail]

^VBolsistas do CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico

RESUMO

Nas últimas décadas, a utilização de isótopos estáveis em várias áreas de pesquisa vem se destacando, como na análise de fluxos e rotas metabólicas, análise de efeitos de estresses em plantas e, em grande escala, no estudo da matéria orgânica do solo (MOS). Estudos de alterações e dinâmica da MOS usando a variação da abundância natural do ¹³C requerem mudanças na razão isotópica do C. Quando não existe essa possibilidade, uma das alternativas é enriquecer o material vegetal (planta) com ¹³C, via fixação de ¹³CO₂, de modo que a razão isotópica seja distinta daquela da MOS original. O objetivo deste trabalho foi investigar a magnitude e a homogeneidade do enriquecimento em ¹³C em diferentes componentes da planta de eucalipto. No processo de marcação, três plantas de eucalipto, com 4 meses de idade, cultivadas em solução nutritiva foram expostas a uma atmosfera enriquecida com ¹³CO₂, em uma câmara de vidro (448 dm³), com temperatura em torno de 24 ºC. A concentração de CO₂ e a razão ¹³C/¹²C foram monitoradas por um espectrômetro de massa de razão isotópica (IRMS) em amostras de ar retiradas ao longo do processo (126 dias com três pulsos de ¹³CO₂ semanais). Após o período de marcação, as plantas foram separadas em folha (folha-fonte e folha-dreno), galho, casca, lenho e raiz e analisadas em IRMS. O resultado foi expresso em partes por mil (‰) em relação ao padrão internacional de C denominado Pee-Dee Belemnite (PDB), obtendo-se a δ¹³C_PDB delas: folha-fonte (828,07 ‰), folha-dreno (645,72 ‰), galho (672,49 ‰), casca (691,86 ‰), lenho (632,02 ‰) e raiz (536,55 ‰). O padrão de alocação e enriquecimento de ¹³C entre os componentes das plantas foi homogêneo, embora com diferenças numéricas da ordem de 291 ‰ na δ¹³C_PDB. As plantas de eucalipto mantiveram alta taxa de absorção de CO₂ e, consequentemente, alta taxa fotossintética em concentrações de CO₂ muito acima (180,4 mmol L^-1 - 7.934 ppmv) da encontrada na atmosfera (8,64 mmol L^-1 - 380 ppmv). O ¹³C fixado durante o dia foi liberado em menor escala na respiração noturna, em comparação com o ¹²C. O grau de enriquecimento com ¹³C obtido indica que a técnica empregada permite o enriquecimento suficiente do material para traçar o C em estudos de decomposição e estabilização de litter de eucalipto em frações da MOS.

Termos de indexação: plantas C₃, plantas C₄, matéria orgânica do solo, isótopo estável, marcação.

SUMMARY

In the last decades the use of stable isotopes has gained importance in several research areas, e.g., for metabolic flux and pathway analysis and studies on effects of biotic and abiotic plant stresses and on soil organic matter (SOM). Studies on the alterations and dynamics of SOM based on the variation in natural ¹³C abundance require variations in the C isotopic composition, which are not always observed. One alternative is to label the plant material with ¹³C by ¹³CO₂ fixation, so that the C isotope ratio is different from that of native SOM. The objective of this study was to investigate the magnitude and homogeneity of ¹³C labeling in the different plant parts of eucalypts. Three 4-month-old eucalypt plants grown in nutrient solution were labeled, using a pulse technique. Plants were exposed to a ¹³CO₂ enriched atmosphere in a 448 dm³ glass chamber, at around 24 ºC. The CO₂ concentration and the ¹³C/¹²C ratio were monitored by gas sample analysis in an isotope ratio mass spectrometer (IRMS) during the pulse-labeling period (126 days, three ¹³CO₂ pulses per week). After the labeling period the plants were separated in leaves (leaf-source and leaf-sink), branches, bark, stem, and roots and analyzed in an IRMS. The results were expressed in parts per one thousand (‰) relative to the Pee-Dee Belemnite standard (δ¹³C_PDB). The δ¹³C_PDB were: 828.07 ‰ for young leaves, 645.7 ‰ for mature leaves, 672.5 ‰ for branches, 691.9 ‰ for bark, 632.02 ‰ for stem, and 536.6 ‰ for roots. The ¹³C allocation and enrichment pattern among plant parts was homogeneous (statistically equal), although variations in δ¹³C_PDB of 291 ‰ between plant parts were observed. The eucalypt plants maintained a high CO₂ absorption, and consequently photosynthetic rates well above the normal atmospheric CO₂ concentration (8.64 mmol L^-1 - 380 ppmv), even at high CO₂ concentrations (180.4 mmol L^-1 - 7.934 ppmv). The ¹³C fixed during the day was proportionally less respired at night in comparison to ¹²C. The degree of ¹³C enrichment obtained indicates that the technique allows a sufficient plant enrichment to trace C in studies of litter decomposition and eucalypt litter stabilization in SOM fractions.

Index terms: C₃ plants, C₄ plants, soil organic matter, stable isotope, labelling.

INTRODUÇÃO

Nas últimas décadas, a utilização de isótopos estáveis em várias áreas de pesquisa vem se destacando, como na análise de fluxos e rotas metabólicas (Ratcliffe & Shachar-Hil, 2006), análise de efeitos de estresses em plantas e, em grande escala, no estudo da matéria orgânica do solo (MOS) (Fernandes et al., 2007).

O estudo da MOS pode ser facilitado com a utilização desses isótopos estáveis como traçadores. Nesse contexto, os isótopos ¹³C e ¹⁵N têm expressiva contribuição, não somente por serem estáveis, mas porque são isótopos de dois nutrientes que possuem ciclo complexo, especialmente no sistema solo-planta (Alves et al., 2005).

As análises da composição isotópica de C são feitas medindo-se a relação de ¹³C/¹²C das amostras em relação a um padrão internacional PDB (Pee Dee

Belemnite), o qual tem relação molar de ¹³C/¹²C (R) de 0,01124. O resultado é expresso em termos da diferença de composição isotópica (δ¹³CPDB) em relação ao PDB, gerando usualmente um valor negativo, pois a relação molar ¹³C/¹²C das plantas, por exemplo, é inferior à do PDB. Como os valores de δ (delta) são muito pequenos, eles são expressos em partes por mil (‰) (O'Leary, 1981).

Na atmosfera, os valores de δ¹³CPDB do CO2 situam-se em torno de -8 ‰, e nas plantas, de -9 a -34 ‰ (Smith & Epstein, 1971). Grande parte da variação isotópica natural nas plantas resulta da discriminação isotópica durante a fotossíntese. As plantas podem ser divididas em três grupos fotossintéticos principais, cada um com seu padrão de discriminação isotópica específico: C3, C4 e CAM. A δ¹³CPDB desses diferentes grupos fotossintéticos é, em geral, resultado de propriedades bioquímicas das enzimas na fixação primária de CO2 e de limitações da difusão do CO2 dentro das folhas (Farquhar et al., 1989).

As maiores diferenças na composição isotópica de C nas plantas são observadas entre espécies que têm ciclo de carboxilação C3, seguidas das plantas C4 (Smith & Epstein, 1971).

Desse modo, o uso da abundância natural do ¹³C para identificar a origem do C do solo pressupõe que sua MOS reflita o material vegetal do qual derivou (Balesdent et al., 1987). Estudos de alterações e dinâmica da MOS usando a variação da abundância natural do ¹³C requerem mudanças na razão isotópica do C. Isso ocorre, por exemplo, quando uma espécie dominante do tipo C3 é substituída por outra(s) do tipo C4, ou vice-versa. Essa substituição tem sido útil, por exemplo, para estudar a dinâmica da MOS após a substituição da Floresta Amazônica, dominada por espécies C3, por pastagens com gramíneas, dominadas por espécies C4 (Cerri, 1986; Andreux et al., 1990; Cerri et al., 1990; Choné et al., 1991; Bernoux et al., 1999; Fernandes et al. 2007), ou em áreas de pastagens do tipo C4 em que se implantaram povoamentos de eucalipto (espécie C3) (Balieiro et al., 2008; Lima et al., 2008).

No entanto, em solos cuja MOS é constituída por compostos majoritariamente derivados de espécies C3, como em áreas onde naturalmente não ocorrem espécies do tipo C4, ou em áreas onde o cultivo do eucalipto ou de outra espécie C3 já é de longa data, o uso da variação na abundância natural do ¹³C para estudar a MOS é muito dificultado. Uma das alternativas nesses casos é enriquecer o material vegetal (planta) com ¹³C, via fixação de ¹³CO2 , de modo que a razão isotópica seja distinta daquela da MOS original.

A marcação de plantas por meio da exposição ao ¹³CO2 passou a ser utilizada na década de 1980, pois era difícil obter autorização para uso de ¹⁴C, ambientalmente perigoso (Alves et al., 2008). Estudos das transformações da palhada de arroz no solo após ser submetida a manejos distintos foram feitos com material duplamente marcado com ¹³C e ¹⁵N; o resíduo enriquecido que foi adicionado ao solo apresentava δ_PDB¹³C de 543 ‰ (Bird et al., 2002, 2003).

Não foram encontrados dados em relação à marcação de plantas de eucalipto com ¹³C em campo, talvez pela maior dificuldade de controle do processo e homogeneidade de marcação em plantas lenhosas adultas.

Para estudos das transformações e da estabilização do C derivado de resíduos vegetais no solo, poderá ser interessante que os componentes e, ou, compostos da planta possuam razão isotópica semelhante, de forma que não haja sub ou superestimação dos componentes nas frações da MOS. No entanto, esse pressuposto nem sempre é possível, visto que naturalmente já ocorre discriminação isotópica do C nas plantas. Bromand et al. (2001), estudando a partição diferencial de ¹³C em diferentes componentes das plantas, como grão, casca, caule e raízes, cultivaram plantas de trigo (Triticum aestivum), expondo-as a uma atmosfera enriquecida com ¹³CO₂. Eles observaram taxa similar de enriquecimento nos diferentes componentes da planta: grão = 3,41, casca = 3,41, caule = 3,65 e raiz = 3,50 % de átomos de ¹³C. Como a abundância de ¹³C manteve-se homogênea nos diferentes componentes da planta, esses autores concluíram que a marcação da biomassa vegetal com ¹³C pode ser importante em estudos de dinâmica e monitoramento do C no solo. Moore-Kucera & Dick (2008) marcaram mudas da arbórea "Douglas-fir" (Pseudotsuga menziesii ) com pulsos de ¹³CO2 (99 %) por oito semanas em câmara fechada resultando em enriquecimento relativamente uniforme entre os componentes da planta, atingindo 1, 57 atomo % de ¹³C nas acículas, 1,45 nos galhos e 1,36 nas raízes. As plantas controle apresentaram 1.084 atomo% de ¹³C. Esse enriquecimento foi suficiente para traçar o ¹³C em frações da MOS após a incorporação do litter marcado no solo.

Em cultivos de ciclo mais longo, como é o caso florestal, a MOS parece estar estreitamente relacionada com a sustentabilidade da produção a longo prazo (Mendham et al., 2004). A cultura do eucalipto pode proporcionar aumento nos teores da MOS ao longo dos anos de cultivo (Pegoraro, 2007; Vital, 2007; Faria et al., 2008; Lima et al., 2008). Diversos estudos têm sido realizados com relação ao melhor manejo dos resíduos da cultura, como folhas, galhos e casca, para se obter maior acúmulo de MOS. Esses componentes das plantas são constituídos de diferentes proporções de lignina, celulose e hemicelulose, que são importantes componentes formadores da MOS (Guerra et al., 2008).

Por serem os derivados da lignina mais pobres em ¹³C (Benner et al., 1987) e ela e seus derivados contribuírem substancialmente para a formação da MOS (Stevenson, 1994; Simpson et al., 2003; Kelleher et al., 2006), torna-se necessário alto nível (intensidade) de marcação com ¹³C em plantas lenhosas, em particular, para possibilitar o estudo da dinâmica da formação e degradação da MOS derivada de seus resíduos. Poucos estudos estão disponíveis sobre o método necessário para obter esse alto nível de marcação; particularmente no caso do eucalipto, não foram encontrados estudos com esse propósito.

A determinação e o melhor entendimento do enriquecimento e alocação de ¹³C nos componentes das plantas podem auxiliar no estudo da dinâmica desses compostos das plantas no solo. Portanto, o objetivo deste trabalho foi investigar a homogeneidade de enriquecimento e alocação de ¹³C nos componentes da planta de eucalipto (folha, galho, casca, lenho e raiz).

MATERIAL E MÉTODOS

Cultivo de plantas

Foram utilizadas três plantas clonais de eucalipto (híbrido de Eucalyptus grandis x E. urophylla), com 90 dias de idade, cultivadas em tubetes. Essas plantas foram transferidas para vasos de 10 L, onde foram cultivadas em solução nutritiva de Clark (1975), com sistema de aeração constante e pH mantido a 5,5, em casa de vegetação. Após um período de 30 dias nessa solução, o processo de marcação das plantas com ¹³C foi iniciado.

Marcação com ¹³C

No processo de marcação foi utilizada uma câmara de vidro (5 mm) de 448 dm³ (Figura 1), a qual continha: uma bomba de aeração para a solução nutritiva, uma placa de Petri para adicionar o H2SO4 e o Na2¹³CO3, um pequeno ventilador para homogeneização do CO2, um termômetro e dois tubos de vidro com septo de borracha na lateral da câmara: um para a adição do ácido e do carbonato e outro para a coleta de amostras de ar da câmara. Acima da câmara, havia uma haste com uma lâmpada halógena de 1.000 W, que fornecia uma irradiância de 340 μmol cm^{- 2} fótons; entre a lâmpada e a câmara, era mantida uma lâmina de água de 4 cm para restringir o aquecimento dentro da câmara proveniente da lâmpada, permitindo manter uma temperatura em torno de 24 ºC.

No primeiro dia das plantas na câmara (120 dias do início do experimento), iniciou-se o processo de marcação com ¹³C, às 13 h do dia, o que foi feito com frequência de três vezes por semana (segunda, quarta e sexta- feira) . Nesse momento, foi coletada uma amostra de 10 mL de ar da câmara, utilizando-se uma seringa cromatográfica, com o objetivo de monitorar a concentração de CO2 e a variação na composição isotópica (δ¹³C) do ar da câmara.

Posteriormente, a lâmpada foi ligada, iniciando-se a absorção do CO2 da câmara pelas plantas. Foi deixado ocorrer a absorção de CO2 por 30 a 60 min antes de iniciar os pulsos de ¹³CO2, a fim de diminuir a concentração de CO2 inicial da câmara de aproximadamente 13,64 (600 ppmv) a 17,73 mmol L^-1 (780 ppmv) para 11,37 mmol L^-1 (500 ppmv). Após esse tempo de absorção de CO2, foi coletada outra amostra de ar da câmara e foi dado o primeiro pulso de ¹³CO2, injetando-se 10 mL de uma solução de Na2¹³CO3 0,18 mol L^-1, contendo 99 % em átomos de ¹³C (Isotec Inc. Miamisburg, Ohio), com seringa cromatográfica, por meio do septo lateral, em um frasco com 50 mL de H2 SO 4 3,8 mol L^-1. O CO2 liberado foi homogeneizado na câmara selada por meio de um pequeno ventilador. Três minutos após o pulso, foi coletada outra amostra de ar da câmara. Outros quatro pulsos de ¹³CO2 foram efetuados com uma hora de intervalo; antes e após cada pulso foram coletadas amostras de ar da câmara. Uma hora após o quinto pulso, aproximadamente às 19 h do dia, a lâmpada foi desligada, iniciando-se o período escuro.

Doze horas após iniciado o período escuro, aproximadamente às 7 h do dia seguinte, foi coletada outra amostra de ar da câmara, e a lâmpada foi ligada novamente, deixando ocorrer a absorção de CO₂, acumulado na câmara como consequência da respiração das plantas no período escuro, por um tempo necessário para que aproximadamente 80 % desse CO₂ fosse absorvido. Esse tempo variou de seis a dez horas, ao longo dos 126 dias. Com isso, parte do ¹³C liberado na respiração noturna foi refixada. Após esse tempo, aproximadamente às 15 h do dia, as plantas eram retiradas da câmara de marcação e levadas para a casa de vegetação, permanecendo nesta até as 13 h do dia seguinte, quando eram trazidas de volta à câmara e reiniciada a marcação. Esse ciclo repetiu-se três vezes por semana durante 126 dias (18 semanas). As três plantas testemunha (sem marcação) foram mantidas na mesma casa de vegetação durante o período experimental.

As amostras de ar da câmara coletadas ao longo dos dias foram analisadas em espectrômetro de massa de razão isotópica (IRMS) de fluxo contínuo (20-20 ANCA-GSL, Sercon, Crewe, UK), com sensibilidade analítica de 0,3 ‰, determinando -se a variação na concentração de CO₂ e a composição isotópica (δ¹³C_PDB) do CO₂ da câmara. Para essas amostras de ar, foi utilizado como referência o CO₂ atmosférico (8,64 mmol L^-1 = 380 ppmv), determinado em amostras de 10 mL de ar do ambiente externo ao laboratório, sempre às 8 h da manhã, no início de cada semana.

A δ¹³C foi calculada com base na equação:

em que R _amostra é a relação molar ¹³C/¹²C da amostra analisada, e RPDB, a relação molar ¹³C/¹²C do padrão Pee Dee Belemnite.

Coleta e preparo de amostras de folhas para determinação da razão isotópica

No decorrer do processo de marcação (1º, 14º, 21ª, 42º, 63º, 91º, 98º e 126º dias), foram coletadas amostras de folhas-fonte (folhas maduras, completamente expandidas, cujos fotoassimilados são exportados para outros órgãos da planta, como os tecidos meristemáticos e as folhas jovens/dreno ainda não completamente autotróficas) e folhas-dreno (folhas jovens que apresentavam até 20 % da área de uma folha-fonte completamente desenvolvida e com coloração verde-escura) das plantas, para monitoramento da dinâmica do enriquecimento e posterior avaliação da eficiência deste. As folhas foram moídas, e o material resultante, passado em peneira de 0,250 mm (60 mesh) de malha, de modo a facilitar a pesagem de 1 mg de cada amostra, para análise no IRMS, obtendo-se a δ¹³CPDB delas.

Coleta e preparo das amostras de componentes das plantas para determinação da razão isotópica

Após o término do período de marcação (126º dia), as plantas foram novamente divididas em folhas-fonte e folhas-dreno e também em caule, galhos, casca e raízes, sendo as amostras liofilizadas e passadas em moinho do tipo Wiley.

O resíduo moído dos componentes das plantas foi macerado novamente para passar em peneira de 0,250 mm (60 mesh) de malha, pesando-se 1 mg de cada amostra (folha-fonte, folha-dreno, galho, casca, lenho e raiz) para determinação da δ¹³C_PDB.

Análise estatística

Os dados de enriquecimento de ¹³ C em cada componente da planta foram submetidos à análise de variância, comparando-se as médias por meio de teste de Tukey a 5 %, utilizando o software SAEG.

RESULTADOS E DISCUSSÃO

No início do processo de marcação, considerando-se os dois primeiros dias da terceira semana como exemplo (pois são representativos de todo o processo), observou-se que havia na câmara, aproximadamente, 17,6 mmol L^-1 de CO2 (Figura 2). Depois de uma hora na presença de luz, e a consequente absorção de CO2 pelas plantas, a concentração diminuiu para 12,3 mmol L^-1 (absorção de 5,3 mmol L^-1). Nesse ponto foi efetuado o primeiro pulso, com uma solução de Na2¹³CO3 na câmara, elevando para 14,1 mmol L^-1 a concentração de CO2. Daí em diante, a cada uma hora, era efetuado um pulso; antes e depois deste foram coletadas amostras de ar, para posterior análise. Ao longo do tempo de marcação foi observada absorção média de 3,8 mmol L^-1 h^-1 de CO2 pelas plantas, com incremento médio de 1,7 mmol L^-1 por pulso.

Ao fim de seis horas (cinco pulsos) de marcação, a lâmpada foi desligada, quando na câmara havia 4,9 mmol L^-1 de CO2. Após 12 h, a lâmpada foi novamente ligada; nesse momento, a concentração de CO2 na câmara subiu para 180,4 mmol L^-1 (7.934 ppmv), resultante da elevada taxa respiratória noturna.

Um resultado interessante foi o fato de as plantas absorverem CO2 mesmo com este em alta concentração na câmara (180,4 mmol L^-1). Quando a lâmpada foi ligada no dia posterior ao pulso de Na2¹³CO3, as plantas absorveram CO2 a uma taxa de 13,9 mmol L^-1 h^-1, valor esse 3,6 vezes maior do que o observado durante o processo de marcação (3,8 mmol L^-1 h^-1), quando a câmara apresentava concentração de CO2 de aproximadamente 12,5 mmol L^-1. Esses resultados indicam que, mesmo sendo a concentração de CO2 aumentada cerca de 20 vezes em comparação à concentração atmosférica, pode não ter havido fechamento estomático completo, de forma que o gradiente difusivo foi suficiente para suportar altas taxas fotossintéticas mesmo na presença de provável grande redução na abertura estomática, permitindo, ainda, aumento expressivo da concentração de CO2 nos espaços intercelulares e no interior das células-guarda, como observado por outros autores (Herrick et al., 2004; Larcher, 2004). Herrick et al. (2004) observaram redução de 28 % na condutância estomática de plantas de Liquidambar styraciflua submetidas a uma atmosfera de 13 mmol L^-1 de CO2, embora a limitação estomatal decrescesse com o aumento da concentração de CO2. Esse resultado mostra que o aumento na taxa fotossintética com a elevada concentração de CO2 mais que compensou a limitação difusional imposta pela redução da condutância estomática em alta concentração de CO2 (Tissue et al., 1995).

A composição isotópica do CO2 dentro câmara de marcação teve expressiva mudança ao longo do tempo, sempre aumentando após o pulso de Na2¹³CO3 durante o período iluminado, mas diminuindo substancialmente durante a noite (Figura 3). Isso deve ter ocorrido como resultado das reações de descarboxilação da respiração, indicando que foi respirado muito mais ¹²C do que ¹³C pelas plantas (Gillon et al., 1999).

A maior respiração de ¹²C durante a noite pelas plantas pode ser devido ao fato de que boa parte dos substratos utilizados na respiração não sejam os compostos formados e acumulados nas últimas horas, anteriores ao período noturno, quando ocorreu a marcação, mas do dia anterior, quando as plantas não tinham sido submetidas à presença do ¹³C. Se substratos respiratórios marcados tivessem sido utilizados em proporções semelhantes às dos não marcados, mesmo considerando a discriminação enzimática, não haveria redução tão pronunciada na concentração do isótopo mais pesado (¹³C). Esse resultado corrobora o encontrado por Nogués et al. (2004), os quais observaram, em folhas de feijão marcadas com ¹³C e ¹⁴ C, que amido e sacarose formados no dia anterior explicavam menos de 50 % do C perdido na forma de CO₂ na respiração noturna.

Segundo revisão de Badeck et al. (2005), vários autores relataram que, geralmente, durante a respiração noturna o CO2 liberado é enriquecido com ¹³C, comparativamente aos produtos formados na fotossíntese. Isso reforça ainda mais a presença dos efeitos do fracionamento entre ¹³C e ¹²C, normalmente observados durante a respiração noturna (Ghashghaie et al., 2003; Klumpp et al., 2005); como no presente trabalho a magnitude de liberação de ¹³CO2 durante a respiração foi menor que a liberação de ¹²CO2, pode-se inferir que a maior parte dos compostos prontamente formados durante a marcação, após 14h, não foram utilizados como substratos na respiração noturna.

Com 14 dias de marcação observou-se enriquecimento significativo das folhas-fonte e folhas-dreno das plantas; a composição isotópica (δ¹³CPDB) passou de - 29,04 ‰, no tempo zero, para 135 ‰ nas folhas-fonte e 532 ‰ nas folhas-dreno. Após 42 dias de marcação, as folhas-fonte e dreno apresentavam valores de δ¹³CPDB de 599 e 1.887, respectivamente (Figura 4). A maior δ¹³ CPDB nas folhas-dreno pode indicar translocação momentânea de açúcares prontamente formados em maior nível das folhas-fonte para as folhas-dreno e, ou, também devido à maior atividade metabólica das folhas-dreno, tendo maior demanda em fotoassimilados, como já observado em outros trabalhos (Tcherkez et al., 2003; Kristiansen et al., 2004).

Com 42 dias de marcação, tanto as folhas-fonte como as folhas-dreno apresentaram o maior nível de enriquecimento; após esse período, as plantas começaram a apresentar sintomas de estresse abiótico (Levitt, 1980), como escurecimento das raízes, epinastia dos ramos, murcha de folhas, aparecimento de estruturas parecidas com lenticelas na região próxima da inserção do pecíolo ao galho e crescimento desordenado de células na nervura principal, na parte abaxial das folhas. Com isso, o processo de marcação foi suspenso por 42 dias, período em que as plantas foram levadas para a casa de vegetação, até a completa recuperação.

No 84º dia, quando o processo de marcação foi reiniciado, as folhas-fonte e dreno apresentavam valores de δ¹³CPDB de 234 e -17 ‰, respectivamente. Esses valores indicam que houve a formação de novas estruturas foliares com mais ¹²C (como o ¹²C é o que domina na atmosfera não enriquecida da casa de vegetação, as folhas novas que cresceram nesse ambiente são mais pobres em ¹³C, ou seja, δ¹³C_PDB mais negativo); as reservas formadas com ¹³C anteriormente também foram utilizadas durante o período em que permaneceram na casa de vegetação (diluindo o ¹³C previamente fixado nas marcações), porém ainda mantendo-se um nível acima do normal desse isótopo durante o período de recuperação das plantas.

No 91º dia, as folhas-fonte apresentaram valores de δ¹³CPDB menores (233 ‰), provavelmente pelo fato de elas terem sido coletadas aleatoriamente nos ramos, podendo ter sido amostradas folhas que foram formadas na casa de vegetação durante o período de recuperação das plantas. Como não houve enriquecimento nesse período, as estruturas foliares formadas apresentaram menor valor de δ¹³C_PDB.

No final do processo de marcação, no 126º dia, a δ¹³C_PDB de folhas-fonte e dreno era de 304 e 651 ‰, respectivamente. Esses valores mostram que as plantas não conseguiram manter o mesmo nível de enriquecimento atingido até o 42º dia, podendo ser devido aos problemas surgidos no decorrer do processo, bem como ao mais avançado estádio de desenvolvimento das plantas, aliado à formação de novas estruturas e modificações na sua composição bioquímica (Raymond, 2000; Silva et al., 2005). É importante salientar que, para uma boa marcação, que irá garantir resíduo vegetal enriquecido com ¹³C, tanto compostos mais lábeis quanto estruturais e, consequentemente, mais recalcitrantes devem ser marcados na planta (Stevenson, 1994; van Vuuren et al., 2000).

Os resultados de enriquecimento das plantas com ¹³C mostram que não houve diferença estatisticamente significativa entre os componentes da planta (Quadro 1) . Todavia, em trabalhos como os de Gleixner et al. (1993); Terwilliger & Huang (1996); Scartazza et al. (1998) e Badeck et al. (2005), variações de 2 ‰ na δ¹³CPDB entre compostos e órgãos de plantas são consideradas como diferenças significativas. Desse modo, diferenças como as encontradas no presente trabalho, de até 291 ‰ entre componentes de plantas, mesmo não sendo significativas, dado o coeficiente de variação de 17 %, devem ser avaliadas com cautela. A diferença numérica encontrada no enriquecimento entre as raízes e outros componentes da planta de eucalipto (Quadro 1) de certo modo corrobora os resultados encontrados por Bird et al. (2003), os quais observaram que raízes de arroz tiveram menor enriquecimento (443 ‰), em comparação com a parte aérea (777 ‰). Essa diferença pode ser devido ao fracionamento isotópico entre ¹³C e ¹²C que ocorre durante a respiração noturna (Ghashghaie et al., 2003; Badeck et al., 2005) e também devido ao fracionamento natural que ocorre nas rotas metabólicas, onde, dependendo da posição em que o ¹³C se encontra nos compostos, pode ou não ser perdido na forma de CO2 (Gillon et al., 1999).

A tendência de menor enriquecimento e alocação de ¹³C em lenho, folhas-fonte, galho e casca pode ser devido, indiretamente, ao maior crescimento desses componentes quando do estresse abiótico ocorrido, pois no 42º dia as plantas foram levadas para a casa de vegetação, onde, depois de 42 dias de recuperação (84º dia), apresentaram expressivo crescimento. Nesse período, as plantas não foram submetidas ao processo de marcação e, consequentemente, as novas estruturas formadas não apresentavam a mesma δ¹³CPDB de quando estavam sendo marcadas. O maior enriquecimento numérico das folhas-dreno deve estar relacionado ao fato de que, no 126º dia de marcação, as folhas foram coletadas quatro horas após os pulsos de ¹³C. Dessa forma, os fotoassimilados que foram formados com mais ¹³C pouco tempo antes da coleta das folhas-fonte podem ter sido translocados para as folhas-dreno (Kozlowski & Pallardy, 1997; Taiz & Zeiger, 2004), conferindo maior teor desse isótopo nessas folhas.

As plantas não marcadas não apresentaram diferenças na composição isotópica entre seus componentes, com valores bem próximos (Quadro 1).

A δ¹³CPDB nos componentes das plantas enriquecidas com ¹³C foi, em média, de 668 ‰ em 126 dias de marcação. Stewart et al. (2009) conseguiram uma δ¹³C_PDB de 738 ‰ em resíduo de trigo, não mencionando o tempo de marcação.

Contudo, essa composição isotópica foi medida de uma solução resultante de extração em água quente, que pode ter predominância de compostos como açúcares e ácidos orgânicos de baixo peso molecular, que, quando adicionados ao solo, por exemplo, seriam mais lábeis e de mais fácil degradação (Stevenson, 1994). Portanto, resultados como esse devem ser analisados com cautela, pois a maior proporção de ¹³C alocada nesses compostos pode ser consumida rapidamente pela microbiota do solo diminuindo a marcação da MOS.

Um alto nível de marcação de resíduos de plantas, como o encontrado no presente trabalho, é desejável, para distinguir o resíduo adicionado do material presente no solo (Balesdent et al., 1987). Desse modo, o fracionamento isotópico e, ou, a perda de ¹³C na decomposição dos resíduos tenderiam a ser, proporcionalmente, menos expressivos, pois os compostos bioquímicos formados durante o processo de marcação apresentariam esqueletos carbônicos com maior proporção de ¹³C, alterando de maneira menos significativa a composição isotópica da MOS, mantendo sua marcação.

O sistema portátil de enriquecimento de plantas utilizado por Palta & Fillery (1999) e Bird et al. (2003) apresenta o inconveniente de necessitar de um IRGA para monitorar a concentração de CO2 durante todo o processo e de um sistema de fluxo para injeção e homogeneização do CO2. O sistema empregado no presente trabalho utiliza uma câmara simples de vidro, com um pequeno ventilador para homogeneização do CO2, sendo este monitorado pelo próprio espectrômetro de massas que é utilizado para análise do material vegetal.

CONCLUSÕES

1. O padrão de alocação e enriquecimento de ¹³C entre os componentes das plantas de eucalipto foi homogêneo, embora com diferenças numéricas máximas da ordem de 291 ‰ na δ¹³C_PDB.

2. As plantas de eucalipto mantiveram alta taxa de absorção de CO₂ e, consequentemente, alta taxa fotossintética em concentração de CO₂ muito acima (180,4 mmol L^-1 - 7.934 ppmv) da encontrada na atmosfera (8,64 mmol L^-1 - 380 ppmv).

3. O ¹³C fixado durante o dia foi liberado em menor escala na respiração noturna, em comparação com o 12_C.

4. A técnica de marcação empregada mostrou-se relativamente simples e eficiente no enriquecimento das plantas de eucalipto com ¹³C, porém apresenta como limitante, além do custo relativamente elevado do ¹³C, a dificuldade de monitorar continuamente o ¹³C da atmosfera da câmara. Melhorias poderão ser conseguidas no futuro com o uso de espectrômetros de cavity ring down, o que tornará possível monitorar em tempo real não apenas a concentração, mas também a razão isotópica do C na câmara.

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1

Recebido para publicação em maio de 2009 e aprovado em março de 2011.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  27 Set 2011
• Data do Fascículo
  Jun 2011

Histórico

• Aceito
  Mar 2011
• Recebido
  Maio 2009