Método de obtenção de híbridos interespecíficos entre Lycopersicon esculentum e L. peruvianum

Interspecific hybrids between Lycopersicon esculentum and L. peruvianum

Resumos

A transferência de genes da espécie silvestre Lycopersicon peruvianum para a espécie L. esculentum por processo convencional de hibridação é limitada por incompatibilidade. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um método de obtenção de híbridos entre essas duas espécies, mediante a técnica de cultura de óvulos, tendo em vista o interesse em transferir genes presentes em acessos de L. peruvianum que conferem resistência a Septoria lycopersici. Foram utilizados os acessos CNPH 946, CNPH 947 e CNPH 948 de L. peruvianum e as cultivares Floradade e Ipa-5 de L. esculentum. Sementes híbridas de frutos com 25-68 dias após a polinização foram colocadas para germinar inicialmente em meio de cultura Murashige & Skoog (MS), e posteriormente em meio HLH. As sementes foram incubadas no escuro a 25°C. Só foram regenerados os híbridos provenientes das sementes colocadas para germinar em meio HLH. Dezesseis híbridos foram obtidos de 1.573 óvulos, sendo de 1% a taxa de regeneração de plantas híbridas. As características morfológicas dos híbridos F1 quando comparadas com os dois genitores indicaram que as plantas eram realmente resultado da hibridação entre L. esculentum e L. peruvianum.

Septoria lycopersici; hibridação; cultura de óvulos; regeneração in vitro

Método de obtenção de híbridos interespecíficos entre Lycopersicon esculentum e L. peruvianum(¹)

Cláudia Silva da Costa Ribeiro(²) e Leonardo de Britto Giordano(²)

Resumo ¾ A transferência de genes da espécie silvestre Lycopersicon peruvianum para a espécie L. esculentum por processo convencional de hibridação é limitada por incompatibilidade. O objetivo deste trabalho foi desenvolver um método de obtenção de híbridos entre essas duas espécies, mediante a técnica de cultura de óvulos, tendo em vista o interesse em transferir genes presentes em acessos de L. peruvianum que conferem resistência a Septoria lycopersici. Foram utilizados os acessos CNPH 946, CNPH 947 e CNPH 948 de L. peruvianum e as cultivares Floradade e Ipa-5 de L. esculentum. Sementes híbridas de frutos com 25-68 dias após a polinização foram colocadas para germinar inicialmente em meio de cultura Murashige & Skoog (MS), e posteriormente em meio HLH. As sementes foram incubadas no escuro a 25^oC. Só foram regenerados os híbridos provenientes das sementes colocadas para germinar em meio HLH. Dezesseis híbridos foram obtidos de 1.573 óvulos, sendo de 1% a taxa de regeneração de plantas híbridas. As características morfológicas dos híbridos F₁ quando comparadas com os dois genitores indicaram que as plantas eram realmente resultado da hibridação entre L. esculentum e L. peruvianum.

Termos para indexação: Septoria lycopersici, hibridação, cultura de óvulos, regeneração in vitro.

Interspecific hybrids between Lycopersicon esculentum and L. peruvianum

Abstract ¾ With the objective of obtaining interspecific hybrids between Lycopersicon esculentum Mill. and L. peruvianum Mill., cultivars 'Floradade' and 'Ipa-5' were crossed with three accessions (CNPH 946, CNPH 947, CNPH 948) of L. peruvianum resistant to septoria leaf spot (Septoria lycopersici). Crossability barriers between these two species were overcome by using ovule culture. Putative interspecific F₁ hybrid seeds from fruits harvested 25-68 days after pollination were initially placed in contact with the MS medium and lately with the HLH medium. The immature seeds were cultured on HLH medium. Sixteen putative hybrids were obtained from a total of 1,573 ovules, thus 1.0% of the ovules that were plated germinated. The morphological characteristics of the putative hybrids and their parents indicated that the plants were truly hybrids.

Index terms: Septoria lycopersici, hybridization, ovule culture, in vitro regeneration.

Introdução

A maioria dos genes de resistência a patógenos em tomate foi introduzida por meio de cruza-mentos entre Lycopersicon esculentum com espé-cies silvestres do gênero Lycopersicon (Young & Tanksley, 1989).

L. peruvianum é a espécie com maior variabilidade dentro do gênero Lycopersicon. Abriga uma série de características interessantes, particularmente resistência a doenças e a nematóides, e alto conteúdo de vitamina C (Boukema & Den Nijs, 1984). Esta espécie foi citada como fonte de resistência à Septoria lycopersici, Cladosporium fulvum, Meloidogyne spp., Pyrenochaeta terrestris, vírus-do-mosaico-do-fumo (TMV), cálice gigante, geminivírus, vírus-do-mosaico-do-pepino (CMV), broto crespo (CTV), mosaico (potyvirus), vira-cabeça (TSWV) (Kalloo, 1991) e traça-do-tomateiro (Lourenção et al., 1984).

A transferência de genes de resistência presentes em L. peruvianum para L. esculentum, por meio do processo convencional de hibridação, é limitada por barreiras de incompatibilidade entre as duas espécies. Geralmente o estigma de L. peruvianum rejeita o pólen de L. esculentum (Kalloo, 1991). Este tipo de incompatibilidade interespecífica foi também denominada de incongruidade unilateral (Hogenboom, 1975, citado por Tigchelaar, 1986). Assim, o híbrido só pode ser obtido se L. esculentum for utilizada como genitor feminino e L. peruvianum como genitor masculino. Além disso, ocorrem barreiras pós-zigóticas que provocam a degeneração do endosperma e conseqüentemente, a morte do embrião híbrido (Barbano & Topoleski, 1984).

O primeiro sucesso de hibridação entre L. esculentum e L. peruvianum, por meio de cultura de embrião, foi obtido por Smith (1944). Híbridos interespecíficos regenerados a partir de cultura de embrião também foram obtidos por Lesley (1950), Rick (1983), Maheswaran et al. (1986) e Lai et al. (1990). No Brasil, híbridos interespecíficos entre estas duas espécies foram obtidos a partir de calos (Siqueira et al., 1988; Segeren et al., 1993).

A técnica de cultura de embrião consiste em retirar o embrião imaturo da semente e colocá-lo em meio de cultura, cuja função é a de substituir o endosperma, permitindo o desenvolvimento do embrião e a regeneração de plantas híbridas (Rick & Butler, 1956). Entretanto, a taxa de regeneração de plantas híbridas ainda é muito baixa. As barreiras pós-zigóticas envolvem mais do que simplesmente uma degeneração do endosperma; o embrião normalmente não se desenvolve bem, e não faz a transição do estádio heterotrófico para autotrófico, tornando, assim, a cultura in vitro extremamente difícil (Poysa, 1990).

A cultura de óvulo é uma variante da cultura de embrião e consiste em colocar a semente imatura diretamente em meio de cultura, devido à dificuldade de se identificar ou remover o embrião (Doganlar et al., 1997).

Além da composição do meio de cultura (Neal & Topoleski, 1983), o sucesso da técnica de cultura in vitro para a regeneração de híbridos interes-pecíficos depende da idade adequada do fruto para a retirada do embrião ou semente (óvulo), (Barbano & Topoleski, 1984; Chen & Imanishi, 1991; Chen & Adachi, 1992), e também da compatibilidade de cruzamento entre determinados genótipos de L. esculentum e de L. peruvianum ( Chen & Adachi, 1992, 1996; Duval et al., 1993).

Segundo Barbano & Topoleski (1984), o embrião híbrido de L. esculentum x L. peruvianum começa a se deteriorar cerca de 10 dias após a polinização (dap), antes da diferenciação dos cotilédones, e se completa aos 17 dap, ao passo que para Smith (1944), a degeneração completa dos embriões ocorre aos 40 dap. As diferenças entre os resultados obtidos por Smith (1944), Barbano & Topoleski (1984) e Cheng & Adachi (1992) podem ser atribuídas ao uso de diferentes genótipos de L. esculentum e L. peruvianum nos respectivos estudos. Para Chen & Imanishi (1991), o sucesso da cultura de óvulo depende muito da cultivar de tomate utilizada como genitor feminino, em face de diferenças nas taxas de germinação de sementes imaturas entre diferentes genótipos.

O objetivo deste trabalho foi desenvolver um método de obtenção de híbridos entre essas duas espécies, mediante a técnica de cultura de óvulos, tendo em vista o interesse em transferir genes presentes em acessos de L. peruvianum que conferem resistência a Septoria lycopersici.

Material e Métodos

Plantas de Lycopersicon esculentum Mill. (cvs. Floradade e Ipa5) e de L. peruvianum (L.) Mill. (CNPH 946, CNPH 947 e CNPH 948) foram cultivadas em casa de vegetação, na Embrapa-Centro Nacional de Pesquisa de Hortaliças, durante todo o período do experimento. Os cruzamentos interespecíficos foram feitos sempre utilizando L. esculentum cv. Floradade e IPA5 como genitores femininos, e os três acessos de L. peruvianum como genitores masculinos.

Botões florais de plantas de L. esculentum foram emasculados 1-2 dias antes da antese e polinizados ma-nualmente com pólen de L. peruvianum colhido de flores recém-abertas. Os botões foram cobertos com uma proteção de papel-alumínio e etiquetados.

Os frutos foram colhidos em idades que variaram de 25-68 dias após a polinização (dap), e desinfestados por imersão em etanol 95%, por 10 a 15 minutos. A mucilagem que envolve as sementes foi retirada com o auxílio de papel-filtro, e as sementes foram colocadas para germinar diretamente em placa de Petri de 9 cm de diâmetro com meio de cultura. Todas as sementes obtidas dos diferentes cruzamentos foram plaqueadas, e sementes de frutos diferentes não foram misturadas em uma mesma placa de Petri. Foram colocadas por placa de Petri, no máximo, 24 sementes. Os meios de cultura utilizados para recuperação dos embriões foram HLH (Neal & Topoleski, 1983), cuja composição encontra-se na Tabela 1, e o meio com composição mineral de Murashige & Skoog (1962), acrescido de 3% de sacarose, 6 g/L de Difco-ágar e em mg/L: i-inositol, 100; glicina, 2,0; tiamina.HCl, 1,0; piridoxina.HCl, 0,5; ácido nicotínico, 0,5. As placas com as sementes foram mantidas no escuro a 25 ^oC, até a germinação.

Após a germinação, as plântulas foram transferidas e mantidas em tubos de ensaio contendo meio de cultura ½ MS (metade da concentração de sais e vitaminas do meio MS - Murashige & Skoog (1962), 20 g/L de sacarose, suplementados com 0,5 mg/L de ácido indolacético - AIA), sendo repicadas em intervalos de 20-30 dias. Os híbridos foram mantidos em sala de crescimento, com temperatura média de 22^oC, fotoperíodo de 16 horas de luz e 8 horas de escuro, e intensidade luminosa em torno de 1.000 lux.

Os parâmetros utilizados para a caracterização morfológica dos híbridos foram: presença de pêlos nas hastes, formato da folha, formato da flor, coloração da flor, posição do estilete em relação ao cone de anteras, coloração do fruto e compatibilidade da autopolinização.

As características morfológicas das cultivares Floradade e IPA5 foram determinadas: presença de pêlos nas hastes, cor de folha verde, inflorescência sem brácteas, cor de pétalas amarelo-clara, posição do estilete abaixo do cone de anteras, coloração de fruto maduro vermelha, e plantas autocompatíveis.

Nos acessos de L. peruvianum (CNPH 946, CNPH 947 e CNPH 948) foram identificadas as seguintes características morfológicas: planta glabra, cor da folha verde-acinzentada, inflorescência com brácteas grandes, cor de pétala amarelo-escura, estilete projetado acima do cone de anteras, coloração de fruto maduro verde, com estrias roxas e plantas auto-incompatíveis.

Resultados e Discussão

Nenhuma das 384 sementes germinou em meio MS (Murashige & Skoog, 1962) e das 1.573 sementes, em meio HLH, 20 germinaram; destas, 16 híbridos foram regenerados, constituindo uma taxa de regeneração de1,02% (Tabela 2). Este resultado pode ser considerado satisfatório, visto que Chen & Imanishi (1991) obtiveram uma taxa de germinação de 0,39% utilizando o meio MS para a germinação de óvulos de híbridos interespecíficos entre L. esculentum x L. peruvianum, ao passo que Doganlar et al. (1997), ao usar o mesmo meio acrescido de 100 mg/L de mio-inositol, 0,4 mg/L de tiamina-HCl e 30 g/L de sacarose, regeneraram 5 plantas híbridas (0,33% de germinação). Neal & Topoleski (1983) regeneraram plântulas híbridas a partir de embriões imaturos cultivados no meio MS, porém, o meio de cultura HLH destacou-se entre os demais avaliados. Embriões híbridos no estádio globular foram cultivados por Chen & Adachi (1992) no meio HLH suplementado de 1 g/L de extrato de levedura e 2 mg/L de BA, e germinaram 20 dias após o plaqueamento.

Neste trabalho, os óvulos foram retirados dos frutos em idades que variaram de 2568 dias após a polinização (dap). Apesar de terem sido regeneradas plantas de óvulos em diferentes idades, a melhor taxa de germinação e de regeneração de plantas foi aos 38 dap (9,4%) no cruzamento da cultivar Floradade (FD) com a linha de L. peruvianum CNPH 947. Neste mesmo cruzamento, foi observada uma taxa de germinação de 0,5, 2,9, 1,2 e 2,6% em óvulos resgatados, respectivamente, aos 27, 46, 53 e 57 dap. A única planta regenerada do cruzamento Ipa5 (I5) x CNPH 947 foi de um óvulo retirado com idade de 38 dap. Estes resultados aproximam-se dos obtidos por Lai et al. (1990), que indicaram 35 dap como a melhor idade para resgate de embriões híbridos. Chen & Adachi (1992) inocularam óvulos de diferentes idades, e melhores taxas de regeneração foram obtidas em embriões resgatados aos 13, 18 e 21 dap. Chen & Adachi (1996) retiraram óvulos de frutos em idades que variaram de 13 a 26 dap, e a maior freqüência de híbridos regenerados foi obtida aos 25-26 dap. Segundo Chen & Adachi (1992), apesar de o endosperma estar totalmente degenerado aos 9 dap, 3,3% a 16,7% dos embriões híbridos continuam a se desenvolver. Para Duval et al. (1993), a idade do fruto adequada para a retirada de óvulos variou de acordo com a cultivar de tomate utilizada. Verificou-se que as idades 25 e 26 dap foram mais efetivas para a obtenção de plantas em que a cultivar Floradel foi utilizada como genitor feminino, enquanto com a cultivar Santa Cruz a melhor idade foi 34 dap.

A existência de compatibilidade de cruzamentos entre genótipos de L. esculentum e L. peruvianum também foi observada neste trabalho. Melhores resultados foram obtidos quando a cultivar Floradade foi utilizada como genitor feminino, em relação à cultivar Ipa5, em cruzamentos com a linha de L. peruvianum CNPH 947, com 1,45% e 0,18% de taxa de regeneração, respectivamente. Não foram regeneradas plantas de cruzamentos em que CNPH 946 e CNPH 948 foram utilizados como genitores masculinos. Esta compatibilidade também pode ser medida pelo número médio de sementes por frutos, que foi 63,8 e 27,6 sementes/fruto para os cruzamentos FD x CNPH 947 e I5 x CNPH 947, respectivamente.

Os híbridos interespecíficos de L. esculentum x L. peruvianum normalmente apresentam características de hastes, folhas, tamanho de fruto e precocidade estreitamente ligadas ao genitor silvestre (Kalloo, 1991).

As principais características que evidenciaram a natureza híbrida dos híbridos obtidos foram o estigma projetado acima do cone de anteras, pilosidade da haste intermediária (Figura 1), morfologia da folha intermediária (Figura 2), e a auto-incompatibilidade dos híbridos (Tabela 3). Essas evidências descartam a possibilidade de ter havido contaminação com o pólen do genitor feminino, a cultivar Floradade, uma vez que esta é autocompatível.

Conclusões

1. O meio HLH de Neal & Topoleski contribui positivamente na regeneração de plantas híbridas resultantes do cruzamento interespecífico entre L. esculentum e L. peruvianum.

2. Em cruzamentos onde é utilizada a cultivar Floradade como genitor feminino, a melhor época para colheita dos frutos e remoção das sementes para plaqueamento é aos 38 dias após polinização.

3. Os genótipos usados nos diferentes cruzamentos exercem grande influência no número de plantas regeneradas.

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⁽¹

) Aceito para publicação em 13 de julho de 2000.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  13 Set 2001
• Data do Fascículo
  Maio 2001

Histórico

• Aceito
  13 Jul 2000