Fertilidade de sêmen suíno avaliada pelo teste de ligação dos espermatozóides a um substrato sintético

Boar semen fertility evaluated by a sperm-binding assay to a synthetic substrate

ZOOTECNIA

Fertilidade de sêmen suíno avaliada pelo teste de ligação dos espermatozóides a um substrato sintético¹

Boar semen fertility evaluated by a sperm-binding assay to a synthetic substrate

Goreti Ranincheski dos Reis^I; Mari Lourdes Bernardi^II; Ivo Wentz^I; Fernando Pandolfo Bortolozzo^I; Karl Fritz Weitze^III; Rupert Amann^IV; Claudia Kellers^III; Jana Zemmrich^III

^IUniversidade Federal do Rio Grande do Sul (UFRGS), Faculdade de Veterinária, Setor de Suínos, Av. Bento Gonçalves, 9090, CEP 91540-000 Porto Alegre, RS. E-mail: [e-mail], [e-mail], [e-mail] ^IIUFRGS, Faculdade de Agronomia, Av. Bento Gonçalves, 7712, CEP 91540-000 Porto Alegre, RS. E-mail: [e-mail] ^IIITierärztliche Hochschule Hannover, Institut für Reproduktionsmedizin, Bünteweg 15, D30559, Hannover, Alemanha. E-mail: [e-mail], [e-mail], [e-mail] ^IVBioPore Inc., 819 Marble Drive, Fort Collins, CO 80526, USA. E-mail: [e-mail]

RESUMO

O objetivo deste trabalho foi avaliar a fertilidade de sêmen suíno pelo teste de ligação de espermatozóides a um substrato sintético. A motilidade (MOT) e o porcentual de espermatozóides ligados (PEL) foram avaliados após 5, 24, 48 e 72 horas de armazenamento a 17ºC. O PEL foi determinado em soluções contendo 6,25 ou 12,5 milhões de espermatozóides/mL, com ou sem albumina sérica bovina (BSA), preparadas a partir de dois a cinco ejaculados de cada um dos quatro machos. Cinqüenta e oito leitoas foram inseminadas, uma vez, 24 horas após o início do estro. Houve correlação positiva (P = 0,0001; r = 0,33) entre a MOT e o PEL. O PEL foi maior com 12,5 milhões de espermatozóides/mL e na presença de BSA (P<0,05). Após 72 horas, o macho 3 apresentou PEL inferior ao dos outros três (P<0,05). As taxas de clivagem (TC) e de embriões morfologicamente normais não diferiram entre indivíduos, mas o macho 3 apresentou menos de 70,0% de TC no quartil superior, enquanto os outros tiveram mais de 75,0%. Os machos diferem quanto à capacidade de ligação de seus espermatozóides ao substrato sintético, a partir de 24 horas de armazenamento do sêmen. A ligação dos espermatozóides ao substrato sintético é maior com a inclusão de BSA e com o aumento da concentração espermática.

Termos para indexação: albumina sérica, inseminação artificial, ligação espermatozóide-ovócito.

ABSTRACT

The objective of this work was to evaluate boar semen fertility by a sperm-binding assay to a synthetic substrate. Motility (MOT) and percentage of bound sperm (PSB) were evaluated after 5, 24, 48 and 72 hours of storage at 17°C. PSB was analyzed in solutions containing 6.25 or 12.5 million of spermatozoa/mL, with or without bovine serum albumin (BSA), processed from two to five ejaculates of four boars. Fifty eight gilts were inseminated, a single time, 24 hours after the beginning of estrus. There was a positive correlation (P = 0.0001; r = 0.33) between MOT and PSB. Higher percentages of PSB were observed with 12.5 million of spermatozoa/mL and in the presence of BSA (P<0.05). After 72 hours, boar 3 showed lower PSB (P<0.05) than the other boars. The cleavage (TC) and normal embryo rates did not differ among boars, but boar 3 showed less than 70.0% of TC belonging to the superior quartile while boars 1, 2 and 4 had more than 75.0%. After 24 hours of sperm storage, boars differ in their sperm binding to the synthetic substrate. Binding of swine spermatozoa to the synthetic substrate is higher in the presence of BSA and with the increase of spermatic concentration.

Index terms: serum albumin, artificial insemination, sperm-egg binding.

Introdução

A estimativa visual da motilidade (Colenbrander & Kemp, 1991) e das alterações de morfologia (Woelders, 1991) da célula espermática tem sido utilizada para a avaliação in vitro da qualidade do sêmen suíno. No entanto, estudos têm mostrado que, quando estiver acima de 60,0%, a motilidade espermática não permite a predição da fertilidade do macho suíno, in vivo (Flowers, 1996). Machos suínos com variação de motilidade espermática de 53,8% a 72,5%, no oitavo dia de armazenamento do sêmen in vitro, não apresentaram diferenças nas taxas de parto e tamanho de leitegada (Xu et al., 1998). Após a inseminação de leitoas com doses de 3 bilhões de espermatozóides, Tardif et al. (1999) não observaram correlação entre a motilidade espermática e a fertilidade, representada pelo número de fetos em relação ao número de corpos lúteos, nas 5 semanas de gestação. Em virtude da pequena variação observada na normalidade de acrossoma, no sêmen suíno mantido resfriado durante uma semana, Vazquez et al. (1998) sugerem que este parâmetro estaria relacionado com a capacidade fecundante do espermatozóide somente na presença de elevado porcentual de anormalidades.

Testes que incluem a interação dos gametas masculino e feminino, tais como o de ligação à zona pelúcida (Ivanova & Mollova, 1993; Fazelli et al., 1995; Ferreira, 1998), de penetração no ovócito (Gadea et al., 1998) e de fecundação (Martinez et al., 1993; Xu et al., 1996, 1998) in vitro têm sido avaliados quanto à possibilidade de melhorar a predição da fertilidade, embora o número de estudos, na espécie suína, ainda seja pequeno.

Um novo teste in vitro foi desenvolvido por Barbato et al. (1998), basea do na capacidade de ligação de espermatozóides de aves e mamíferos a um substrato da membrana perivitelina do ovo de galinha, simulando a interação dos gametas. Neste teste, o substrato sintético teria uma ação homóloga à zona pelúcida de ovócitos de mamíferos. A versão comercial (BioPore - SBA) do teste de ligação (Sperm-Binding Assay, SBA), similar ao terceiro teste descrito por Barbato et al. (1998), consiste de uma microplaca contendo um extrato da membrana perivitelina do ovo de galinha, enriquecido com uma proteína de ligação denominada prosaposina ou glicoproteína-1 sulfatada, conjugada a um corante fluorescente. Após exposição ao substrato sintético, avalia-se o porcentual de espermatozóides ligados.

A grande variação que ocorre entre os ovócitos, quanto à capacidade de aderência da célula espermática (Xu & Foxcroft, 1996), diminui a exatidão da observação de diferenças entre machos. Com o uso de um substrato sintético, como é o do teste SBA, espera-se maior uniformização da resposta de um mesmo macho e, com isto, maior probabilidade de observar diferenças entre machos, na capacidade de ligação de seus espermatozóides.

O teste SBA tem sido usado para identificar galos (Barbato et al., 1998) e perus (Gill et al., 1999b) subférteis, bem como registrar diferenças nas populações de espermatozóides humanos e avaliar os danos espermáticos decorrentes do congelamento (Amann et al., 1999a). O teste também tem sido usado para avaliar se a versão sintética (FertPlus®) de um fragmento da prosaposina, presente no plasma seminal, e envolvido na ligação dos espermatozóides à membrana perivitelina de aves, aumentaria a ligação e a fertilidade dos espermatozóides de touros (Amann et al., 1999a, 1999b), cachaços (Amann et al., 1999a), perus (Gill et al., 1999a) e homens (Amann et al., 1999a, 1999c).

O emprego do teste SBA ainda está restrito ao campo experimental, por causa do elevado custo do equipamento necessário para determinar o porcentual de espermatozóides ligados ao substrato. No entanto, sua praticidade, quando comparado a outros testes que avaliam aspectos da interação espermatozóide-ovócito, justifica a obtenção de mais informações sobre a espécie suína.

O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da concentração espermática, da presença de BSA e dos machos sobre a capacidade de ligação dos espermatozóides ao substrato sintético do teste e as taxas de clivagem e de embriões normais, após inseminação.

Material e Métodos

Foram utilizados dois a cinco ejaculados de cada um dos quatro machos, que, após coleta e avaliação, foram processados em diluente comercial, com o acréscimo ou não de albumina sérica bovina (BSA). As doses de sêmen (DS), contendo 1 bilhão de espermatozóides em um volume final de 80 mL, foram conservadas a 17°C durante o período de avaliação.

As doses de sêmen foram avaliadas quanto à motilidade (MOT) e quanto à capacidade de ligação dos espermatozóides ao substrato do teste SBA (Sperm-Binding Assay), após 5, 24, 48 e 72 horas de arma-zenamento. A MOT foi avaliada entre lâmina e lamínula, em microscópio óptico (160x), a partir de uma alíquota de 1 mL retirada da DS após incubação a 37ºC por dez minutos. Amostras independentes foram utilizadas para a avaliação da MOT e da capacidade de ligação pelo teste SBA. Na realização do teste SBA, foi determinada a concentração espermática de cada DS, em câmara hematocitométrica. Em seguida, foram preparadas quatro soluções seminais de trabalho (ST), para cada macho, contendo 6,25 ou 12,5 milhões de espermatozóides/mL, em diluente com e sem BSA.

Inicialmente, foi efetuada a hidratação do substrato sintético, pela lavagem dos 96 poços da placa do teste SBA, com diluente sem BSA. Logo após, foi efetuada a secagem da placa com papel absorvente, e a pipetagem de 100 µL do diluente sem BSA, em cada poço a ser utilizado para o teste. Posteriormente, foram pipetados 100 µL de cada uma das quatro ST, em seis poços para cada macho avaliado, de acordo com um mapa da placa, previamente determinado. A placa foi incubada a 37°C durante 60 minutos. Após a incubação, as ST e o diluente foram desprezados e a placa lavada com diluente sem BSA, secada com papel absorvente e conservada, sem a tampa, numa área limpa e seca, durante a noite. No dia seguinte, a placa seca e com tampa foi colocada em local limpo e seco, até o momento da leitura para a determinação do porcentual de ligação. Antes da leitura, a placa foi submetida à temperatura de 60°C por 18 horas. O porcentual de espermatozóides ligados (PEL) ao substrato do teste SBA foi determinado, em microscopia de fluorescência, e expresso por massa de proteína ligada, segundo Barbato et al. (1998).

Simultaneamente à avaliação seminal in vitro, foram inseminadas 14, 16, 15 e 13 leitoas, com DS dos machos 1, 2, 3 e 4, respectivamente, uma única vez, 24 horas após a observação do estro. Das 58 fêmeas inseminadas, 20 receberam DS do primeiro dia de armazenamento (5, 4, 5 e 6 DS dos machos 1, 2, 3 e 4, respectivamente) e 38 do terceiro dia (9, 12, 10 e 7 DS dos machos 1, 2, 3 e 4, respectivamente). As fêmeas foram abatidas, em média, três a cinco dias após a ovulação, que foi monitorada por ultra-sonografia transcutânea. Os embriões foram coletados após a lavagem dos cornos uterinos com meio PBS acrescido de 1,0% de BSA. A morfologia e o estádio de desenvolvimento das estruturas recuperadas foram avaliados sob estereomicroscópio (Sugie et al., 1982) e pela coloração de núcleos, a qual foi efetuada usando uma solução de Hoechst na concentração de 50 µg/mL de água bidestilada. A visualização dos núcleos foi efetuada em microscópio de epifluorescência equipado com filtro de excitação (365 nm) e filtro de barreira (410 nm).

Foram determinadas as taxas de recuperação (porcentual de estruturas recuperadas/número de corpos lúteos), de clivagem (porcentual de embriões clivados/estruturas recuperadas) e de embriões morfologicamente normais, estes em relação aos embriões clivados (porcentual de embriões normais/embriões clivados) e também às estruturas recuperadas (porcentual de embriões normais/estruturas recuperadas). Foram considerados anormais os embriões degenerados ou que estavam cronologicamente atrasados em seu desenvolvimento.

Foi também verificada a freqüência de distribuição dos resultados do teste SBA, nos quatro machos suínos, dentro dos quatro percentis, conforme Gill et al. (1999b).

As taxas de recuperação, de clivagem e de embriões morfologicamente normais foram submetidas à transformação arco-seno raiz quadrada. De acordo com Gill et al. (1999b), os porcentuais de ligação dos espermatozóides foram submetidos à transformação Logit:

PEL = [Ln (P/1-P)], em que P é o porcentual de espermatozóides ligados.

Após transformação, os dados referentes às taxas de recuperação, de clivagem e de embriões normais foram analisados pelo procedimento GLM (SAS Institute, 1999), sendo considerados os efeitos do macho, da BSA, do tempo de armazenamento das doses de sêmen e das interações duplas entre estes fatores. O porcentual de ligação dos espermatozóides e a MOT foram analisados como medidas repetidas pelo procedimento MIXED (SAS Institute, 1999), e as médias comparadas pelo teste de Tukey a 5,0% de probabilidade. Quanto aos porcentuais de ligação, foram avaliados o efeito da BSA, do macho, da concentração espermática, do momento de avaliação e da interação dupla entre esses fatores. Os dados são apresentados sob a forma de médias sem a transformação. Foi avaliada a relação entre MOT e PEL pela correlação de Spearman.

Resultados e Discussão

Os porcentuais médios de espermatozóides ligados (PEL) variaram de 0,05% a 8,97% (2,57%±0,18) na concentração de 6,25 milhões de espermatozóides/mL, tendo sido inferiores (P<0,01) aos da concentração de 12,5 milhões de espermatozóides/mL, que variaram de 0,43% a 8,83% (2,74%±0,16). Em perus, com o uso de sêmen in natura, maiores PEL (P<0,05) foram observados, utilizando 2 ou 4 milhões de espermatozóides/mL, em comparação às concentrações de 1, 6 ou 8 (Gill et al., 1999b). Analisando o sêmen humano in natura, Amann et al. (1999a) observaram que diferenças no PEL, entre amostras, foram mínimas com o uso de concentrações maiores que 2 milhões de espermatozóides/mL. Segundo esses autores, a ligação do espermatozóide ao substrato do teste SBA ocorre numa forma dose-dependente. Entretanto, usualmente, o PEL decresce progressivamente com o aumento do número de espermatozóides, uma vez que ocorre redução da probabilidade de ligação, por causa do aumento da competição, independentemente do potencial de ligação da célula espermática (Gill et al., 1999b).

Os valores de PEL na presença de BSA variaram de 0,11% a 8,97% (3,24%±0,19) e foram superiores (P<0,01) aos observados na sua ausência, os quais variaram de 0,05% a 8,38% (2,07%±0,05). Embora a inclusão de BSA, no sêmen humano in natura e no sêmen bovino congelado, não tenha afetado os resultados de ligação (Amann et al., 1999a), a BSA aumentou o porcentual de ligação espermática. A BSA tem sido acrescentada em alguns diluentes de sêmen suíno em razão de seu provável efeito protetor, cujo mecanismo ainda não é totalmente conhecido (Weitze, 1991). Por ter alta afinidade a várias substâncias de baixa massa molecular, a BSA pode estar envolvida na remoção de um fator inibidor presente no espermatozóide, podendo, assim, aumentar a sua motilidade (Weitze, 1991). De fato, maiores porcentuais (P<0,05) de espermatozóides móveis (73,7%±0,99) foram verificados nas doses seminais contendo BSA comparadas às processadas sem BSA (62,5%±1,53), considerando a média de todos os momentos de avaliação. Por sua vez, sabe-se que a BSA está envolvida na remoção do colesterol da membrana espermática e conseqüentemente na alteração na permeabilidade desta, facilitando a capacitação espermática in vitro (Yanagimachi, 1989; Visconti et al., 2002). Assim, a facilitação da capacitação também poderia explicar a maior capacidade de ligação dos espermatozóides visto que o substrato sintético simula o papel da zona pelúcida na interação espermatozóide-ovócito.

Os coeficientes de variação (CV) do PEL, 5 horas após a diluição, foram 31,0%, 31,7%, 54,0% e 73,0%, respectivamente, nos machos 1, 4, 3 e 2, sendo especialmente altos os dois últimos valores. Em humanos, Amann et al. (1999d) observaram, no sêmen in natura, CV de 31,0%, similar ao apresentado pelos machos 1 e 4. Porém, a variação encontrada em perus foi de 17,0% e considerada satisfatória para o emprego desse teste na avaliação da fertilidade (Gill et al., 1999b). A variação em suínos parece ser maior do que nas outras espécies, embora ainda não seja conhecida a razão para tal e nem esteja divulgada a variação do valor de ligação dos espermatozóides que pode ser satisfatória para a aplicação do teste SBA, nessa espécie.

Houve efeito (P = 0,027) da interação entre o tempo de armazenamento e o macho (Tabela 1). Houve redução (P<0,05) do PEL, nas 72 horas de armazenamento, apenas no macho 3. Em perus, redução (P<0,05) no PEL (5,24% para 2,88%) foi verificada mais cedo, com 24 horas de armazenamento (Gill et al., 1999b).

Gill et al. (1999b) descrevem a importância de utilizar um teste capaz de diferenciar os machos logo após a coleta do ejaculado. Considerando a avaliação efetuada nas 5 horas de armazenamento das doses de sêmen, contendo 12,5 milhões de espermatozóides/mL e a presença de BSA, os machos avaliados não apresentaram diferenças no potencial de ligação de seus espermatozóides (Tabela 1). Nas 24 e 48 horas, o macho 3 apresentou PEL inferior ao do macho 4 e, nas 72 horas, esse mesmo macho teve PEL inferior (P<0,05) ao dos outros três. O fato de diferenças entre os machos aparecerem com o aumento do tempo de armazenamento deixa dúvidas quanto à possibilidade de efetuar esse teste logo após a coleta do ejaculado.

Em relação à motilidade espermática, não foi verificada interação entre o tempo de armazenamento e os machos, nem diferenças entre eles. Houve redução (P<0,05) na motilidade média do sêmen, nas 72 horas (63,2%) de armazenamento, em relação à motilidade observada nas 5 (82,4%), 24 (78,7%) e 48 horas (73,8%). Foi observada correlação positiva (P = 0,0001), embora baixa (r = 0,33), entre MOT e PEL. Dessa forma, a MOT explicaria apenas 11,0% (R² = 0,1102) da variação no porcentual de ligação. Este valor é semelhante ao observado em humanos (R² = 0,1082), após o descongelamento dos espermatozóides. O valor da correlação entre MOT e PEL mostra que, além da motilidade, outros aspectos funcionais da célula espermática devem estar relacionados à capacidade de ligação do espermatozóide ao substrato do teste SBA (Amann et al., 1999d).

Uma das formas de classificar os machos de acordo com os resultados do teste SBA é pela freqüência de distribuição dos porcentuais de ligação, dentro dos quartis superior (QS), intermediários (QIM) ou inferior (QI), conforme efetuado por Gill et al. (1999b). O macho 1 apresentou 75,0% de seus ejaculados com valores de PEL situados no QS, enquanto nenhum ejaculado do macho 3 apresentou valor de PEL dentro deste quartil (Tabela 2). Ainda não há informações sobre a melhor forma de observar diferenças entre os machos pelos resultados do teste SBA, mas se constata que, mesmo utilizando a classificação de acordo com a freqüência de distribuição dos PELs em quartis, há grande variação entre as avaliações de um mesmo macho, na espécie suína.

Foram avaliados dois a cinco ejaculados por macho, número semelhante aos três a quatro ejaculados utilizados na avaliação da capacidade de ligação ao substrato do teste SBA por espermatozóides humanos (Amann et al., 1999d), bovinos (Amann et al., 1999a) ou de perus (Gill et al., 1999b). Contudo, considerando a possibilidade de maior variabilidade em suínos, entre ejaculados de um mesmo macho, é necessário aumentar o número de ejaculados avaliados por macho.

A taxa média de recuperação de estruturas após a lavagem dos cornos uterinos foi de 79,3%, não tendo diferido de acordo com os machos (P>0,05). Embora as taxas de clivagem (TC) e de embriões morfologicamente normais tenham sido semelhantes (P>0,05) entre os quatro machos, o macho 3 apresentou porcentual inferior a 70,0% de suas inseminações com TC pertencentes ao quartil superior, enquanto os outros tiveram mais de 75,0% das TC neste quartil (Tabela 3). As taxas de embriões morfologicamente normais observadas com o uso de doses de sêmen do primeiro dia de armazenamento, calculadas em relação aos embriões fecundados (87,7%±6,3) ou estruturas recuperadas (81,5±6,8), foram superiores (P<0,05) às do terceiro dia (66,3%±6,2 e 58,8%±6,5), mas não houve efeito (P>0,05) da interação do tempo de armazenamento com os machos ou com a BSA.

Considerando o conjunto dos resultados, o macho 3 é o de menor fertilidade pois seu PEL foi inferior ao dos demais machos, nas 72 horas de armazenamento do sêmen (Tabela 1); apresentou 40,0% e 60,0% dos seus PELs distribuídos, respectivamente, nos QI e QIM, sem nenhum valor de PEL no QS (Tabela 2), e apresentou porcentual inferior a 70,0% (67,7%) das suas inseminações com TC pertencentes ao quartil superior (Tabela 3). No entanto, tais constatações devem ser consideradas com precaução, pois a validade do uso deste teste, como preditor de fertilidade na espécie suína, necessita de confirmação em estudos conduzidos com maior número de machos.

Conclusões

1. A inclusão da albumina sérica bovina e o aumento da concentração espermática aumentam o porcentual de espermatozóides suínos ligados ao substrato sintético do teste SBA.

2. Há diferenças entre machos na capacidade de ligação de seus espermatozóides ao substrato sintético do teste SBA, a partir de 24 horas de armazenamento do sêmen a 17ºC.

Agradecimentos

À BioPore Inc. pelo fornecimento das placas do teste SBA (Sperm-Binding Assay).

Aceito para publicação em 29 de agosto de 2003

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1

Extraído da tese de doutorado do primeiro autor apresentada à Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS.

Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  28 Abr 2004
• Data do Fascículo
  Nov 2003

Histórico

• Aceito
  29 Ago 2003