Biomassa e atividade microbianas do solo sob influência de chumbo e da rizosfera da soja micorrizada

Soil microbial biomass and activity under the influence of lead addition and mycorrhizal soybean rhizosphere

MICROBIOLOGIA

Biomassa e atividade microbianas do solo sob influência de chumbo e da rizosfera da soja micorrizada

Soil microbial biomass and activity under the influence of lead addition and mycorrhizal soybean rhizosphere

Sara Adrián López de Andrade; Adriana Parada Dias da Silveira

Instituto Agronômico, Centro de Pesquisa e Desenvolvimento em Solos e Recursos Ambientais, Caixa Postal 28, CEP 13001-970 Campinas, SP. E-mail: [e-mail], [e-mail]

RESUMO

O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da adição de chumbo (Pb) ao solo na biomassa e atividade microbianas do solo sob influência da rizosfera de soja micorrizada. O trabalho foi realizado em casa de vegetação, com delineamento inteiramente casualizado num esquema fatorial 4x2x2 utilizando-se 0, 150, 300 e 600 mg dm^-3 de Pb, inoculação ou não do fungo micorrízico arbuscular (FMA), Glomus macrocarpum, e duas épocas de amostragem — florescimento e maturação da soja. Avaliaram-se o C da biomassa microbiana, a liberação de CO₂ do solo e a atividade de três enzimas, desidrogenase, fosfatase alcalina e arilssulfatase. O Pb afetou negativamente o C da biomassa e a atividade da microbiota rizosférica, ocorrendo interação entre a presença de propágulos de FMA e o estádio de desenvolvimento da planta. A atividade da fosfatase alcalina foi a mais afetada pelas altas concentrações de Pb adicionadas ao solo, com redução de 60% na sua atividade, mostrando-se um indicador sensível do estresse metabólico da comunidade microbiana do solo causado pelo excesso de chumbo. A micorrização da soja influenciou de forma direta a microbiota rizosférica, resultando em maior atividade e biomassa, principalmente no estádio de maturação da soja. A microbiota do solo apresentou sintomas de estresse decorrentes da adição de chumbo.

Termos para indexação: respiração basal do solo, atividade enzimática, fungo micorrízico arbuscular, metal pesado, qualidade do solo.

ABSTRACT

The objective of this work was to evaluate the effects of lead addition on soil microbial biomass and activity under the influence of the rhizosphere of mycorrhizal soybean. The experimental design was completely randomized and arranged in a 4x2x2 factorial scheme, using 0, 150, 300 and 600 mg dm^-3, inoculation or not of the arbuscular mycorrhizal fungus (AMF) Glomus macrocarpum and two sampling periods: soybean flowering and maturity. Microbial biomass C, soil respiration and the activity of three soil enzymes (deshydrogenase, alkaline phosphatase and arilsulphatase) were determined. The most affected enzyme was alkaline phophatase, whose activity was reduced in 60%, and which was a sensible indicator of the microbial metabolic stress caused by high Pb concentrations. Soybean mycorrhization directly influenced the rhizospheric microbiota leading to higher activity and biomass, mainly at soybean maturity stage. Soil microbiota showed stress symptoms due to Pb addition to soil.

Index terms: soil basal respiration, enzimatic activity, arbuscular mycorrhizal fungus, heavy metal, soil quality.

Introdução

Os microrganismos do solo estão presentes tanto no solo como na rizosfera, onde realizam atividades metabólicas relevantes para o crescimento das plantas. A biota do solo desempenha funções no ecossistema, tais como armazenamento de água, decomposição de resíduos orgânicos, reciclagem de nutrientes, seqüestro e desintoxicação de substâncias tóxicas entre outras (Costanza et al., 1997).

Atualmente, a contaminação dos solos por metais pesados (MP) é um grave problema ambiental, por causa da sua persistência e alto poder de toxicidade (Reddy & Prasad, 1990). Assim, há interesse em se utilizar características microbiológicas como indicadores da qualidade do solo (Doran & Zeiss, 2000). Entre os MP, o Pb, além de ser potencialmente tóxico, é pouco estudado em relação ao seu efeito na microbiota do solo, especialmente em solos tropicais. Esse metal, não essencial para os seres vivos, pode ser acumulado no solo e influenciar os microrganismos, e, conseqüentemente, afetar o funcionamento normal do ecossistema (Reddy & Prasad, 1990).

Os efeitos prejudiciais dos MP no solo podem ser medidos pela biomassa microbiana (Brookes & MacGrath, 1984), a composição de fosfolipídeos dos ácidos graxos (Bääth et al., 1998), a estrutura da comunidade (Reber, 1992) e a respiração e atividades enzimáticas (Valsecchi et al., 1995; Dias-Júnior et al., 1998; Chew et al., 2001).

Altas concentrações de MP diminuem a biomassa microbiana do solo (Fliebbach et al., 1994; Barajas Aceves et al., 1999). Valsecchi et al. (1995) observaram correlações negativas entre concentração de MP (Zn, Pb, Cu, Cd, Ni e Cr) e respiração do solo. Constataram também aumento no teor de matéria orgânica com o incremento da concentração de metais no solo, possivelmente em decorrência da menor eficiência na mineralização da matéria orgânica do solo. Segundo Chander & Joergensen (2001) a biomassa microbiana de solos poluídos com MP é menos eficiente na utilização de substratos para a própria síntese de constituintes celulares assim como necessita de mais energia para sua própria manutenção.

A determinação da atividade de várias enzimas no solo é uma maneira de se medir a atividade microbiana, indicando mudanças ocorridas na microbiota do solo, sem entretanto, relacioná-las a algum grupo específico de organismo. Kandeler et al. (1996) avaliaram, além da biomassa e respiração, a atividade de 13 enzimas envolvidas nos ciclos do C, N, P e S e constataram que nos solos contaminados com MP, houve significativa redução na biomassa microbiana e nas atividades enzimáticas envolvidas na ciclagem de N, P e S. Em contraste, a respiração e a atividade das enzimas relacionadas ao ciclo do C não foram muito afetadas, o que se relacionou com uma mudança na comunidade microbiana do solo, favorecendo as populações fúngicas sobre as bacterianas.

Além da associação planta hospedeira-fungo, a simbiose micorrízica é reconhecida também pela sua influência nas características físicas (Miller & Jastrow, 1992) e na microbiota do solo (Nogueira & Cardoso, 2002). Como os exsudatos radiculares contribuem para o crescimento bacteriano (Bowen & Rovira, 1991) e como a colonização da raiz por fungos micorrízicos arbusculares (FMA) modifica a exsudação radicular, pode-se concluir que os FMA interagem diretamente com a microbiota do solo. A micorriza, portanto, pode alterar a quantidade e a composição das populações bacterianas da rizosfera e hifosfera (Lindermann, 1988) e, conseqüentemente, as atividades metabólicas da microbiota do solo.

O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da adição de Pb ao solo na biomassa e atividade microbianas do solo sob influência da rizosfera de soja micorrizada.

Material e Métodos

O experimento foi realizado em casa de vegetação, seguindo esquema fatorial, 4x2x2, com delineamento inteiramente casualizado e quatro repetições. Os tratamentos constituíram-se da combinação entre doses de Pb (0, 150, 300 e 600 mg dm^-3), com a inoculação ou não de Glomus macrocarpum e dois estádios fenológicos da planta: florescimento e maturação do grão. As amostras de solo (0—20 cm) foram coletadas de um Latossolo Vermelho-Amarelo do Centro Experimental Central do Instituto Agronômico (IAC), Campinas, SP, cuja análise química apresentou os seguintes resultados: pH (CaCl₂), 4,0, matéria orgânica, 14 mg dm^-3 e 2, 10, 10 e 30 mg dm^-3 de P, K, Mg e Ca, respectivamente. O pH do solo foi corrigido com uma mistura de Ca(OH)₂ e Mg(CO₃)₂ para elevar a V% a 70%. Após 15 dias de incubação, aplicaram-se K, S, B, Cu, Mn e Zn nas quantidades de 100, 41, 0,4, 1, 8 e 3 mg dm^-3, respectivamente. Após 20 dias, o solo foi desinfestado com brometo de metila (100 mL m^-3) e acondicionado em vasos de 2 L, aos quais foram adicionados 25 mg dm^-3 de P (superfosfato simples), e uma solução aquosa de Pb(NO₃)₂, cuja concentração variou de acordo com o tratamento. As amostras de solo permaneceram incubadas por 10 dias. Após esse período retirou-se uma amostra para análise química (Tabela 1).

As sementes de soja, Glycine max (L.) Merrill, variedade IAC-14, previamente desinfestadas com hipoclorito de sódio 25%, foram imersas por 10 minutos em meio de cultura (manitol - extrato de levedura) com Bradyrhizobium japonicum, SEMIA 5079 e 5080, antes da semeadura. Foram semeadas seis sementes por vaso e, após o desbaste, restaram duas plantas. Nos tratamentos nos quais houve inoculação do FMA, foram adicionados 20 mL por vaso de inóculo, o qual constou de substrato (areia:solo, 9:1) com esporos, pedaços de raiz colonizada de Brachiaria brizantha e micélio de G. macrocarpum, fornecendo ao redor de 115 esporos cm^-3 de solo-inóculo. Com o objetivo de restabelecer a comunidade microbiana no solo dos tratamentos sem inoculação do FMA, foram adicionados 20 mL do filtrado proveniente do substrato de multiplicação do FMA utilizado, no qual não havia propágulos de fungos micorrízicos.

Durante o ensaio, a umidade do solo foi mantida em torno de 60% da capacidade de retenção de água do solo. O N foi aplicado de forma parcelada, com três aplicações de 25, 50 e 50 mg de N por vaso, no desbaste e após 15 e 30 dias, respectivamente, usando como fonte Ca(NO₃)₂. A quantidade de N aplicada em todos os tratamentos foi equiparada com a quantidade de N adicionada na forma de nitrato de chumbo. Após 60 dias do plantio, no florescimento, coletou-se metade das plantas e na maturidade da soja, após 100 dias, a outra metade. Para a posterior análise da biomassa, respiração, atividades enzimáticas, colonização micorrízica e contagem dos esporos do FMA, 250 g de solo foram acondicionados em sacos de plástico mantidos a 4ºC.

O número de esporos de FMA no solo produzidos no final do ciclo da planta foi determinado por contagem após o peneiramento úmido de 50 mL de amostras de solo (Gerdemann & Nicolson, 1963), e centrifugação em solução de sacarose a 70%. A colonização micorrízica da raiz foi determinada pelo método da placa quadriculada (Giovannetti & Mosse, 1980), após despigmentação e coloração das raízes com azul de tripano (Phillips & Hayman, 1970).

O C da biomassa microbiana foi determinado pelo método da fumigação-extração (Vance et al., 1987). As amostras de solo fumigadas foram incubadas por cinco dias a uma temperatura de 28±2°C. Após extração do C orgânico, este foi quantificado pela oxidação ácida com dicromato de potássio (Joergensen, 1995). O fator de correção utilizado foi de 0,38 e o resultado expresso em mg C g^-1 de solo seco. O CO₂ liberado foi determinado por titulação, conforme Alef (1995) e expresso em mg CO₂ g^-1 de solo dia^-1. O quociente metabólico, q-CO₂, foi calculado segundo Anderson (1994), baseado na relação µg h^-1 de C-CO²/µg g^-1 de C da biomassa no solo seco.

A atividade da desidrogenase no solo foi determinada segundo Casida et al. (1964), com algumas modificações. Foram adicionados 5 mL de solução com 20 g L^-1 de cloreto de 2,3,5-trifeniltetrazólio (TTC) a 5 g de solo, peneirado em malha de 2 mm. A mistura foi homogenizada e incubada em banho-maria a 37°C no escuro, por um período de 24 horas. O trifenil formazan (TTF) formado pela redução do TTC foi extraído com 20 mL de metanol. Após centrifugação, o sobrenadante foi transferido para uma cubeta e realizou-se a leitura em espectrofotômetro a 485 nm. A análise foi realizada em duplicata e os resultados expressos em µg TTF g^-1 de solo 24 horas^-1.

A determinação da atividade da arilssulfatase foi realizada conforme Tabatabai & Bremner (1970) e os resultados foram expressos em mg de p-nitrofenol g^-1 de solo hora^-1.

A atividade da fosfatase alcalina no solo foi determinada conforme Eivazi & Tabatabai (1977). A formação de p-nitrofenol foi determinada por espectrofotometria na região do espectro de 410 nm, sendo o resultado expresso em µg de p-nitrofenol g^-1 de solo hora^-1.

Os dados foram submetidos à analise de variância, teste de Tukey a 5% de probabilidade, análise da regressão e correlação, utilizando-se o programa estatístico SANEST (Zonta et al., 1984).

Resultados e Discussão

A medida do C da biomassa tem sido usada como indicador de mudanças na comunidade microbiana do solo sob estresse por excesso de MP. O Pb disponível no solo correlacionou-se negativamente com o C da biomassa (Figura 1). O C da biomassa microbiana do solo com propágulos de FMA, amostrado na época do florescimento da planta, diminuiu em 60%, na maior dose de Pb adicionada, o que poderia ser devido, em parte, a uma redução na quantidade de micélio externo do FMA decorrente do excesso de Pb no solo (Figura 1).

No solo amostrado na maturação da planta, a diminuição foi ainda mais acentuada, cerca de 80%, na menor dose de Pb adicionada. Como houve correlação significativa e positiva do C da biomassa com o número de esporos (R² = 0,699, p<0,01) e com a colonização da raiz pelo FMA (R² = 0,631, p<0,01), infere-se que o grande número de esporos produzidos pelo FMA (Andrade et al., 2004), contribuiu para o aumento da biomassa microbiana do solo na fase de maturação da planta, além da presença de micélio extra-radicular.

O C da microbiano do solo, com propágulos de FMA, foi maior apenas na época da maturação da planta (Figura 1). Esperava-se, entretanto, que as estruturas externas do FMA contribuíssem de forma significativa para o C da biomassa também na fase do florescimento. Pode ter ocorrido uma mudança no padrão de exsudação das raízes após a colonização, o que teria levado a uma menor exsudação e, conseqüentemente, ao menor crescimento da biomassa microbiana do solo, já que a exsudação radicular decresce após o estabelecimento do FMA na raiz (Graham et al., 1981). Desse modo, pode-se esperar efeito seletivo sobre os microrganismos, de forma que no solo, ao redor das raízes não colonizadas, haveria maior quantidade de exsudatos, o que favoreceria a microbiota da rizosfera, refletindo em maior biomassa.

Como a respiração do solo sem inoculação do FMA, no florescimento da soja, diminuiu com o aumento da concentração de Pb no solo e não foi observada diminuição na biomassa (Figura 1), infere-se que a comunidade microbiana estaria em estado de dormência ou com atividade metabólica reduzida por causa do Pb disponível. A passagem de um estado metabolicamente ativo a um estado de dormência pode ter um significado de sobrevivência, já que ajudaria o microrganismo a evitar a toxicidade por MP (Ohya et al., 1988; Chew et al., 2001). No entanto, no solo com propágulos de FMA amostrado no florescimento, a respiração basal manteve-se constante e a biomassa microbiana reduziu, o que poderia indicar uma menor eficiência de utilização do C pelas populações microbianas. Solos poluídos por MP estariam sob estresse, havendo menor eficiência de utilização do C, o que resulta em maior liberação de CO₂ por unidade de substrato (Insam et al., 1996).

Os solos com propágulos de FMA apresentaram maior atividade respiratória do que solos sem propágulos de FMA, possivelmente por causa da contribuição da atividade metabólica das estruturas externas do FMA e do possível estímulo do FMA à comunidade heterotrófica da hifosfera (Figura 1). Entretanto, no solo com FMA amostrado na maturação da planta, tanto a respiração como a biomassa microbiana diminuíram com o aumento do Pb no solo (Figura 1), o que pode estar relacionado, em parte, à diminuição do número de esporos de FMA (Andrade et al., 2004) (Tabela 2).

Ohya et al. (1988) observaram que, em solos poluídos com MP, a respiração do solo correlacionou-se negativamente com a concentração de metais e que esse efeito inibitório depende da concentração de matéria orgânica do solo. Sugeriram que a respiração basal está muitas vezes relacionada com o C da biomassa e com a comunidade metabolicamente inativa ou em estado de dormência. A adição de matéria orgânica aumenta a liberação de CO₂ atribuída, principalmente, às populações metabolicamente ativas que são as mais afetadas pelo excesso de metais no solo (Insam et al., 1996). Assim, como o solo utilizado possuía uma baixa concentração de C orgânico, provavelmente havia pequena comunidade microbiana e baixa atividade respiratória, sugerindo que a microbiota estaria metabolicamente pouco ativa e que não seria afetada pela adição de chumbo. Já o fungo micorrízico, por depender dos carboidratos fornecidos pela planta, encontrar-se-ia metabolicamente mais ativo do que o resto da microbiota do solo, estando vulnerável ao efeito do Pb, como foi observado.

O qCO₂ revelou que a comunidade microbiana do solo sofreu um estresse na dose de 300 mg dm^-3 de Pb, aumentando em três vezes em relação ao controle (Figura 1). Isso pode ser um indicador do desbalanço energético que sofre a comunidade microbiana por causa dos distúrbios ambientais (Anderson & Domsch, 1993; Chander & Joergensen, 2001). Devido à grande variabilidade entre os microssítios do solo, que proporcionam diversos microhabitats com diferentes tipos e intensidade de atividades metabólicas, a biomassa e a respiração do solo nem sempre se mostraram bons indicadores do efeito do Pb no solo (Dias-Júnior et al., 1998). As poucas correlações significativas entre as características biológicas e as doses de Pb adicionadas ao solo evidenciam a complexidade do sistema solo-planta-metal, o que já foi verificado por Insam et al. (1996) e Dias-Júnior et al. (1998).

A atividade da desidrogenase no solo reflete a atividade oxidativa total da microbiota, e como é intracelular de baixa atividade quando em estado livre no solo, pode atuar como um bom indicador da atividade microbiana presente no solo (Garcia et al., 1997). No entanto, outros autores não consideraram a atividade desta enzima um bom indicador da atividade total da microbiota do solo (Beyer et al., 1992). No presente trabalho, o solo com propágulos de FMA, na fase de florescimento, apresentou atividade da desidrogenase afetada pela adição de Pb (Figura 2). Doelman & Haanstra (1979) observaram redução na atividade desta enzima com aumento do Pb no solo, mas constataram que a respiração foi mais sensível para a caracterização do efeito inibitório do Pb sobre a microbiota do solo. Neste trabalho, apesar da correlação significativa entre respiração e atividade da desidrogenase, a atividade da enzima não se correlacionou com a concentração de Pb no solo, revelando que a atividade da desidrogenase não foi um bom indicador do efeito do chumbo. Apesar de a atividade da desidrogenase não refletir satisfatoriamente o efeito de altas concentrações de Pb no solo, a correlação com a respiração basal foi positiva e, portanto, indicadora da atividade metabólica do solo.

A fosfatase alcalina é uma fosfomonoesterase de importância na mineralização do P orgânico do solo e os microrganismos são totalmente responsáveis por essa atividade, já que a enzima não é sintetizada pelas plantas (Tyler, 1974). O Pb causou efeito inibitório da atividade da fosfatase alcalina em todos os tratamentos exceto no solo com propágulos de FMA amostrado no florescimento (Figura 2). Houve 60% de inibição da enzima por causa do aumento da dose de Pb, sugerindo que a enzima foi sensível às concentrações de Pb adicionadas, corroborando os resultados de Kandeler et al. (1996). A atividade da fosfatase alcalina do solo amostrado no florescimento também foi maior em relação ao amostrado na maturação da planta, confirmando a importância do metabolismo da raiz e do efeito rizosférico no solo circundante, que influenciam diretamente a atividade microbiana. A atividade da enzima também foi estimulada pela presença de propágulos do FMA no florescimento.

No solo, a enzima arilssulfatase participa da mineralização do S orgânico e já foi observada diminuição na sua atividade em solos contaminados com metais (Kandeler et al., 1996). Neste trabalho, a atividade da arilssulfatase no solo com propágulos de FMA foi mais influenciada pelo excesso de Pb do que no solo sem FMA, e na maturação da planta a presença de FMA estimulou em 30% a atividade da enzima (Figura 2).

A microbiota do solo foi influenciada negativamente pela adição de Pb ao solo. Atividades relacionadas com a ciclagem de nutrientes poderiam ser prejudicadas pela contaminação por MP, os quais têm alta permanência no solo, sendo de difícil remoção, o que pode acarretar diminuição na mineralização da matéria orgânica. A maior atividade enzimática observada no solo com propágulos de FMA reflete a importância do efeito da micorrizosfera na atividade da comunidade microbiana (Vázquez et al., 2000). Portanto, a micorrização da soja causou mudanças diretas no fornecimento de compostos orgânicos ao solo e, de forma quantitativa, na microbiota rizosférica, resultando em maior atividade da microbiota do solo.

Conclusões

1. O Pb altera negativamente o C da biomassa e a atividade da microbiota rizosférica, ocorrendo interação entre a presença de propágulos de FMA e o estádio de desenvolvimento da planta.

2. O Pb tem efeito negativo sobre o C da biomassa microbiana do solo com propágulos de FMA.

3. A atividade da fosfatase alcalina é um indicador adequado na avaliação do estresse causado pelo Pb no solo.

4. A micorrização da soja influencia de forma direta a microbiota rizosférica, resultando em maior atividade e biomassa.

Agradecimentos

À Capes, pela bolsa de mestrado outorgada à primeira autora; às técnicas de laboratório Rosana Gierts Gonçalves e Tereza Bueno Mangussi, pelo auxílio nas análises microbiológicas.

Recebido em 25 de junho de 2004 e aprovado em 23 de agosto de 2004

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  14 Fev 2005
• Data do Fascículo
  Dez 2004

Histórico

• Aceito
  23 Ago 2004
• Recebido
  25 Jul 2004