Aeração e adição de sais na produção de ácido indol acético por bactérias diazotróficas

Aeration and salt effects on indol acetic production by diazotrophic bacteria

MICROBIOLOGIA

Aeração e adição de sais na produção de ácido indol acético por bactérias diazotróficas

Aeration and salt effects on indol acetic production by diazotrophic bacteria

Tharwat El-Sayed El-Desouk Radwan^I; Zeinat Kamel Mohamed^I; Veronica Massena Reis^II

^IFaculdade de Ciências, Dep. de Botânica, CEP 63514 El-Fayoum, Egito. E-mail: [e-mail]

^IIEmbrapa Agrobiologia, BR 465, Km 47, Caixa Postal 74.505, CEP 23851-970 Seropédica, RJ, Brasil. E-mail: [e-mail]

RESUMO

Foi analisada a produção de compostos indólicos por Azospirillum brasilense Cd, A. lipoferum Br 17, Herbaspirillum seropedicae Z 67, H. rubrisubalbicans M4 e a estirpe 34 isolada de arroz, que não se enquadra em nenhuma das espécies de Herbaspirillum já descritas, em relação a diferentes condições de aeração e concentrações de sais. A maior aeração do meio propiciou aumento na produção de compostos indólicos pelas bactérias testadas. Foi verificado aumento desses compostos, em culturas estáticas, em meio sem nitrogênio no caso de Azospirillum, e na presença de N para as estirpes de Herbaspirillum. O aumento da concentração de sais no meio de cultivo inibiu a produção de compostos indólicos, embora tenha sido observado um pequeno aumento quando a concentração de CaCl₂ foi de 1 g L^-1. O efeito mais deletério da salinidade foi observado com a presença de NaHCO₃, seguido de NaCl e Na₂SO₄. Azospirillum produziu mais compostos indólicos em meio semi-sólido e Herbaspirillum em meio líquido, mas em menor nível.

Termos para indexação:Azospirillum, Herbaspirillum, auxina, ácido-3-indol acético, compostos indólicos.

ABSTRACT

The production of indolic compounds by Azospirillum brasilense Cd, A. lipoferum Br 17, Herbaspirillum seropedicae Z 67, H. rubrisubalbicans M4, and strain 34 isolated from rice, which does not fit into the described Herbaspirillum species, was measured under aeration ratio and salt concentrations. Aeration of the medium increased growth and production of indole compounds by these bacteria. Under static condition, the production was higher both in nitrogen-free medium for Azospirillum, and in amended N medium for the Herbaspirillum strains. Increasing salt concentration into the medium inhibited the production of indole compounds, although a small increase in production was observed, when CaCl₂ concentration was raised above 1 g L^-1. Deleterious effect of salinity was more pronounced in the presence of NaHCO₃, followed by NaCl and Na₂SO₄. Azospirillum produced more indolic compounds in semi-solid cultures, and Herbaspirillum in liquid medium, but at lower levels.

Index terms:Azospirillum, Herbaspirillum, auxin, indole-3-acetic acid, indole compounds.

Introdução

Entre as bactérias diazotróficas que não formam nódulos quando associadas às plantas, o gênero Azospirillum é, sem dúvida, o mais estudado. Desse gênero fazem parte: A. lipoferum e A. brasilense (Tarrand et al., 1978), A. amazonense (Magalhães et al., 1983), A. halopraeferans (Reinhold et al., 1987), A. irakense (Khammas et al., 1989), A. doebereinerae (Eckert et al., 2001) e A. largimobile, que é a única espécie desse gênero incapaz de fixar N₂ (Ben Dekhil et al., 1997). Já o gênero Herbaspirillum possui um número menor de espécies descritas: Herbaspirillum seropedicae (Baldani et al., 1986), H. rubrisubalbicans (Baldani et al., 1996), H. frisingense (Kirchhof et al., 2001) e H. lusitanum (Valverde et al., 2003). Todos esses microrganismos são capazes de promover o crescimento de plantas, por mecanismos ainda não completamente esclarecidos, mas associados ao aumento da massa radicular, nutrição nitrogenada ou aumento da eficiência de absorção de nutrientes no solo, entre outros (Bashan et al., 2004).

As bactérias diazotróficas pertencentes aos gêneros acima citados produzem fitormônios, substâncias que reconhecidamente podem promover o crescimento de plantas. Fitormônios como auxinas, citoquininas e giberelinas foram detectados no sobrenadante do cultivo de bactérias do gênero Azospirillum, especialmente A. brasilense (Crozier et al., 1988). A produção de ácido indol acético (AIA), GA₁ e GA₃, em cultivo de células de H. seropedicae, também foi detectada por Bastián et al. (1998).

Entre as auxinas, o ácido indol acético é o mais estudado e é o mais produzido pelas bactérias. Essa substância afeta a morfologia das raízes, aumentando o comprimento e o número de pêlos radiculares (Barbieri et al., 1986). Evidências sobre a ação dessa substância, no desenvolvimento radicular, foram obtidas pela inoculação de um mutante de Azospirillum deficiente na produção desse fito-hormônio (Dobbelaere et al., 1999). Atualmente, pelo menos três vias metabólicas já foram descritas para a produção de AIA em Azospirillum: duas dependentes de triptofano, denominadas indole-3-acetamida (IAM) e indole-3-piruvato (IpyA), e a terceira via independente de presença de triptofano (Dobbelaere et al., 1999; Lambrecht et al., 2000). É importante verificar se a produção de compostos indólicos pode ser afetada por condições de alta pressão de O₂ e de estresse salino, que são as condições normalmente encontradas em solos arenosos com acúmulo de sais, como os de áreas de cultivo agrícola no Egito, e em regiões do Nordeste brasileiro.

O objetivo deste trabalho foi investigar o efeito da aeração e da adição de sais, na produção de AIA, por estirpes de Azospirillum e Herbaspirillum, sob condições controladas.

Material e Métodos

As seguintes estirpes foram usadas neste estudo: Azospirillum brasilense Cd, A. lipoferum Br 17, Herbaspirillum seropedicae Z 67, H. rubrisubalbicans M4 e Herbaspirillum spp. estirpe 34 isolada de arroz. Esses isolados foram depositados na coleção de bactérias diazotróficas da Embrapa Agrobiologia, Seropédica, Rio de Janeiro, Brasil.

Todos os experimentos foram conduzidos em frascos do tipo Erlenmeyer de 125 mL, com 50 mL do meio NFb semi-sólido e líquido modificado. Descrito por Döbereiner (1995), o meio NFb foi modificado pela omissão do indicador azul de bromotimol e das vitaminas, e pela adição de 1 g L^-1 de NH₄Cl, para não haver interferências desses compostos na formação da reação colorimétrica.

Uma colônia de cada estirpe estudada foi inoculada em 50 mL de meio Dygs (Rodrigues Neto et al., 1986), por 48 horas, a 30ºC. Esse meio de multiplicação tem a seguinte composição (g L^-1): glucose, 2; peptona, l,5; extrato de levedura, 2; KH₂PO₄, 0,5; MgSO₄.7H₂O, 0,5; ácido glutâmico, l,5. O pH final foi ajustado para 6,8. Como inóculo dos testes foram usados 100 µL das células, lavadas 3 vezes em tampão 0,06 M de H₂PO₄ esterilizado (pH 6,8) por centrifugação, a 10.000 rpm, por 15 min a 4ºC e, finalmente, ressuspendidas em 30 mL do tampão. As culturas foram incubadas a 125 rpm, a 35ºC, para A. brasilense e A. lipoferum, e a 30ºC para as estirpes de Herbaspirillum spp., durante 48 horas. Nessas condições, não foi observada agregação das células, o que permitiu a quantificação do crescimento por densidade ótica (DO) a 492 nm, usando-se o espectrofotômetro Perkin Elmer II. Para as condições de fixação de nitrogênio foram utilizados vidros de 10 mL, com 5 mL de meio de cultivo NFb semi-sólido (1,75 g de ágar por litro) e triptofano. Na inoculação utilizou-se 100 µL de células lavadas, nas condições citadas acima, e os frascos foram incubados a 30ºC, por 5 dias. Os sais foram adicionados por filtração, em filtro Millipore de 0,2 µm, após autoclavagem do meio de cultivo.

Os compostos indólicos foram estimados no sobrenadante das culturas, após o período de incubação. As células foram centrifugadas a 10.000 g por 15 min, a 4ºC, tendo-se usado todo o conteúdo dos frascos. Como vários compostos indólicos, além do AIA, podem ser medidos pelo método colorimétrico, o termo "compostos indólicos" foi usado no texto referindo-se às auxinas desse grupo (Crozier et al., 1988). O método colorimétrico usado foi descrito por Gordon & Weber (1951) e modificado por Minamisawa et al. (1992). O método consiste da mistura de 1 mL do filtrado de bactéria (sobrenadante), com 2 mL do reagente FeCl₃-HClO₃ (0,01 M FeCl₃ em 35% de HClO₃), e a presença do composto indólico foi indicada pela produção de coloração rosa. A intensidade de produção de compostos indólicos foi medida por colorimetria, com o filtro de 530 nm, após 25 min de incubação, utilizando-se o espectrofotômetro Perkin Elmer II. A concentração dos compostos indólicos foi estimada previamente, usando-se a curva padrão obtida pela adição de quantidades conhecidas de uma solução de AIA (Sigma): 25, 50, 100, 150, 200, 300 µM de AIA. A quantidade de compostos indólicos produzidos foi expressa pelo valor obtido na curva de AIA (µM), e o crescimento das culturas foi avaliado através de densidade ótica a 492 nm.

A avaliação da atividade da nitrogenase foi realizada apenas em vidros de 10 mL, com 5 mL de meio NFb semi-sólido, sem adição de nitrogênio. Após a inoculação de 50 µL de células lavadas, conforme descrição anterior, os vidros foram tampados com algodão e incubados a 35ºC. Após cinco dias, as rolhas de algodão foram trocadas por rolhas de borracha, e 10% da fase gasosa foi trocada por acetileno, com uma seringa de 1 mL. Após 1 hora de incubação a 30ºC, a evolução do etileno produzido foi determinada, tendo-se injetado 0,5 mL da fase gasosa em cromatógrafo à gás (Perkin Elmer Auto System II) com uma coluna preenchida com Porapak N (2 m x 3,2 mm de diâmetro), a 110ºC, e detector à chama de hidrogênio.

Para avaliar o efeito da aeração, o meio de cultivo NFb foi preparado conforme descrito acima, sem a adição de NH₄Cl, mas tendo-se acrescentado 100 µg mL^-1 de L-triptofano (Sigma) esterilizado por filtração, em filtro Millipore de 0,2 µm, e adicionado após a autoclavagem. Cada estirpe estudada passou por inoculação, tendo-se usado células lavadas, e cada série de inoculante (estirpe) foi dividida em 4 tratamentos: um foi mantido estático e os outros foram agitados a 50, 125 e 200 rpm, respectivamente. As culturas foram mantidas a 30ºC por 48 horas. A concentração dos compostos indólicos foi medida no sobrenandante das culturas, obtido por centrifugação a 15.000 rpm, por 15 min a 4ºC, usando-se o método colorimétrico.

Para a avaliação do efeito de doses de sais foi utilizado o meio de cultivo NFb semi-sólido e líquido, com quatro diferentes sais, que foram adicionados após a filtração (Millipore 0,2 µm), nas seguintes concentrações (g L^-1): NaHCO₃ e NaCl, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 5, 10, 20 e 50; CaCl_2, 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 1, 5, 10 e 50 em meio líquido, e 0,01, 0,02, 0,05, 0,1, 0,5, 1, 2 e 5 em meio semi-sólido; Na₂SO_4, 0,1, 0,2, 0,5, 1, 5, 10, 20 e 50. As células lavadas foram usadas como inóculo, e as condições de incubação foram as mesmas citadas anteriormente. Os frascos "controle" receberam o mesmo volume de água destilada estéril ao invés do inóculo. A concentração de compostos indólicos foi estimada em 48 horas para meio líquido e, após cinco dias, para cultivo em meio semi-sólido, com três repetições por tratamento.

Todos os ensaios foram conduzidos em delineamento inteiramente ao acaso, com três repetições. Os experimentos foram submetidos à análise de variância, e as médias comparadas pelo tesde de DMS (diferença mínima significativa) a 1% de probabilidade. A análise estatística foi realizada pelo programa MSTATC.

Resultados e Discussão

As estirpes de Herbaspirillum produziram menos compostos indólicos em todas as condições avaliadas, quando comparadas com as estirpes de Azospirillum. A produção de compostos indólicos aumentou com a adição de N em todas as estirpes (Tabela 1). A aeração também influenciou a produção de compostos indólicos, tendo sido observado maior acúmulo nos tratamentos submetidos às maiores rotações: 125 e 200 rpm. A ausência de NH₄Cl provocou o aumento da multiplicação celular e da produção de compostos indólicos, em presença de triptofano, em todas as estirpes, principalmente no tratamento de maior agitação (200 rpm), tendo indicado um aumento de 3 vezes na produção de AIA (Tabela 1).

Resultados similares foram obtidos por Piccoli et al. (1999), ao avaliar a produção de giberelina por A. lipoferum estirpe USA 5b. A influência positiva de amônio e oxigênio na produção de AIA era esperada, por esses compostos estarem envolvidos no processo de produção de AIA e no processo de fixação de N₂. O oxigênio é requerido durante a conversão de triptofano (Trp) em AIA, via indole-3-acetamida (IAM), e uma molécula de amônio é liberada durante a conversão de Trp a AIA. Por outro lado, sob condições microaeróbicas, as células preferencialmente catalisam a conversão enzimática do ácido indol pirúvico (IPyA) a AIA (Dobbelaere et al., 1999).

A adição de 1 e 5 g L^-1 de CaCl₂ aumentou a produção de compostos indólicos nas estirpes de Herbaspirillum testadas (Tabela 2). As estirpes de Azospirillum, Cd e Br 17, produziram 2 vezes mais compostos indólicos do que as estirpes de Herbaspirillum. As concentrações mais elevadas, 10 e 50 g L^-1 desse sal, inibiram o crescimento. Estirpes de Azospirillum apresentaram dois picos de produção de AIA, um na concentração menor (0,01 g L^-1) e outro na concentração de 1 e 5 g L^-1. Esses dois picos (0,01 e 1 g L^-1) também foram observados nas condições de fixação de N₂. Estirpes de Herbaspirillum não mostraram esse comportamento, e a baixa concentração de compostos indólicos foi mantida, independentemente das doses de CaCl₂ usadas. A atividade de redução de acetileno de todas as estirpes foi inibida, parcialmente, pelas diferentes doses de CaCl₂ testadas, apesar de a maior concentração usada representar mais de 10 vezes o teor desse elemento, no meio de cultivo NFb. A multiplicação celular também foi inibida nas maiores concentrações de CaCl₂. Rao & Venkateswarlu (1985) observaram que a atividade da nitrogenase é mais sensível ao estresse salino que a multiplicação celular.

Na concentração de 0,05 g L^-1 de NaHCO₃ ocorreu maior produção de AIA, detectada nos meios de cultivo líquido e semi-sólido (Tabela 3). Em presença de doses maiores de NaHCO₃, foi observada diminuição da produção de auxina comparada ao controle. Os resultados obtidos indicaram, também, que em doses superiores a 0,05 g L^-1 deste sal, houve inibição da multiplicação celular e, conseqüentemente, da atividade de redução de acetileno. A produção de compostos indólicos foi maior no meio semi-sólido para Azospirillum, ao contrário do que ocorreu para as estirpes de Herbaspirillum, independentemente da concentração de NaHCO₃ utilizada. Bashan & Holguin (1997) descrevem que o mecanismo celular comum de adaptação ao estresse osmótico, em Azospirillum, é a cumulação de solutos orgânicos (osmólitos). Glicina betaina é acumulada por todas as estirpes, mas prolina e glutamato foram acumulados apenas em A.brasilense SHS6.

A produção de substâncias indólicas foi maior em todas as estirpes estudadas, em presença de 0,1 g L^-1 de Na₂SO₄ (Tabela 4). Doses superiores a 1 g L^-1 inibiram a produção, especialmente no cultivo semi-sólido. A multiplicação celular e a atividade de redução de acetileno foram inibidas pela adição de Na₂SO₄. Entretanto, as células foram menos sensíveis à presença do sal de Na₂SO₄ do que de NaHCO₃ (Tabelas 3 e 4).

A adição de NaCl ao meio de cultivo inibiu apenas a produção de auxina, nas estirpes de Azospirillum e Herbaspirillum seropedicae estirpe Z 67, em doses superiores a 5 g L^-1 (Tabela 5). Para Herbaspirillum rubrisubalbicans M4, e para a estirpe 34 proveniente de plantas de arroz, essa inibição só ocorreu no meio de cultivo semi-sólido. Tripathi & Mishra (1998) observaram que concentrações elevadas de NaCl inibiram o crescimento, atividade de redução de acetileno e produção de AIA em A. brasilense Cd. A concentração normal de NaCl, usada no meio de cultivo NFb (0,1 g L^-1), mostrou os melhores resultados, em todos os parâmetros avaliados. Hartmann et al. (1991) observaram que a osmotolerância ao NaCl declinava na seguinte ordem: Azospirillum halopraeferens, A. brasilense, A. lipoferum e A. amazonense. Os resultados de crescimento mostraram a mesma tendência para as estirpes de A. brasilense e A. lipoferum (Tabela 5).

Conclusões

1. O aumento da aeração, mediante a agitação do meio de cultivo, propicia maior produção de compostos indólicos, por bactérias diazotróficas, pertencentes aos gêneros Azospirillum e Herbaspirillum.

2. O aumento da concentração de sais no meio de cultivo inibe a produção de compostos indólicos, crescimento e atividade da nitrogenase, por bactérias diazotróficas pertencentes aos gêneros Azospirillum e Herbaspirillum.

3. O efeito deletério da salinidade é mais acentuado em presença de NaHCO₃, seguido por NaCl e Na₂SO₄.

4. Estirpes de Azospirillum produzem mais compostos indólicos do que estirpes de Herbaspirillum.

Agradecimentos

À Faculdade de Ciência do Cairo, Egito, pela bolsa de doutorado do primeiro autor; à Finep, pelo apoio ao projeto Pronex II número 76971051.00.

Recebido em 11 de maio de 2004 e aprovado em 29 de março de 2005

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  01 Dez 2005
• Data do Fascículo
  Out 2005

Histórico

• Aceito
  29 Mar 2005
• Recebido
  11 Maio 2004