Variabilidade de genótipos de milho quanto à composição de carotenoides nos grãos

Variability of maize genotypes for grain carotenoid composition

GENÉTICA

Variabilidade de genótipos de milho quanto à composição de carotenoides nos grãos

Variability of maize genotypes for grain carotenoid composition

Wilton Soares Cardoso^I; Maria Cristina Dias Paes^II; João Carlos Cardoso Galvão^II; Sara de Almeida Rios^II; Paulo Evaristo de Oliveira Guimarães^II; Robert Eugene Schaffert^II; Aluízio Borém^I

^IUniversidade Federal de Viçosa, Avenida P.H. Rolfs, s/nº, CEP 36571-000, Viçosa, MG. E-mail:[e-mail], [e-mail], [e-mail], [e-mail]

^IIEmbrapa Milho e Sorgo, Caixa Postal 151, CEP 35701-970, Sete Lagoas, MG. E-mail: [e-mail], [e-mail], [e-mail]

RESUMO

O objetivo deste trabalho foi caracterizar e avaliar a variabilidade quanto ao teor e perfil de carotenoides nos grãos de 134 genótipos de milho (Zea mays), com vistas à utilização em programas de biofortificação. Os materiais foram provenientes dos campos experimentais e do Banco Ativo de Germoplasma da Embrapa Milho e Sorgo, Sete Lagoas, MG. São cultivares e híbridos comerciais, linhagens-elite e outros acessos escolhidos com base na coloração amarelo-alaranjada do endosperma. A quantificação do teor de carotenoides totais, carotenos e xantofilas mono-hidroxilada e di-hidroxilada dos grãos foi realizada por método cromatográfico-espectrofotométrico. As médias encontradas nos grãos foram 22,34µ gg-1 de carotenoides totais, 2,55µ gg-1 de carotenos, 3,86µ gg-1 de xantofilas mono-hidroxiladas e 15,93µ gg-1 de xantofilas di-hidroxiladas. Os genótipos foram agrupados em 18 grupos pelo método de Tocher. O germoplasma da Embrapa possui potencial para ser usado em programas de desenvolvimento de linhagens de milho biofortificadas, quanto ao total de carotenoides pró-vitamina A.

Termos para indexação:Zea mays, biofortificação, carotenoides, melhoramento, vitamina A.

ABSTRACT

The objective of this work was to characterize 134 maize (Zea mays) genotypes, for carotenoids content and build a genetic profile to facilitate future breeding to increase grain nutritional value (biofortification). Seeds came from experimental fields and from the Banco Ativo de Germoplasma of Embrapa Milho e Sorgo, Sete Lagoas, MG, Brazil. The genotypes were co mmercial hybrids, varieties, and inbred lines developed by the Embrapa biofortification program and other accessions, chosen for their yellow-orange endosperm color. Total grain carotenoids, carotenes, xanthophylls (monohydroxylates and dihydroxylates) were determined by chromatographic-spectrophotometric methods. The detected averages were: 22.34µ gg-1 for total carotenoids, 2.55µ gg-1 for carotenes, 3.86µ gg-1 for monohydroxylated xanthophylls, and 15.93µ gg-1 for dihydroxylated xanthophylls. The genotypes variability was divided into 18 groups by the method of Tocher. The Embrapa germplasm has variability and potential for development of maize lines biofortified for total of provitamin A carotenoids.

Index terms:Zea mays, biofortification, carotenoid, breeding, vitamin A.

Introdução

A deficiência de vitamina A é a principal causa de cegueira no mundo. Atinge aproximadamente 21% das crianças, e o maior número de afetados vivem nos continentes asiático e africano (World Health Organization, 2002).

A biofortificação de alimentos básicos com substâncias que apresentam atividade pró-vitamina A é apontada como uma estratégia para a diminuição dessa deficiência em áreas onde o problema é endêmico. A biofortificação caracteriza-se pelo aumento no conteúdo de nutrientes nos alimentos, por meio de melhoramento genético convencional ou da engenharia genética (Pfeiffer & McClafferty, 2007).

O programa de biofortificação de milho tem focado o aumento do teor de carotenoides com atividade pró-vitamínica A, principalmente o betacaroteno, e o aumento dos teores de ferro e zinco, a fim de tornar disponível maior quantidade desses nutrientes na dieta (Welch, 2002).

Os carotenoides são uma família de mais de 600 compostos lipossolúveis encontrados nas plantas. São responsáveis pelas cores das folhas e dos frutos (Britton etal., 2004; Ambrósio etal., 2006). Cerca de 50 carotenoides possuem atividade pró-vitamina A. O betacaroteno é o que apresenta maior atividade pró-vitamínica. Alfacaroteno, betacriptoxantina e zeinoxantina também apresentam atividade pró-vitamínica (Rodriguez-Amaya, 2001).

O grão de milho, apesar de possuir menor concentração de carotenoides quando comparado a outros alimentos, é considerado uma espécie carotenogênica, ou seja, fonte de carotenoides (Rodriguez-Amaya, 2001). Os principais carotenoides encontrados nos amiloplastos do endosperma do grão de milho são classificados como xantofilas (luteína, betacriptoxantina e zeaxantina) e carotenos (betacaroteno, alfacaroteno e betazeacaroteno) (Janick-Buckner etal., 1999). As xantofilas, luteína e zeaxantina encontram-se em maior concentração no grão (90%), enquanto o betacaroteno perfaz a menor concentração (5%) (Cabuela, 1971). Análises de nutrientes no milho mostram diferenças significativas na concentração de carotenoides totais (que varia de 0a 68µ gg-1) e de carotenos (que varia de 0,0a 4,1µ gg-1) (Blessin etal., 1963; Quackenbush etal., 1963; Berardo etal., 2004).

A variabilidade para teor e perfil de carotenoides é observada em cultivares e linhagens de milho, o que indica a possibilidade de melhoramento para aumento do teor de carotenos (Janick-Buckner etal., 1999).

O objetivo deste trabalho foi caracterizar e avaliar a variabilidade quanto ao teor e perfil de carotenoides de 134 genótipos de milho, com vistas à utilização em programa de biofortificação.

Material e Métodos

Foram selecionados 134 genótipos de milho, com base na coloração amarelo-alaranjada do endosperma, constituídos por 99 linhagens geradas para o programa de biofortificação: 540736, 540754, 540755, 540757, 570759, 540764, 540807, 540811, 540815, 540817, 540819, 540847, 540886, 540890, 540938, 540972, 540985, 540987, 540992, 540998, 541018, 541031, 541032, 541034, 541099, 541157, 541311, 541332, 541335, 540685-1, 540700-1, 540707-1, 540721-1, 540723-1, 540727-1, 540740-1, 540760-1, 540763-1, 540780-1, 540800-1, 540808-1, 540814-1, 540818-2, 540826-1, 540838-1, 540843-1, 540845-2, 540848-1, 540874-2, 540878-1, 540880-2, 540893-2, 540899-2, 540903-2, 540941-2, 540942-2, 540948-2, 540962-1, 540986-1, 540995-2, 541016-2, 541028-1, 541034-2, 541051-1, 541052-1, 541055-1, 541057-1, 541069-2, 541070-2, 541072-2, 541093-1, 541112-1, 541116-1, 541117-2, 541119-2, 541120-1, 541133-1, 54114-1, 541228-1, 541233-2, 541234-1, 541249-2, 541270-2, 541272-1, 541274-1, 541275-1, 541276-1, 541278-1, 541307-1, 541312-1, 541316-1, 541323-1, 541325-1, 541330-2, 541335-1, 541337-1, 541338-1, 541339-1, 541343-2; 24 acessos pertencentes à coleção núcleo do banco ativo de germoplasma (BAG) da Embrapa Milho e Sorgo: Amarelo de PE A2, Azteca IPA, BA 130, BA I Cateto (Ribeirão Preto) 4496, BR 400 Superdoce, Cateto Colômbia, Cateto São Simão, Cateto Sete Lagoas, CMS 03 Amarilo Cristalino, CMS Amarillo Del Bajio, CMS 01 Mezcla Amarilla, Composto Racial Dent. AmareloI, GIN I Cateto Nortista, Maya XV, MG II Cateto, PA 105, Pira 006, Piranao UF 1, Pirapoca Amarelo, RS 572, Santa Inês, SC 014, SP 009, WP 2 Amarelo Dent; dois híbridos comerciais: BRS 1001, BRS 2020; e nove cultivares comerciais provenientes do ensaio nacional de 2006: BR 473 cIII, BR São Francisco, BRS Caatingueiro, CMS 101, CMS 102, CMS 104, Fundacep 35, Missões e UFVM 100.

Os grãos de cada genótipo, com exceção dos acessos do BAG de milho, foram obtidos na safra 2005/2006. O plantio de cada acesso foi realizado nos campos experimentais da Embrapa Milho e Sorgo, localizada a 12 km de Sete Lagoas, MG (19º28'S e 44º15'W, e altitude de 732 m). Os plantios foram realizados em áreas isoladas para proteção contra grãos de pólen provenientes de outros acessos. O manejo da cultura foi realizado conforme recomendações técnicas para a região (Embrapa, 1996).

Os grãos dos acessos foram obtidos diretamente no BAG de milho da Embrapa Milho e Sorgo, armazenados em câmara. Foi coletada uma amostra representativa da totalidade dos grãos gerados por cada genótipo. As amostras de grãos foram previamente identificadas, moídas em micromoinho tipo ciclone modelo MA 020 (Marconi, Piracicaba, SP), acondicionadas em frascos de vidro com tampa, envoltos em papel alumínio, e armazenadas a -20ºC no laboratório de qualidade de grãos e forragens da Embrapa Milho e Sorgo, onde foram realizadas as análises químicas. As amostras foram protegidas da exposição à luz, oxigênio e choque térmico, tanto antes quanto após a moagem, a fim de se evitar a degradação dos compostos objetos de estudo.

A quantificação do teor de carotenoides totais, carotenos, xantofilas mono-hidroxiladas e xantofilas di-hidroxiladas foi realizada por método cromatográfico-espectrofotométrico, seguindo o protocolo descrito por Rodriguez-Amaya & Kimura (2004). As análises foram conduzidas em duplicata. As leituras espectrofotométricas foram realizadas no espectrofotômetro Cary 50 Conc UV-Visible (Varian, Austrália).

Os resultados das análises químicas foram avaliados por análise multivariada, pelas técnicas de agrupamento e método de otimização de Tocher, utilizando como medida de dissimilaridade a distância Euclidiana Média.

Para compor a matriz de distância ou dissimilaridade, utilizando-se a distância euclidiana média, foram utilizados os dados padronizados de carotenoides totais, carotenos, xantofilas mono-hidroxiladas e xantofilas di-hidroxiladas.

Os resultados também foram analisados por meio de componentes principais, apresentados em dispersão gráfica, seguindo a formação de grupos identificados pelo agrupamento de Tocher. As análises estatísticas foram realizadas utilizando o programa GENES (Cruz, 2005).

Para estimativa do conteúdo de vitamina A, foi considerado que toda fração caroteno encontrada nos genótipos analisados referia-se a betacaroteno e às xantofilas mono-hidroxiladas como sendo a betacriptoxantina. Assim, cada micrograma de betacaroteno foi convertido em 1/12 de atividade equivalente de retinol (RAE) e cada micrograma de betacriptoxantina foi convertido em 1/24 de RAE (Institute of Medicine, 2001).

Resultados e Discussão

Houve variação no conteúdo de carotenoides totais (9,46 a 42,84µ gg-1), carotenos (alfa e betacarotenos) (0,88 a 4,93µ gg-1), xantofila mono-hidroxilada (betacriptoxantina) (1,13 a 7,22µ gg-1) e xantofilas di-hidroxiladas (luteína e zeaxantina) (5,55 a 34,11µ gg-1) (Tabela 1). As médias foram 22,34µ gg-1 de carotenoides totais, 2,55µ gg-1 de carotenos, 3,86µ gg-1 de xantofilas mono-hidroxiladas e 15,93µ gg-1 de xantofilas di-hidroxiladas. Os valores foram expressos em base úmida.

 

A linhagem 541332 e a linhagem 541312-1 apresentaram os maiores teores de carotenoides totais, 42,84 e 42,51µ gg-1, respectivamente, valores esses elevados quando comparados a os valores médios das cultivares brasileiras comerciais, como Assum Preto (11,17µ gg-1) e BR473 (9,17µ gg-1), analisadas por Kimura etal. (2007), e BRS 1001 (30,95µ gg-1), analisada neste trabalho.

Foram observadas médias superiores para os genótipos BRS 1001, com a concentração de carotenos de 4,93µ gg-1, bem como para a linhagem 540755, com 7,22µ gg-1 de xantofilas mono-hidroxiladas e a linhagem 541312-1, com concentração de 34,11µ gg-1 de xantofilas di-hidroxiladas.

Em trabalhos realizados para seleção de germoplasmas para biofortificação, o intervalo encontrado para carotenoides totais nos grãos de milho dos genótipos brasileiros foi superior àqueles reportados por Kurilich & Juvik (1999) para germoplasma norte-americano (0,15 a 33,11µ gg-1), e semelhante a os reportados por Hulshof etal. (2007), que na avaliação de materiais para biofortificação encontraram de 9,90 a 39,98µ gg-1 de carotenoides totais em 22 linhagens, em base seca. Entretanto, Weber (1987) encontrou de 16 a 77µ gg-1 (em base seca) de carotenoides totais nas linhagens que analisou. Estas informações indicam possível ganho de carotenoides em grãos de milho por meio do melhoramento genético de plantas.

As cultivares comerciais e os acessos avaliados apresentaram teores de carotenoides totais inferiores a os das linhagens-elite do programa de melhoramento de milho da Embrapa Milho e Sorgo, cuja seleção é realizada com base em características agronômicas. A amplitude dos primeiros grupos foi semelhante à reportada por Kurilich & Juvik (1999).

Considerando que os maiores teores de carotenoides totais foram encontrados nos materiais pertencentes ao grupo das linhagens-elite, é importante o uso dessas linhagens, aliado à seleção pela intensidade de cor dos grãos (Kurilich & Juvik, 1999), para a seleção de materiais destinados à geração de híbridos em programa de biofortificação do milho. Quanto à seleção pela intensidade de cor dos grãos, no entanto, segundo Pfeiffer & McClafferty (2007) a coloração visual do grão de milho é dominada por carotenoides que não possuem atividade pró-vitamina A, luteína e zeaxantina (xantofilas di-hidroxiladas). Uma seleção somente por cor pode ser aplicada para separar grãos brancos ou levemente amarelos dos grãos de cores amarelo-intenso ou laranja.

O conteúdo médio de caroteno foi de 2,55µ gg-1, e a proporção média de carotenos, em relação ao total de carotenoides nos genótipos estudados, foi de 11%. Os maiores percentuais não foram observados nas linhagens e sim no híbrido comercial BRS 1001 e no acesso BR 400 superdoce. Os resultados médios para carotenos estão abaixo dos relatados em outros trabalhos. Hulshof etal. (2007) encontraram valores de 0,85 a 12,75µ gg-1 (em base seca) para total de carotenos, e Kurilich & Juvik (1999) encontraram valores de até 7,64µ gg-1 para betacaroteno, em base seca. Embora haja diferença entre os métodos empregados e as substâncias quantificadas, a fração carotenos é constituída basicamente de betacaroteno, o que permite a comparação dos resultados desses estudos.

A fração de xantofila mono-hidroxilada (betacriptoxantina), que também possui atividade pró-vitamina A, apresentou média de 3,86µ gg-1 (17,89% de proporção média). Altos valores de xantofila mono-hidroxilada são desejáveis para melhorar a quantidade de vitamina A no milho (Pfeiffer & McClafferty, 2007). O melhor resultado para conteúdo de carotenoides pró-vitamina A foi da linhagem 540727-1, com 11,30µ gg-1 (carotenos mais xantofila mono-hidroxilada), em base úmida, muito próximo ao resultado obtido por Hulshof etal. (2007), de 14,77µ gg-1, em base seca, e superior ao valor de 8,90µ gg-1, em base seca, obtido por Kurilich & Juvik (1999). De acordo com esses resultados, pode-se considerar que o germoplasma de milho da Embrapa possui potencial para conteúdo de carotenoides pró-vitamina A.

Na estimativa do conteúdo de vitamina A, foram escolhidos os materiais com as dez maiores e as dez menores RAE em 100g do material (Tabela 2).

Os genótipos de maior teor de vitamina A apresentaram uma média de RAE de 58,3 por 100g, valor quase cinco vezes maior que o de outros genótipos, o que evidencia grande variabilidade para essa característica. As linhagens constituíram a maioria dos genótipos com alto teor de vitamina A, o que demonstra ganho para essa característica obtido no Programa de Biofortificação da Embrapa. Apenas o híbrido BRS 1001 e o acesso BR 400 apresentaram também alto valor de RAE.

Entre os genótipos com baixa RAE, destacam-se sete cultivares comerciais, o que confirma a necessidade de liberação comercial de novos materiais pelos programas de melhoramento.

O Institute of Medicine (2001) preconiza uma ingestão diária de vitamina A equivalente a 900 RAE por adultos do sexo masculino com idade entre 19 e 50anos, e a 400 RAE por crianças na faixa etária de 4 a 8anos. Para atingir esses valores, é necessário o consumo, respectivamente, de 1.385g e 615g de farinha de milho integral da linhagem 540727-1, que teve o maior valor de RAE (65 RAE por 100g de farinha).

As correlações de Pearson entre as frações de carotenoides analisadas fazem sentido biológico, pois a via de biossíntese de carotenoides dos compostos analisados está na mesma rota metabólica (Dellapenna & Pogson, 2006; Quinlan etal., 2007). Houve forte correlação das frações carotenos, xantofilas mono-hidroxiladas e xantofilas di-hidroxiladas com os carotenoides totais (Tabela 3). Essa correlação indica que existe considerável variação alélica entre os genes que controlam a biossíntese destes compostos. Isto sugere que os níveis das frações carotenoides podem ser simultaneamente aumentados, em relação a os carotenoides totais (Kurilich & Juvik, 1999).

A matriz de distância euclidiana média foi utilizada para o agrupamento dos genótipos pelo método de Tocher. Houve a formação de 18 grupos, sendo o maior deles com 55 componentes, e nove grupos com apenas um genótipo, o que indica variabilidade para essa característica no germoplasma estudado, embora haja muitos genótipos semelhantes para a composição de carotenoides no grão de milho.

Os grupos gerados pelo método de Tocher facilitam a seleção de material divergente para compor o melhoramento por meio da geração de híbridos, principalmente as linhagens-elite, uma vez que permitem a seleção de genótipos pertencentes a grupos heteróticos distintos a serem indicados para cruzamento. A combinação complementar do perfil de carotenoides, através de hibridização, aumenta significativamente o conteúdo desses nutrientes (Egesel etal., 2003).

Em um programa de melhoramento é importante a escolha de genótipos promissores, o que permite obter híbridos com maior produção e também possibilita a formação de boas populações para a extração de linhagens. No agrupamento Tocher (Tabela 4), podem-se selecionar genótipos promissores para geração de híbridos, como o grupo 3 que poderia ser cruzado com o genótipo do grupo 16.

O método de componentes principais (Figura 1), também foi utilizado para avaliar a dispersão do germoplasma estudado. No cálculo dos coeficientes de ponderação (autovetores) associados às características avaliadas, determinados pelo programa GENES (Cruz, 2005), a ordem das variáveis de maior peso foi: carotenoides totais, carotenos, xantofilas mono-hidroxiladas e xantofilas di-hidroxiladas. Os dois primeiros componentes principais explicaram cerca de 93% da variação total.

Ainda na Figura 1, pode-se verificar a dispersão dos genótipos. As cores representam os grupos formados pelo método de agrupamento de Tocher. A dispersão dos genótipos permite concluir que o agrupamento Tocher foi bem estabelecido para alguns materiais, visto que eles estão visualmente separados dos demais, a exemplo dos grupos verde e amarelo. Outros genótipos encontram-se misturados a outros grupos, não sendo possível fazer uma distinção pela visualização no gráfico.

A avaliação da divergência genética com auxílio de análises multivariada pode ser uma ferramenta adicional na escolha dos genitores, para a obtenção das melhores combinações híbridas (Melo etal., 2001), não somente para aumento de produção, mas também para o incremento de componentes secundários, como os carotenoides.

Conclusões

1. Existe variabilidade para perfil e teor de carotenoides nos grãos do germoplasma de milho estudado, o que evidencia seu potencial para o melhoramento genético para a biofortificação.

2. O germoplasma de milho da Embrapa Milho e Sorgo possui potencial para o desenvolvimento de linhagens biofortificadas, principalmente quanto ao total de carotenoides pró-vitamina A.

Agradecimentos

Ao Challenge Program Generation - Harvest Plus, e à Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais, pelo apoio financeiro.

Recebido em 30 de setembro de 2008 e aprovado em 29 de janeiro de 2009

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Datas de Publicação

• Publicação nesta coleção
  09 Abr 2009
• Data do Fascículo
  Fev 2009

Histórico

• Aceito
  29 Jan 2009
• Recebido
  30 Set 2008